Avaliação da formação de adutos e supressão de sinal de AAL

Além das características inerentes aos aminoácidos, outros fatores podem interferir em sua ionização por ESI por efeitos da matriz como, por exemplo, formação de adutos. Os cátions mais comuns que formam adutos são sódio, potássio e amônio67_{. Em alguns casos, os adutos podem apresentar sinais mais} intensos que o próprio íon protonado (ou desprotonado) e apresentar melhores condições para realizar uma análise quantitativa68-70_{. Apesar de adutos possuírem} menor reprodutibilidade e serem mais complexos para a interpretação dos resultados36_{, avaliar a formação destas espécies com aminoácidos é interessante,} uma vez que todos os cátions que formam adutos mais comumente estão presentes na matriz nas quais os aminoácidos são rotineiramente analisados em laboratórios ao redor do mundo, a matriz de sangue.

Foram realizados experimentos em solução ácida por ESI para avaliar a supressão iônica dos aminoácidos livres na presença de diferentes cátions (Li+_{, K}+_, Na+_{, NH4}+_{). Com este experimento foi possível avaliar quais são os cátions que} promovem maior supressão em aminoácidos.

Quando análises por ESI são realizadas com altas concentrações de analitos (concentrações maiores ou iguais a 10 M), a saturação do sinal pode ser observada. Para soluções complexas contendo múltiplos analitos e/ou aditivos, é comum observar a supressão de sinal do analito de interesse na faixa de concentração. Essa supressão pode ser explicada com base na competição por espaço na superfície das gotas e competição por total de carga presente nos analitos67_{. Esse comportamento demonstra como o processo de formação de cargas} em ESI com a grande quantidade de espécies com carga em solução pode comprometer a sensibilidade na detecção dos analitos.

Outra explicação para diminuição de resposta de aminoácidos com a presença de cátions é a formação de adutos. O ESI possibilita a formação de vários tipos de íons dependendo do tipo de composto, solvente, tipo de matriz em que a molécula está inserida e os parâmetros inerentes ao ESI69_{. É difícil estabelecer a relevância}

de cada fator que causa a formação de aduto já que muitos deles são interdependentes35_{. No ESI, a análise de carga única ou de múltiplas cargas é} realizada em modo positivo de ionização e as informações são utilizadas tanto em modo quantitativo como qualitativo. Em adição a estes sinais, é possível também encontrarmos adutos com cátions e ânions – dependendo do modo de ionização utilizado68_{. No caso de adutos de sódio, a formação segue a Equação 4 descrita} abaixo.

Equação 4

O estudo da formação de adutos permite, além do estudo de uma alternativa para eleição do íon a ser monitorado, também uma explicação da supressão iônica do íon de interesse. Na análise dos dados obtidos, Figura 12, que relaciona adutos e a forma protonada entre si, o cátion que forneceu o maior aumento de abundância média foi o íon amônio (adutos NH4OH). A verificação dos aminoácidos mais inclinados a formarem adutos com cátions (Pro, Asp, Val, Hyp+Iso+Leu), aparenta uma não correlação entre o tipo da cadeia lateral e estas espécies.

Figura 12. Formação de adutos de aminoácidos na presença de quatro diferentes cátions em MeOH com 0,1% (v/v) de ácido fórmico.

Com o objetivo de verificar se a formação de adutos é a principal responsável pela diminuição das respostas dos AALs, os sinais dos aminoácidos foram adquiridos em Q1 na presença dos diferentes cátions. A Figura 13 mostra os

resultados experimentais obtidos. Destaca-se a supressão ocasionada pelo cátion Li+ _{em todos os AAL, com exceção da Cys. Apesar deste cátion não ser o principal} formador de aduto conforme Figura 12, ele foi responsável pela mais abrangente supressão iônica. Em estudo realizado por Haddrell et al. foram analisadas gotas de uma solução contendo 1,7 mM de NaCl e no interior uma tinta fluorescente. As gotas foram analisadas por MALDI-TOF e por microscopia. Os resultados demonstraram que o perfil da gota seca de ESI possui duas fases separadas. Com base nestes resultados, eles concluíram que a diminuição na resposta do ESI com altas concentrações de sais ocorre devido (a) ao particionamento do analito da superfície da gota para o interior eletricamente neutro da gota e (b) diminuição da eficiência na secagem da gota como consequência da camada de sal na superfície61_{. Estes são} os dois principais mecanismos que podem explicar o comportamento encontrado para o efeito causado para presença dos cátions em ESI, além da formação dos adutos. Entretanto, ressalta-se que a formação de adutos não é o único efeito que promove a diminuição das respostas dos AAL.

Figura 13. Supressão iônica dos aminoácidos em meio ácido. As barras representam a média de três medidas realizadas no mesmo dia. O menor cátion apresentou maior efeito de supressão apesar para os AALs. As barras representam o intervalo de confiança de 3 medidas realizadas. Para estimativa do intervalo de confiança indicado pelas barras considerou-se a ausência de erros sistemáticos e

que s não é uma boa aproximação de  nível de confiança aplicado foi de 95% com valor de t igual a 4,359_.

Este estudo demonstrou uma supressão iônica média para todos os AALs do Li+ _{foi de 93%, para o Na}+ _{de 88%, para o K}+ _{de 60% e o NH4}+ _{de 49%.}

1.5.3. Planejamento experimental para otimização de condições de Eletrospray Uma importante estratégia para o conhecimento das variáveis fundamentais em um experimento qualquer, além do entendimento das inter-relações entre tais variáveis e suas otimizações, é o planejamento de experimentos fatorial 2n_{. Esse} planejamento se faz selecionando os parâmetros que se desejam variar e com possibilidade de influência nas respostas. Monta-se, então, uma tabela de 2n condições a serem testadas, sendo n = número de parâmetros. Assim, no caso de 4 parâmetros a serem variados n=4, 24_{=16 experimentos, pois são 4 parâmetros} variando entre dois valores: mínimo (ou baixo) e máximo (ou alto). Além disso, podem ser adicionados experimentos do ponto central, ou seja, valores entre o mínimo e o máximo podem ser utilizados para tornar o modelo mais confiável. Utilizando essa ferramenta estatística é possível, assim, visualizar alterações nas respostas dos dados frente a variações nesses parâmetros de forma a gerar relações parâmetro/resposta71_.

Em muitas situações, a relação completa de todas as variáveis que afetam significativamente a resposta não são conhecidas. Este é o caso de otimização de um método por ESI-MS para análise de AALs.

Em muitas situações, a relação completa de todas as variáveis que afetam significativamente a resposta não são conhecidas. Este é o caso de otimização de um método por ESI-MS para análise de aminoácidos. Optou-se por realizar um planejamento fracionário inicialmente, onde foram estudados um maior número de variáveis, no caso 9, sem aumentar o número de ensaios. Para a otimização da fonte optou-se em iniciar o experimento avaliando os contrastes em um planejamento fatorial fracionado e, uma vez verificado os efeitos significativos, utilizá-los para um planejamento completo para os aminoácidos com maior dificuldade de ionização (Cys, Cys2, Gly e Ser). Há necessidade de realizar o planejamento fatorial completo porque no fracionado o efeito principal confunde-se

com interações de efeitos de ordem mais alta. O valor do contraste é na verdade uma estimativa da soma dos efeitos71_.

Os nove efeitos escolhidos para serem avaliados são divididos em parâmetros instrumentais da fonte (GS1, GS2, Temp, DP, CUR, IS) e condições de análise no solvente (faixa de variação ácida do pH, solvente utilizado, presença de cátion Na+_). A voltagem de capilar (IS) foi avaliada na faixa de 2500 a 3500 V, conforme métodos já descritos em literatura para análise de AAL. O curtain gas ou gás de cortina (CUR) corresponde a um gás (N2) que entra em sentido contrário a entrada dos íons, no intuito de evitar que interferentes entrem no espectrômetro de massas, uma vez que a entrada destes na região denominada Q0 do instrumento pode causar perda de sensibilidade e aumentar o ruído dos sinais obtidos. O parâmetro GS2 auxilia na evaporação do solvente, ajudando no aumento de ionização da amostra. O ajuste incorreto deste parâmetro pode causar perda de sensibilidade, além de produzir sinais instáveis. A DP é um parâmetro que auxilia a reduzir a formação de clusters do analito, entretanto, valores muito altos da DP para compostos de baixa massa molecular podem ocasionar a fragmentação dos íons e diminuir a sensibilidade na detecção. Avaliar a temperatura em um planejamento experimental com ESI é importante, pois além da temperatura se relacionar diretamente com a eficiência da secagem das gotas na técnica, os pontos de fusão dos AALs (em média 250°C) são próximos aos aplicados na fonte e podem influenciar na degradação dos íons antes de sua entrada no analisador. A representação dos fatores da fonte ESI no modelo de instrumento utilizado segue na Figura 14. A faixa de pH foi definida como ácida (2 a 6) uma vez que o experimento realizado no item 1.3.3 demonstrou melhor resposta para AAL com adição de ácido fórmico.

Figura 14. Esquema de parâmetros da fonte de ESI analisados durante o planejamento experimental fracionado. Turbo V Source é a denominação da fonte de ESI utilizada no instrumento da Sciex modelo 5500.

A visualização dos resultados do planejamento fatorial pode ser feita através de gráficos seminormais (Half Normal Plot), em que temos uma função de probabilidade normal em função das grandezas absolutas dos efeitos. Este gráfico permite discriminar os efeitos estatisticamente significativos dos outros efeitos cujos valores são provocados por erro experimental. Assim, os parâmetros que têm pouca influência sobre a resposta (ou seja, tem efeito sobre elas próximo de zero) se agrupam numa reta passando pela origem e aqueles que têm efeitos importante sobre as respostas são destacados fora desta reta e, assim, identificados71_{. Quanto} mais distante dessa linha, maior a importância de um parâmetro. O heat map representado na Figura 15 é o resultado da análise de gráficos Semi Normais do planejamento fatorial fracionado 29-4_.

Figura 15. Heat Map com representação dos parâmetros de planejamento fatorial 29- 4_.

Na Figura 15, os AALs Gly, Ser, Cys e Cys2 estão destacados porque são os que possuem pior ionização em meio ácido de MeOH: H2O e os parâmetros que foram significativos para eles através de análise de gráfico seminormal (GS1, IS, DP, CUR, Solvente e NaCl) foram utilizados para a construção de um planejamento completo 26_{. Os pontos verdes representam os contrastes que não foram} significativos, as células coloridas de azul foram significativas com aumento resposta e as células coloridas de amarelo representam contrastes significativos com diminuição da resposta.

Após o refinamento dos fatores significativos para a otimização da fonte (GS1, IS, DP, CUR, Solvente e NaCl), os outros parâmetros (GS2, temperatura, pH) foram

fixados no seu ponto central do planejamento fracionado para a construção de um planejamento completo 26_.

A Figura 16 demonstra um gráfico normal para a Gly e as condições otimizadas para o método final. O gráfico demonstra que os parâmetros DP, ACN, CUR e NaCl, uma vez aumentados diminuem a resposta da Gly. Por outro lado, quando o IS é aumentado, o valor da Gly é favorecido. Outra questão interessante no estudo realizado são as interações. As interações BD (IS x CUR), BC (IS x DP) e CF (DP x NaCl) têm uma interação positiva. Isso significa dizer que o aumento de cada parâmetro em conjunto tem uma contribuição positiva para a resposta.

Figura 16. Gráfico Normal de planejamento fatorial completo 26 _{para o AAL Gly. Os} efeitos de NaCl, DP e CUR foram significativos e diminuíram as respostas da Gly, enquanto que IS foi significativo e promoveu melhores resultados para o AAL.

Os valores de temperatura, GS2 e pH foram definidas no planejamento fatorial fracionado e os outros parâmetros definidos em planejamento completo de acordo com os quatro AAL que pior ionizam na fase móvel otimizada. O método otimizado considera a presença de sal (cerca de 1,5 mmol L-1_{) nas matrizes onde} são analisados AAL.

As condições para análise no ESI-MS para os próximos experimentos foram definidas de acordo com o planejamento experimental 26 _{com os resultados obtidos} para Gly, Ser, Cys e Cys2. Os valores da Figura 16 foram definidos de maneira

absoluta observando os efeitos em cada um dos quatro AAL através dos gráficos normais do experimento fracionado completo.

Além das considerações sobre a otimização da fonte, foram verificadas as similaridades nos comportamentos de ionização dos aminoácidos com a variação das 32 diferentes condições no experimento fracionado. O software Desig Expert® utiliza o cálculo de coeficiente de correlação conforme Equação 5 para expressar um índice de similaridade. 𝑟(𝑥, 𝑦) = 1 𝑁−1∑ ( 𝑥𝑖−𝑥 𝑆𝑥 ) ( 𝑦𝑖−𝑦 𝑠𝑦 ) Equação 5 Onde:

(xi, yi) = valores das observações individuais para o elemento i (x, y) = médias amostrais

(sx, sy) = desvios padrão amostrais N = Número de elementos na amostra

Os valores apresentados na Tabela 5 variam de 1 (mais semelhante entre si) a -1 (menos semelhante). Eles são números adimensionais, pois estão divididos pelos desvios padrões de cada medida. Quando o cálculo (xi-x) for negativo e (yi-y) for positivo, a multiplicação entre os membros será negativa e haverá uma contribuição para diminuir o valor total do coeficiente de correlação. Essa inversão dos sinais das respostas entre x e y indica um comportamento diferente dos AAL em ESI.

Os valores que foram obtidos pelas três interferências isobáricas de AAL (Ile/Leu/Hyp; Orn/Asn; Gln/Lys) não foram incluídos no estudo porque não é possível inferir a contribuição no sinal analítico que cada AAL possui para dar similaridade ou não a outro AAL de comparação.

Tabela 5. Similaridade de comportamento de ionização de aminoácidos em diferentes condições de fontes em planejamento experimental 29-4_{. Os valores} assinalados em verde são aqueles com maior similaridade na ionização em ESI modo (+) entre aminoácidos.

A maior similaridade da Phe em fonte de ESI em condições estudadas foi com a Tyr, com coeficiente de 0,97. Esse coeficiente de correlação, com nível de confiança de 95%, demonstra que entre os 33 experimentos realizados no experimento fracionado estes dois aminoácidos tiverem o comportamento mais semelhante. A Figura 17 demonstra através de uma regressão linear que as respostas entre Phe e Tyr possuem um R2_{= 0,94, justificando o maior coeficiente de}

Gly Ala Ser Pro Val Thr Cys Asp Glu Gly 1 0,09 0,1 0,77 0,44 0,25 0,48 0,69 0,18 Ala 0,09 1 0,12 0,05 0,1 0,08 0,1 0,07 0,06 Ser 0,1 0,12 1 -0,11 -0,04 0,23 0,35 0,12 0,01 Pro 0,77 0,05 -0,11 1 0,69 0,55 0,62 0,76 0,46 Val 0,44 0,1 -0,04 0,69 1 0,84 0,73 0,54 0,94 Thr 0,25 0,08 0,23 0,55 0,84 1 0,85 0,34 0,89 Cys 0,48 0,1 0,35 0,62 0,73 0,85 1 0,56 0,71 Asp 0,69 0,07 0,12 0,76 0,54 0,34 0,56 1 0,31 Glu 0,18 0,06 0,01 0,46 0,94 0,89 0,71 0,31 1 Met 0,92 0,12 0,14 0,89 0,62 0,48 0,64 0,75 0,38 His 0,61 0,17 0,55 0,55 0,33 0,33 0,58 0,66 0,18 Phe 0,83 0,07 -0,04 0,91 0,63 0,43 0,57 0,83 0,4 Arg 0,44 0,02 -0,04 0,58 0,39 0,26 0,35 0,82 0,24 Cit 0,84 0,13 0,13 0,77 0,57 0,4 0,51 0,78 0,35 Tyr 0,78 0,09 0,06 0,86 0,69 0,55 0,68 0,81 0,51 Trp 0,61 0,1 0,13 0,72 0,65 0,61 0,68 0,68 0,56 Cys2 -0,14 0,43 0,32 -0,25 -0,13 -0,08 -0,03 -0,14 -0,1

Met His Phe Arg Cit Tyr Trp Cys2

Gly 0,92 0,61 0,83 0,44 0,84 0,78 0,61 -0,14 Ala 0,12 0,17 0,07 0,02 0,13 0,09 0,1 0,43 Ser 0,14 0,55 -0,04 -0,04 0,13 0,06 0,13 0,32 Pro 0,89 0,55 0,91 0,58 0,77 0,86 0,72 -0,25 Val 0,62 0,33 0,63 0,39 0,57 0,69 0,65 -0,13 Thr 0,48 0,33 0,43 0,26 0,4 0,55 0,61 -0,08 Cys 0,64 0,58 0,57 0,35 0,51 0,68 0,68 -0,03 Asp 0,75 0,66 0,83 0,82 0,78 0,81 0,68 -0,14 Glu 0,38 0,18 0,4 0,24 0,35 0,51 0,56 -0,1 Met 1 0,71 0,9 0,57 0,85 0,89 0,76 -0,11 His 0,71 1 0,57 0,51 0,63 0,63 0,56 0,33 Phe 0,9 0,57 1 0,65 0,8 0,97 0,86 -0,19 Arg 0,57 0,51 0,65 1 0,66 0,7 0,66 -0,15 Cit 0,85 0,63 0,8 0,66 1 0,8 0,71 -0,05 Tyr 0,89 0,63 0,97 0,7 0,8 1 0,95 -0,13 Trp 0,76 0,56 0,86 0,66 0,71 0,95 1 -0,05 Cys2 -0,11 0,33 -0,19 -0,15 -0,05 -0,13 -0,05 1

correlação entre aminoácidos. Estes dois aminoácidos se diferenciam em sua estrutura pela presença de uma hidroxila no anel aromático.

Figura 17. Regressão linear entre os valores no planejamento experimental fracionado da Phe e Tyr. O R2 _{demonstra uma boa relação entre as respostas.}

Dentre todos os aminoácidos, aquele que teve menor grau de similaridade de ionização foi a Cys2, aproximando-se somente da Ala com coeficiente baixo de 0,43. A Cys2 foi o aminoácido que demonstrou a menor eficiência de ionização e no planejamento experimental completo apresentou um perfil de ionização bem diferente dos demais aminoácidos. A Figura 18 demonstra o menor coeficiente de correlação entre aminoácidos (Cys2 e Pro), onde as maiores e menores respostas entre os experimentos ocorrem em condições opostas.

Figura 18. Relação entre os valores no planejamento experimental fracionado da Cys2 e Pro.

1.5.4. Avaliação de Especificidade de Aminoácidos Livres e Aminoácidos Derivatizados por n-butanol

A matriz da amostra pode conter componentes que interferem no desempenho da medição. Os interferentes podem aumentar ou reduzir o sinal, e a magnitude do efeito também pode depender da concentração. Experimentos para avaliação da seletividade descritos na literatura sobre validação de métodos analíticos envolvem ensaios com padrões ou materiais de referência, amostras com e sem o analito, além da avaliação da capacidade de identificação do analito de interesse na presença de interferentes. Quando não há disponibilidade de interferentes, alguns autores sugerem a avaliação da habilidade de medição do analito por diferentes métodos, técnicas ou por meio de variações nas condições instrumentais. Se a seletividade não for assegurada, outras figuras de mérito estarão seriamente comprometidas58_.

Na análise de aminoácidos por LC-MS/MS sem a utilização de coluna cromatográfica ocorre a co-eluição de interferentes com mesma m/z, que podem interferir na seletividade do método. A Tabela 6 mostra os principais isóbaros e os isômeros Leu e Ile que possuem a mesma m/z na forma protonada, de aduto e derivatizada, além do dímero de Gly que pode ser facilmente formado no processo de ionização por ESI. A Tabela 6 ainda demonstra que, independente da escolha do aduto ou da alteração da molécula através de uma derivatização, as interferências ocorrem na sua forma protonada.

Tabela 6. Relação teórica de m/z de isóbaros e isômeros dos padrões de aminoácidos não-marcados na forma protonada, de adutos e derivatizados.

Avaliando um contexto de aplicação onde é importante a seletividade do método, serão discutidas as estratégias analíticas utilizadas e as interferências isobáricas. A análise de aminoácidos em ambientes de diagnóstico clínico por LC-MS/MS é realizada mais usualmente através da derivatização com n-butanol em meio ácido, onde as aquisições mais comumente utilizadas no modo neutral loss são por 102 Da, 119 Da e 161 Da de acordo com a característica básica das espécies. Quando a aquisição é realizada sem derivatização, é comum avaliar-se NL de 46 Da16,18_{. Os} métodos de aquisição por NL não são capazes de diferenciar isóbaros, pois a perda neutra é comum a todos, inviabilizando a identificação de cada espécie. Os métodos em SRM podem oferecer a vantagem de diferenciar isóbaros por fragmentos característicos. Em caso de se escolher fragmentos mais intensos, há benefício de sinais mais intensos, auxiliando na aquisição de menores LQs nos métodos. Na escolha de fragmentos mais específicos, opta-se pela seletividade na identificação dos isóbaros. Desta forma, métodos em SRM sem coluna cromatográfica podem ser a escolha para atender triagens com alta sensibilidade e baixa especificidade entre isóbaros, enquanto que métodos de second tier, assim denominados, para análise de AAL/AABE com separação cromatográfica possuem uma seletividade maior para os isóbaros. Neste contexto, foi avalidado se a derivatização usualmente oferece a vantagem de fragmentos mais seletivos do que quando comparado com os AAL.

Dentre os vinte e quatro AAL avaliados, doze tiveram os sinais mais intensos de 46 Da, referente à perda do grupo acil (CO2H2). Já entre os vinte e quatro AABE,

aminoácido comum MM (g.mol-1) [M+H]+ [M+NH3+] [M+H]+ + BE [M+NH3+] + BE

Isóbaros Gln – Lys 129 130 147 186 203

Isômeros/isóbaros Leu – Ile - Hyp 131 132 149 188 205

dímero Gly-Gly 132 133 150 189 206

isóbaros Orn – Asn – (Gly)2 132 133 150 189 206

nove tiveram os sinais mais intensos de 102 Da, referente à perda do grupo formato de butila (C5H10O2).

No mesmo estudo, avaliando os doze aminoácidos que são mais usualmente avaliados em testes de triagem neonatal (Gly, Ala, Val, Leu, Met, Phe, Tyr, Asp, Glu, Orn, Cit, Arg) quando em forma AAL, sete têm como fragmento mais intenso a perda de 46 Da, sendo que a Glu tem a perda de 46 Da como o segundo fragmento mais intenso formado. Três AAL (Orn, Cit, Tyr) têm os fragmentos com a perda de 63 Da, referente à perda de 46 + 17 Da (amônia). Já a Arg, que é um aminoácido básico, tem sua perda mais intensa de 105 Da.

Segundo Rogalewicz et al., a perda de 46 Da de aminoácidos livres devido à saída de H2O e CO requer três passos: (1) transferência de prótons de N para OH; (2) clivagem simples da ligação C(O)-+_{OH2; e (3) clivagem simples da ligação} NH2CH2+_{-C=O. Os fragmentos estudados por Rogalewicz et al. foram obtidos com} baixa energia de colisão (12 eV) e podem explicar as perdas mais intensas dos AAL com os seguintes mecanismos: (1) perda de H2O e CO produzindo um íon imínio, (2) perda de NH3 do N terminal e (3) perda de uma molécula pequena contendo heteroátomos da cadeia lateral. A Tabela 7 compara os dados obtidos experimentalmente com o trabalho de Piraud et al. É possível verificar que na grande maioria dos casos os fragmentos para formar o canal do SRM são os mesmos, sendo que somente em 3 casos não há coincidência com os fragmentos mais intensos do método desenvolvido experimentalmente. A explicação é que nestes três casos (Thr, Cys, Tyr), a CE aplicada nos diferentes métodos pode ter promovido a diferença no perfil dos fragmentos.

Quando foram avaliados os doze mais comuns em triagem neonatal (Gly, Ala, Leu, Val, Met, Phe, Tyr, Asp, Glu, Orn, Cit, Arg) em forma AABE, verificou-se que cinco deles possuem a perda mais intensa de 102 Da (butil formiato), enquanto que o Glu tem a perda de 102 Da como o quarto fragmento mais intenso. Já os AABE Orn e Cit tiveram perdas mais intensas de 17 Da enquanto que as perdas de 119 Da