1.5. Resultados e Discussão
1.5.1. Estudo de eficiência de ionização por Eletrospray
A análise de biomoléculas por MS requer uma compreensão das reações de transferência de prótons porque duas técnicas de ionização mais comumente usadas, dente elas inclusive a que foi utilizada no experimento, ESI e MALDI envolvem a adição e remoção de prótons para que a ionização seja possível. A avaliação das reações de transferência de prótons em fase gasosa fornece uma visão diferenciada para as estruturas dos aminoácidos, pois a alteração do estado de protonação pode impactar nas ligações de hidrogênio na molécula. Este fato pode afetar os padrões das intensidades dos íons por ESI e não refletir necessariamente a quantidade de íons em solução aquosa.
O pKa permite prever a relação de espécies ionizadas por aquelas sem carga presentes em solução de acordo com o pH do meio através da equação de Henderson-Hasselbalch (Equação 3).
pH = pKa + log [base conjugada]/[ácido conjugado] Equação 3
A Figura 6 demonstra o perfil de espectro de massas de 24 AALs adquirido em Q1 por ESI (+). A Figura 7 mostra a média de três medidas de infusão direta da mistura de AAL da Tabela 3 que descreve as concentrações de cada analito. Os resultados demonstram que a aquisição em modo positivo com metanol promove
uma maior detectabilidade dos aminoácidos. A acetonitrila é um solvente aprótico e, sem o aditivo doador de prótons, não favorece a formação de espécies carregadas positivamente. O modo negativo possui uma menor eficiência do que os resultados obtidos em modo positivo. Apesar disso, o modo negativo pode ser vantajoso de ser utilizado porque em alguns casos ele pode promover um espectro com menor ruído do que espectros adquiridos em modo positivo. Uma das principais diferenças entre modo positivo e negativo é o aumento do comportamento da descarga corona quando uma voltagem negativa é aplicada. Este é um fenômeno que proporciona maior ionização da atmosfera ao redor do capilar do spray, que leva à formação de uma variedade de produtos detectáveis. Estes íons formados podem complicar o espectro de massas e diminuir os sinais da espécie de interesse. Outra diferença entre as formas de aquisição é o fato de que pode ocorrer redução na fonte em modo negativo. No modo positivo em ESI as espécies que oxidam no capilar são metais e os cátions do metal produzidos são pouco detectáveis pela técnica. Entretanto, as espécies que sofrem redução na fonte ESI não são os metais de contato, porque eles não podem ser reduzidos novamente. Em altas concentrações, as espécies reduzidas podem ser os analitos, mas para as análises típicas em ESI- MS, onde as concentrações são baixas, as espécies que predominante sofrem redução são as moléculas de solvente ou aditivo presente no solvente52. Verifica-se que há desvantagem neste caso para a produção de espécies carregadas negativamente dos aminoácidos, pois ocorre redução de outras espécies com as concentrações baixas empregadas para a verificação da eficiência de ionização dos aminoácidos.
Figura 6. Perfil de espectro de massas de 24 AALs adquirido em Q1 por ESI (+).
Figura 7. Eficiência de ionização dos aminoácidos em metanol e acetonitrila em modo positivo [M+H] (+) e modo negativo [M-H] (-) por infusão direta ESI-MS da mistura de AAL. As barras representam o intervalo de confiança de 3 medidas realizadas. Para estimativa do intervalo de confiança indicado pelas barras considerou-se a ausência de erros sistemáticos e que s não é uma boa aproximação de nível de confiança aplicado foi de 95% com valor de t igual a 4,359.
A Figura 8 mostra a comparação de aminoácidos adquiridos em diferentes solventes com adição de 0,1% (v/v) de ácido fórmico em modo positivo. O aumento da acidez desloca o equilíbrio dos zwitterions para a forma protonada, o que promove melhor detectabilidade em modo positivo se comparado com os resultados obtidos sem aditivos. A adição de água (20%) em metanol diminui a detectabilidade de todos os aminoácidos, enquanto que aumentou o sinal em treze dos aminoácidos diluídos em acetonitrila. Como a água é menos volátil que o metanol, este fator pode influenciar na eficiência da secagem das gotas na formação dos íons. Quando o solvente orgânico utilizado é a acetonitrila, como esta é um solvente aprótico, a água para alguns aminoácidos pode auxiliar na transferência do próton e em outros prejudica na secagem da gota.
Figura 8. Eficiência de ionização dos aminoácidos em metanol, acetonitrila, metanol:água (80:20) e acetonitrila:água (80:20) com adição de 0,1% (v/v) ácido fórmico por infusão direta ESI-MS em modo positivo. As barras representam o intervalo de confiança de 3 medidas realizadas. Para estimativa do intervalo de confiança indicado pelas barras considerou-se a ausência de erros sistemáticos e que s não é uma boa aproximação de nível de confiança aplicado foi de 95% com valor de t igual a 4,359.
A Figura 9 demonstra resultados obtidos em modo positivo com adição de aditivos básicos. Os dois aditivos utilizados foram o hidróxido de amônio (aditivo mais comum para ESI(-)) e a hidrazina, que é uma molécula que possui propriedade de base de Lewis. A hidrazina é uma molécula utilizada em testes de triagem
neonatal na fase móvel de métodos de ESI-MS com o objetivo de derivatizar a succinilacetona, um metabólito importante para determinar a doença tirosinemia tipo I. A escolha da hidrazina foi feita com o objetivo de verificar o comportamento dos aminoácidos livres com uma base de Lewis na fase móvel e a alteração na detectabilidade dos AAL em comparação com adição de ácidos. A adição de hidróxido de amônio e de hidrazina nos solventes não promoveu um aumento de resposta no modo negativo. A porção de água adicionada ao metanol com os diferentes aditivos possui o pH ao redor de 10 na adição de hidróxido de amônio e 8 na adição de hidrazina. Os resultados de baixa ionização no modo negativo podem ser justificados conforme discussão da Figura 7.
Assim como a estrutura da cadeira lateral dos aminoácidos é importante para a formação da estrutura secundária das proteínas diferenciando-as em -hélice e - pregueada, esta mesma característica parece ser relevante para a ionização dos AAL em ESI-MS. Os diferentes aminoácidos variam de acordo com seu tamanho, formato, capacidade de formação de ligações de hidrogênio, características hidrofóbicas e reatividade química. Todas estas características podem influenciar na ionização em ESI-MS além de suas características de ácido e base, traduzidas através de seus respectivos pKa1, pKa2, pKaR.
Para iniciar a avaliação do grau de ionização dos AAL foram estudadas a classificação orgânica das cadeias laterais e respostas obtidas na Figura 9A e 9B. Ao avaliar a Gly, o AAL alifático mais simples, verificamos que este possui uma ionização deficiente por ESI-MS. Seu pKa1 e pKa2 (2,34; 9,60) não diferem em muito de um AAL que tem boa ionização, como a Met (2,28; 9,21), por exemplo. Por ser a menor molécula do grupo, o seu tamanho e a dificuldade em acomodar as cargas com outros grupos pode promover interações eletrostáticas do grupo amino carregado positivamente e do grupo carboxil carregados negativamente dificultando sua saída da gota para a fase gasosa. O aumento da cadeia lateral observado na Ala com um grupo metil, Val com cadeia lateral isopropílica, e da Leu com cadeia isobutila, parecem estabilizar melhor a carga no grupo amino e diminuir a concentração de carga positiva em um único grupo, que pode aumentar as interações intermoleculares.
Figura 9. A). Eficiência de ionização dos aminoácidos em metanol, com adição de 0,1% (v/v) de ácido fórmico, 0,1% (v/v) de hidrazina e 0,1% (v/v) de hidróxido de amônio por infusão direta ESI-MS em modo positivo. B). Apresentação de resultados de ionização por tipo de grupo de cadeia lateral dos aminoácidos: alifáticos, ácidos, amidas, aromáticos, grupos básicos (guanidino, imidazol e amina primária), hidroxil, imino e sulforados.
A interferência isobárica na m/z de 132 das espécies Hyp,Ile,Leu impossibilita a conclusão de que o aumento da cadeia alifática contribui para a eficiência da ionização.
O grupo dos AALs ácidos possuem ácidos mais fracos em sua cadeia lateral, sendo que o grupo ácido do Asp tem pKa de 3,86 e o da Glu de 4,25, do que o grupo ácido de sua cadeia principal (pKa ~ 2). Se compararmos com outros AALs que possuem sua cadeia lateral carboniladas com amidas com o objetivo de verificarmos se a carga negativa da cadeia lateral de Asp e Glu pode prejudicar a eficiência de ionização em modo positivo, é difícil inferir algo, pois ambas as amidas estão sofrendo interferência isobárica. Portanto, as respostas entre os tipos de cadeia lateral podem estar invertidas, ou seja, os aminoácidos com cadeia lateral com as amidas podem ter respostas menores de ionização do que os ácidos. A cadeia lateral com carga negativa de Glu e Asp podem interferir na eficiência de ionização, uma vez que é a carga formal líquida que é importante para a detecção do aminoácido. Se a amina estiver protonada e um dos ácidos carboxílicos estiver desprotonado, ou os dois desprotonados, a carga formal líquida pode ser zero ou negativa.
Os ácidos carboxílicos e as amidas têm duas estruturas que contribuem majoritariamente com a ressonância. A segunda estrutura é mais importante para as amidas do que para os ésteres ou ácidos carboxílicos já que o nitrogênio é menos eletronegativo do que o oxigênio e, portanto, tem mais capacidade de acomodar a carga positiva. Desta forma, as amidas apresentam os pontos de ebulição mais altos porque têm fortes interações dipolo-dipolo, uma vez que a estrutura contribuinte na ressonância com as cargas separadas contribui de maneira significativa com a estrutura total da substância60. Desta forma, pensando que a ESI é uma fonte de ionização que transfere as cargas já existentes em solução para a fase gasosa, caso as cargas tenham interações eletrostáticas mais fortes, elas terão menor tendência de serem expulsas da solução. Esta observação pode prejudicar a ionização de amidas.
O grupo dos aromáticos tem um perfil bem diferente entre os seus representantes: Phe, Tyr e Trp. Phe é puramente hidrofóbica, enquanto Tyr e Trp são mais polares porque possuem um grupo hidróxido e um grupo NH, respectivamente. O pKa1 e o pKa2 destes três aminoácidos não é muito diferente (Phe 1,83 e 9,13; Tyr 2,20 e 9,11; Trp 2,38 e 9,39), entretanto, o perfil deles de ionização em ESI pode ser diferente devido às interações intermoleculares que participam. O grupo fenil da Phe somente realiza interações hidrofóbicas, já a Tyr
possui um substituinte OH em posição para que doe elétrons por ressonância e também retirem elétrons indutivamente, porque o átomo ligado ao anel benzênico é mais eletronegativo que um hidrogênio. Uma vez ativado o anel, há formação de carga na molécula que permite mais interações do tipo íon-dipolo com outras espécies em solução. Além disso, o grupo OH pode realizar pontes de hidrogênio com outras espécies, dificultando sua migração para a fase gasosa. Já o Trp possui um indol em sua estrutura aromática, que é uma base muito fraca, porque o par de elétrons livre no átomo de nitrogênio é necessário para que a substância tenha aromaticidade60. O pKa do indol protonado é de -2,4 e, portanto, no Trp, o nitrogênio do anel nunca estará protonado em condições fisiológicas. A cadeia lateral do Trp, sendo mais polar que a Phe e a Tyr ou até mesmo protonada em condições específicas de ESI, pode interagir de maneira mais eficiente com outros aminoácidos em solução e ter menor eficiência para migrar para fase gasosa. Estas observações a respeito da estrutura química destes três aminoácidos aromáticos dariam a eficiência de ionização na seguinte ordem: Phe>Tyr>Trp. Observamos pela Figura 9B somente a ionização melhor da Phe de forma mais clara qualitativamente com a alteração dos aditivos.
Os três AALs que possuem cadeias laterais básicas, His, Arg e Lys, apresentaram boa eficiência de ionização, em especial com a adição de hidrazina. A Arg é o AAL com maior pI devido à presença do grupo guanidino em sua cadeia lateral que alcança um pKaR de 12,48. A Arg mantém um perfil muito semelhante de ionização mesmo como a alteração dos aditivos em solvente, informando que mesmo uma variação ampla do pH para este AAL não foi relevante. A His possui um anel imidazol em sua cadeia lateral, substituinte este que é relativamente básico (pKa = 6) e quando protonado é estabilizado através de ressonância60. Este comportamento é o esperado com a adição de hidrazina que promove um pH em solução de aproximadamente 8. No sinal obtido pela soma dos AAL Gln+Lys, pelo fato da interferência isobárica ocorrer, não é possível identificar qual dos dois aminoácidos foi responsável pela maior contribuição na resposta com hidrazina. A Lys é um AAL que possui em sua cadeia lateral uma amina primária. Apesar da Lys e His parecerem ter o mesmo perfil de ionização, em meio básico a His perde mais facilmente a carga positiva do grupo amino (pKa2 = 9,17) e depois da cadeia lateral (pKaR = 6). Já a Lys perde mais facilmente seu próton da amina primária (pKaR =
10,53) e depois do grupo amino (pKa2= 8,95). Desta forma, não parece que a carga em cadeia lateral que é a responsável nestes grupos em aumentar a eficiência na ionização destas espécies. O pH interferiu pouco na resposta da Arg e para a His e Lys+Gln, o meio mais básico promoveu uma melhor eficiência na ionização.
A Thr e a Ser possuem em suas cadeias laterais grupo hidroxil (OH). Este agrupamento não modifica muito o pKa1 e pKa2 comparando-os com os demais AAL. A presença de uma metila a mais em Thr modifica o pKa2 em relação a Ser em mais de uma unidade, demonstrando que o substituinte da cadeia lateral torna a molécula mais básica por estabilizar melhor a força do grupo OH que é retirador de elétrons. A presença do grupo OH na cadeia lateral parece piorar a eficiência da ionização dos aminoácidos em modo (+), uma vez que, mesmo com a variação de aditivos, os resultados obtidos são bem inferiores a aminoácidos com cadeia lateral básicas. A Thr somente apresentou melhora em seu resultado quando foi adicionado ácido fórmico em solução. Grupos OH favorecem a formação de ligações de hidrogênio e podem diminuir a migração dos AAL da gota para fase gasosa, além de serem grupos retiradores de elétrons por indução.
O grupo imino da Pro promove uma maior disponibilidade do par de elétrons do grupo amino do AAL, deixando-o tão básico como a amina primária da cadeia lateral da Lys. Ambos os grupos ficam com o pKa ao redor de 10,6, sendo que o pKa2 usual de AAL é 9. Na Pro não há cadeia lateral que seja capaz de realizar interações intermoleculares fortes. A Pro foi favorecida em sua ionização em pH mais ácido e teve menor eficiência em pH mais básico conforme previsto em deslocamento de equilíbrio químico em solução. A Tabela 4 demonstra o aumento do número de espécies negativas de Pro com o aumento do pH, espécies estas com carga formal zero.
Tabela 4. Previsão de espécies iônicas e neutras para os grupos amino e ácido carboxílico em pH 2, pH 7 e pH 10 de acordo com o pKa’s de aminoácido.
O grupo de sulforados é representado por Cys, Cys2 e Met. No preparo das soluções, a Cys2 apresentou dificuldade em ser diluída em solvente orgânico e aquoso, demonstrando inicialmente uma diferença visível entre todos os outros AALs. Cys é um AAL com estrutura muito semelhante à Ser, mas contém um grupo sulfidrila ou tiol (-SH) em sua cadeia lateral. O grupo -SH é muito mais reativo e realiza ligações dissulfeto, formando a Cys2. Na Cys, a presença do átomo de enxofre promove um aumento no pKa2, pois o nitrogênio do grupo amino é mais eletronegativo e estabilizado pela deslocalização de carga negativa do enxofre. Essa pequena diferença em eletronegatividade com essa mudança de substituinte (OH da Ser para SH na Cys), pode ter contribuído para diminuir a eficiência da ionização na
2 4 7 10 10
Grupo ácido Grupo ácido Grupo ácido Grupo ácido Grupo básico
espécie - espécie - espécie - espécie - espécie neutra
Gly 2,350 9,780 5,970 0,447 44,668 4,467E+04 4,467E+07 1,660
Ala 2,350 9,870 6,020 0,447 44,668 4,467E+04 4,467E+07 1,349
Pro 1,950 10,640 6,100 1,122 112,202 1,122E+05 1,122E+08 0,229
Val 2,290 9,740 5,970 0,513 51,286 5,129E+04 5,129E+07 1,820
Ile 2,320 9,760 6,020 0,479 47,863 4,786E+04 4,786E+07 1,738
Leu 2,330 9,740 5,980 0,468 46,774 4,677E+04 4,677E+07 1,820
Phe 2,200 9,310 5.48 0,631 63,096 6,310E+04 6,310E+07 4,898
Tyr 2,200 9,210 10,460 5.65 0,631 63,096 6,310E+04 6,310E+07 6,166
Trp 2,460 9,410 5.88 0,347 34,674 3,467E+04 3,467E+07 3,890
Asp 1,990 9,900 3,900 2.87 1,023 102,329 1,023E+05 1,023E+08 1,259 Glu 2,100 9,470 4,070 3.22 0,794 79,433 7,943E+04 7,943E+07 3,388
Asn 2,140 8,720 5.41 0,724 72,444 7,244E+04 7,244E+07 0,000
Gln 2,170 9,130 5.65 0,676 67,608 6,761E+04 6,761E+07 0,000
Lys 2,160 9,060 10,540 9.74 0,692 69,183 6,918E+04 6,918E+07 8,710
Orn 1,700 8,700 1,995 199,526 1,995E+05 1,995E+08 19,953
His 1,800 9,330 7.58 1,585 158,489 1,585E+05 1,585E+08 4,677
Arg 1,820 8,990 12,480 10.76 1,514 151,356 1,514E+05 1,514E+08 10,233
Ser 2,190 9,210 5.68 0,646 64,565 6,457E+04 6,457E+07 6,166
Thr 2,090 9,100 6.53 0,813 81,283 8,128E+04 8,128E+07 7,943
Hyp 1,800 9,330 6,040 1,585 158,489 1,585E+05 1,585E+08 4,677
Cys 1,920 10,700 8,370 5.14 1,202 120,226 1,202E+05 1,202E+08 0,200
Met 2,130 9,280 5.75 0,741 74,131 7,413E+04 7,413E+07 5,248
Cit 2,430 9,410 0,372 37,154 3,715E+04 3,715E+07 3,890
Cys já que há maior delocalização de carga na molécula e aumentam as interações intermoleculares.
Na Met, o pKa2 é menor do que na Cys, pois há um grupo metil a mais entre o grupo amino e o tioeter e o par de elétrons do enxofre está menos disponível porque está realizando ligação com dois carbonos60. Apesar da Cys ser o mais favorecido em relação à Met em solução para estar protonado, a resposta da ionização da Met é melhor em ESI-MS.
Neste estudo exploratório, constatou-se a existência de três grupos de AAL. O primeiro grupo (Gly, Ser, Ala, Val, Thr, Trp, Met, Pro) apresentou melhor resposta quando houve adição de ácido ao solvente. Neste grupo nenhum dos aminoácidos possui cadeia lateral com grupo ionizável. O segundo grupo (His, Phe, Gln+Lys, Asn+Orn, Cit, Glu, Tyr, Asp, Cys2, Cys) apresentou melhor ionização em meio básico com hidrazina ou com hidróxido de amônio. O terceiro grupo (Arg, Hyp+Ile+Leu) apresentou uma ionização muito próxima com diferentes aditivos. Avaliando o pKa1 e pKa2 destes grupos verifica-se que não há relação entre estes valores e o comportamento de ionização. A Figura 9A demonstra que cinco dos sete aminoácidos com pior ionização em modo positivo (Ala, Val, Gly, Met, Thr) possuem melhor resposta com adição de 0,1% (v/v) de ácido fórmico, enquanto que os aminoácidos com facilidade de ionização (His, Phe, Gln+Lys, Asn+Orn) obtiveram melhores respostas com adição de 0,1% (v/v) de hidrazina. Com o objetivo de obter uma melhor resposta de forma mais eficiente para o maior número de AAL, o aditivo de escolha para a implementação de um método de análise dos 24 aminoácidos relacionados neste estudo foi o ácido fórmico.
Na análise de protonação e desprotonação dos analitos por ESI, deve ser assumido que o pH da solução tem um papel importante na determinação da seletividade da ionização. Enquanto para alguns analitos este é o caso, a relação entre a resposta no ESI e o pH está longe de ter uma explicação simples e este também é o caso para os AALs conforme demonstrado na Figura 9A e 9B. Algumas racionalizações destas observações têm sido propostas para explicar estas situações, incluindo a formação de íons favorecida pela energia no processo do ESI61, a mudança do pH da gota conforme a evaporação do solvente e que a reação de transferência do próton em fase gasosa contribui para carregar as espécies que não estariam protonadas em solução62-63.
Os aminoácidos possuem um perfil anfótero e em pH específico podem encontrar a maioria de sua população protonada ou desprotonada no grupo ácido ou no grupo amino e ainda na cadeia lateral. Esta distribuição respeita um equilíbrio que é regido pelo pKa de cada grupo e garante ao aminoácido uma carga específica em determinado pH. Para avaliar se os resultados encontrados na Figura 9 relacionam-se diretamente com a população iônica em solução conforme é previsto em ESI, realizamos uma previsão da relação entre base conjugada pelo ácido conjugado utilizando a equação de Henderson-Hasselbalch. A Tabela 4 utiliza os pHs 2, 4, 7 e 10 para correlacionar a quantidade de espécies com carga positiva de cada aminoácido para comparação com resultados encontrados por ESI-MS. Existem diversos trabalhos na literatura que avaliam as intensidades dos espectros de massas de íons de aminoácidos adquiridos por ESI de acordo com a variação do pH da solução64-65. Um dos principais objetivos destes trabalhos é verificar se ESI reflete a concentração de íons presentes na solução, ou se ocorre o fenômeno de wrong-way-round ionization, onde moléculas abundantemente protonadas podem ser produzidas em condições básicas e moléculas desprotonadas em condições ácidas.
A Tabela 4 demonstra que o aumento do pH aumenta a quantidade de espécies negativas em solução e, portanto, o esperado era uma diminuição da resposta dos aminoácidos em ESI-MS no modo positivo. Experimentalmente este não foi o comportamento encontrado como padrão. Ressalta-se a resposta invertida do aumento de sensibilidade para a Phe e His. Outras respostas (Asn+Orn, Gln+Lys) também tiveram melhor resposta com a hidrazina, entretanto possuem interferência isobárica e não foi possível identificar qual a espécie iônica responsável