UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS INSTITUTO DE QUÍMICA
FERNANDA SENA
OTIMIZANDO A DETECTABILIDADE DE AMINOÁCIDOS POR ESPECTROMETRIA DE MASSAS
CAMPINAS 2017
FERNANDA SENA
OTIMIZANDO A DETECTABILIDADE DE AMINOÁCIDOS POR ESPECTROMETRIA DE MASSAS
DISSERTAÇÃO DE MESTRADO APRESENTADA AO INSTITUTO DE QUÍMICA DA UNICAMP PARA OBTENÇÃO DO TÍTULO DE MESTRA EM QUÍMICA NA ÁREA DE QUÍMICA ANALÍTICA.
ORIENTADOR: PROF. DR. MARCOS NOQUEIRA EBERLIN
ESTE EXEMPLAR CORRESPONDE À VERSÃO FINAL DA DISSERTAÇÃO DEFENDIDA PELA ALUNA FERNANDA SENA, E ORIENTADO PELO PROF. DR. MARCOS NOGUEIRA EBERLIN.
CAMPINAS 2017
Agência(s) de fomento e nº(s) de processo(s): Não se aplica.
Ficha catalográfica
Universidade Estadual de Campinas Biblioteca do Instituto de Química
Informações para Biblioteca Digital
Título em outro idioma: Optimizing amino acid detectability by mass spectrometry Palavras-chave em inglês:
Aminoacids
Electrospray-ionization Mass spectrometry
Área de concentração: Química Analítica
Titulação: Mestra em Química na área de Química Analítica Banca examinadora:
Marcos Nogueira Eberlin [Orientador] Alessandra Sussulini
Luiz Alberto Beraldo de Moraes Data de defesa: 23-02-2017
Programa de Pós-Graduação: Química
Danielle Dantas de Sousa - CRB 8/6490
Sena, Fernanda, 1988-
Se55o Sen Otimizando a detectabilidade de aminoácidos por espectrometria de massas / Fernanda Sena. – Campinas, SP : [s.n.], 2017.
Sen Orientador: Marcos Nogueira Eberlin.
Sen Dissertação (mestrado) – Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Química.
Sen1 . Aminoácidos. 2. Ionização por eletrospray. 3. Espectrometria de massas. I. Eberlin, Marcos Nogueira. II. Universidade Estadual de Campinas. Instituto de Química. III. Título.
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BANCA EXAMINADORA
Prof. Dr. Marcos Nogueira Eberlin (Orientador)
Prof. Dr. Luiz Alberto Beraldo de Moraes (FFCLRP-USP)
Profa. Dra. Alessandra Sussulini (IQ-UNICAMP)
A Ata da defesa com as respectivas assinaturas dos membros encontra-se no processo de vida acadêmica do(a) aluno(a).
Este exemplar corresponde à redação final da
Dissertação de Mestrado defendida pelo aluno FERNANDA SENA, aprovada pela Comissão Julgadora em 23 de fevereiro de 2017.
CITAÇÃO
“Reze e trabalhe, fazendo de conta que esta vida é um dia de capina com sol quente, que às vezes custa mais a passar, mas sempre passa. E você ainda pode ter muito pedaço bom de alegria…Cada um tem a sua hora e a sua vez: você há de ter a sua. ” - Guimarães Rosa
“Ser feliz é encontrar força no perdão, esperanças nas batalhas, segurança no palco do medo, amor nos desencontros. É agradecer a Deus a cada minuto pelo milagre da vida.” ― Fernando Pessoa
Dedicatória
Ao meu pai (in memoriam) que partiu uma semana antes de sair o resultado da prova do mestrado. Obrigada por estar sempre por perto.
Aos meus super-heróis: Marcelo Sena e Soraia Sena. Valentia e coração que jamais conheci iguais. Vitória com vocês! Tuca, que lição de vida que você nos dá a cada dia!!!
AGRADECIMENTOS
Agradeço ao Professor Marcos Eberlin por ter me dado a oportunidade de (re) começar! Obrigada!
Pela paciência, apoio, suporte e carinho, agradeço a pessoa maravilhosa e poderosa que sempre esteve do meu lado: minha mãe, Fátima Colussi.
Amigo, querido e inestimável, que escutou e aconselhou: Professor Paolo Di Mascio! Obrigada por estar sempre disponível para conversar e orientar nas dúvidas inerentes à pós-graduação e, também, da vida.
Agradeço o Professor Roy Bruns que, por diversas vezes, me recebeu em sua sala para tirar dúvidas. Agradeço a boa vontade didática.
Obrigada também ao Professor Thiago Correra pelas visitas que realizei ao IQ-USP para conversarmos sobre os meus resultados.
Agradeço à Heliara Nascimento e Lygia Marques que me receberam em sua casa enquanto passava dias distantes da minha família.
Agradeço ao meu querido amigo, Fernando Guerreiro. Só você sabe o significado que tem esse trabalho. Esteve sempre do meu lado. Obrigada mesmo!
Agradeço a todo time da CH5 (Ivani, Tiago, Rodolpho, Osvaldo, Mariana, Carolzinha, Juliana, Vivian, Clóvis, João), em especial para Márcia Flores que me deu todo suporte necessário para finalizar este trabalho.
Não posso esquecer também de amigos e colegas que passaram na pós-graduação e laboratório ThoMSon: Rosy, Fernando Reinoldo, Jandyson, Javier, Adriana, Fabio, Pedro, Vinícius, Bas, Almas, Marcos, Giovana, Clécio, Gustavo, Andréa, Damila, Nicolas, Célio, José, e tantos outros. Obrigada pela presença, vocês são realmente demais.
O meu muito obrigada para meus amigos e colegas da FGV, especial para o grupo Creme de La Creme (Petrini, Dutra, Argentino, Carol Doutora, Carol Representante, Jubs, Gabriel, Didimo, Mari, Lu, Tiago) e para o Saladetto (Renata, Marcel, Bruna, Tiago e Jorge). Período difícil e de muito aprendizado.
Agradeço a abertura do PNCQ, em especial para Anna Serra, Kamilla Cruz e Bárbara. Obrigada por estarem abertas para discutirmos ciência.
Agradeço a essa força que nos rege e que nos guia. Força que faz tudo se encaixar, engrenar, motivar e animar. Obrigada por estar sempre do meu lado. Obrigada Deus! Vitória!
RESUMO
Uma longa lista de métodos para análise de aminoácidos tem sido publicada nos últimos 50 anos. Em contextos onde a disponibilidade de amostra é pequena, os aminoácidos são derivatizados com o objetivo de aumentar a detectabilidade antes de serem analisados por espectrometria de massas utilizando como fonte de ionização o Eletrospray (ESI).
O presente trabalho tem por objetivo avaliar como as características inerentes a cada aminoácido e os parâmetros da ESI podem interferir na ionização desses compostos e na detectabilidade do método. O estudo de ionização de vinte e quatro aminoácidos livres foi realizado através de um método flow injection analysis em um sistema triplo quadrupolo (QqQ) com diferentes solventes, aditivos e sais. As nove condições empregadas durante a aquisição dos íons na fonte ESI foram otimizadas por planejamento experimental fracionado e completo. Os métodos em modo monitoramento de reações selecionadas (do inglês, selected reaction monitoring, SRM) e perda neutra (do inglês, neutral loss, NL) foram otimizados e os valores de limite de quantificação e limite de detecção utilizando padrões em solventes foram calculados. Como exemplos de aplicação foi realizado um teste preliminar para avaliar os efeitos de supressão iônica da matriz de dried blood spot e a recuperação para fenilalanina.
Os resultados encontrados demonstraram a necessidade de uma combinação multivariada de parâmetros físico-químicos para predição da eficiência de ionização de aminoácidos. O SRM demonstrou ser um método mais sensível do que a NL no cálculo para LD e LQ. O valor da supressão iônica em DBS para fenilalanina alcança a faixa de 80,0% em concentrações mais baixas (1,55 nmol.mL-1) e a recuperação da extração foi de 51,8%.
ABSTRACT
A long list of methods for amino acid analysis has been published in the last 50 years. In contexts where sample availability is small, amino acids are derivatized in order to increase detectability before being analyzed by mass spectrometry using electrospray ionization (ESI).
The present work aims to evaluate how the inherent characteristics to each amino acid, as well as ESI parameters, can influence the ionization of these compounds and thereby their detectability. The ionization study of twenty four free amino acids was carried out through a flow injection analysis method in a triple quadrupole system, with different solvents, additives and salts. A total of nine conditions were employed during the analyses of ESI-generated ions. These conditions were optimized by fractional and complete experimental design. Methods based on selected reaction monitoring as well as neutral loss were optimized and the limits of detection and quantification were calculated using neat standard solutions. As an example of application, a preliminary test was performed to evaluate the recovery and ion suppression effects for the analysis of phenylalanine in dried blood spots.
The results showed the need for a multivariate combination of physico-chemical parameters to predict the amino acid ionization efficiency. SRM has been shown to be a more sensitive method than NL in the calculation of LD and LQ. The value of ion suppression in DBS for phenylalanine reaches the range of 80.0% at lower concentrations (1,55 nmol.mL-1) and extraction recovery was 51.8%.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Reações de derivatização utilizadas para cromatografia por troca iônica com (A) ninidrina e em cromatografia líquida com (B) OPA e (C) FMOC. ... 22 Figura 2. Reação de derivatização utilizada em análises clínicas ... 23 Figura 3. Em ESI-MS, a solução diluída do analito é bombeada através um capilar a uma baixa vazão (~ 3 a 10 mL.min-1). ... 25 Figura 4. Diagrama esquemático de um sistema de um analisador de massas do tipo triplo quadrupolo. ... 26 Figura 5. Planejamento 29-4 para avaliação exploratória de efeitos significativos para fonte na análise de aminoácidos livres em modo positivo. ... 32 Figura 6. Perfil de espectro de massas de 24 AALs adquirido em Q1 por ESI+. ... 37 Figura 7. Eficiência de ionização dos aminoácidos em metanol e acetonitrila em modo positivo [M+H]+ e modo negativo [M-H]- por infusão direta ESI-MS da mistura de AAL. ... 37 Figura 8. Eficiência de ionização dos aminoácidos em metanol, acetonitrila, metanol:água (80:20) e acetonitrila:água (80:20) com adição de 0,1% (v/v) ácido fórmico por infusão direta ESI-MS em modo positivo. ... 38 Figura 9. A). Eficiência de ionização dos aminoácidos em metanol, com adição de 0,1% (v/v) de ácido fórmico, 0,1% (v/v) de hidrazina e 0,1% (v/v) de hidróxido de amônio por infusão direta ESI-MS em modo positivo. ... 40 Figura 10. Relação de intensidade de respostas de aminoácidos em ESI-MS com características físico-químicas (pKa1, massa molar, afinidade protônica e ponto isoelétrico) em MeOH sem uso de aditivos. ... 47 Figura 11. Relação de intensidade de respostas de aminoácidos em ESI-MS com características físico-químicas (pKa1, massa molar, afinidade protônica e ponto isoelétrico) em MeOH com uso de 0,1% de hidróxido de amônio... 48 Figura 12. Formação de adutos de aminoácidos na presença de quatro diferentes cátions em MeOH com 0,1% de ácido fórmico. ... 50 Figura 13. Supressão iônica dos aminoácidos em meio ácido. As barras representam a média de três medidas realizadas no mesmo dia. ... 51 Figura 14. Esquema de parâmetros da fonte de ESI analisados durante o planejamento experimental fracionado. ... 54 Figura 15. Heat Map com representação dos parâmetros de planejamento fatorial 2 9-4. ... 55 Figura 16. Gráfico Normal de planejamento fatorial completo 26 para o AAL Gly ... 56 Figura 17. Regressão linear entre os valores no planejamento experimental fracionado da Phe e Tyr. ... 59
Figura 18. Relação entre os valores no planejamento experimental fracionado da Cys2 e Pro. ... 60 Figura 19. Comparação de fragmentos mais intensos entre os isóbaros Hyp-Ile-Leu livres e derivatizados. ... 67 Figura 20. Perfil de aquisição de dados no estudo de LQ e LD de 20 canais por MRS. ... 69 Figura 21. Supressão iônica em amostra de sangue extraída de DBS em concentração de C1 e C2... 83 Figura 22. Curva com adição de padrão de Phe em papel filtro com quatro pontos na curva: amostra, amostra + C1 ... 86 Figura 23. Curva com adição de padrão de Phe em papel filtro com quatro pontos na curva: amostra, amostra + C1 ... 86
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Representação das nomenclaturas de aminoácidos, pKa’s do grupo amino, do grupo ácido e da cadeia lateral R de aminoácidos, ponto isoelétrico e basicidade em fase gasosa. ... 18 Tabela 2. Comparação das características físico-químicas entre os aminoácidos. ... 19 Tabela 3. Concentração de AAL utilizados para realizar testes em FIA-ESI-MS/MS. .... 30 Tabela 4. Previsão de espécies iônicas e neutras para os grupos amino e ácido carboxílico em pH 2, pH 7 e pH 10 de acordo com o pKa’s de aminoácido. ... 44 Tabela 5. Similaridade de comportamento de ionização de aminoácidos em diferentes condições de fontes em planejamento experimental 29-4. ... 58 Tabela 6. Relação teórica de m/z de isóbaros e isômeros dos padrões de aminoácidos não-marcados na forma protonada, de adutos e derivatizados. ... 61 Tabela 7. Comparação dos quatro fragmentos mais intensos verificados em método desenvolvido com método de Piraud et al. ... 63 Tabela 8. Transições de MRS para 24 aminoácidos livres e seus respectivos derivatizados em butil ésteres. As espécies destacadas em azul, laranja e cinza são isóbaros analisados no método multicomponentes, sendo que Leu e Ile são isômeros. ... 65 Tabela 9. LD e LQ de 24 AAL adquiridos em ESI-MS por MRS e PN.. ... 71 Tabela 10. Tabela com valores de referência de concentração de AAL em pacientes com menos de 24 meses. ... 71 Tabela 11. Descrição de principais aminocidopatias com definição das enzimas e aminoácidos relacionados. ... 75 Tabela 12. Valores de replicatas de amostras com adição de padrão de Phe. O MRS foi realizado utilizando MeOH com 0,1% de ácido fórmico. ... 81 Tabela 13. Valores de replicatas de amostras com adição de padrão de Phe. O MRS foi realizado utilizando MeOH:H2O (80:20) com 0,1% (v/v) de ácido fórmico. ... 82 Tabela 14. Valores médios de área de padrão (C1, C2, C3) e valores de amostra dopada com os padrões descontando o valor da amostra. ... 83 Tabela 15. Valores médios de área de padrão (C1, C2, C3) e valores de amostra dopada com os padrões descontando o valor da amostra. ... 84 Tabela 16. Valores de replicatas de amostras dopadas em papel filtro com padrão C3 de Phe. ... 85 Tabela 17. Valores de recuperação em concentração C2 ... 87
LISTA DE ABREVIATURAS
AABE – Aminoácido derivado em butil éster AAL – Aminoácido livre
BE – Butil éster CE – Collision energy
CID - Collision-induced dissociation CXP – Collision Cell Exit Potential DP - Declustering potential
DBS – Dried blood spot FIA – Flow injection analysis FM – Fase móvel
LD – Limite de detecção LQ – Limite de quantificação
MALDI - ionização por dessorção a laser assistida por matriz, do inglês Matrix-assisted laser desorption/ionization
MeOH – Metanol
MS – Espectrometria de massas, do inglês Mass Spectrometry NL – Perda neutral, do inglês Neutral Loss
SRM – Monitoramento de reações selecionadas, do inglês Selected reaction monitoring
TOF – Time of flight PKU – Fenilcetonúria QqQ – Triplo Quadrupolo
TMS-TFA - Trimetilsilil - ácido trifluoroacético UV – Ultravioleta
SUMÁRIO
CAPÍTULO 1: Estudo e otimização da detectabilidade de aminoácidos em padrão
por Eletrospray ... 16
1.1. Introdução ... 16
1.1.1. Aminoácidos: classificação e características físico-químicas ... 16
1.1.2. Análise de aminoácidos e detectabilidade do sinal analítico... 19
1.1.3. Espectrometria de massas com fonte de ionização Eletrospray ... 23
1.1.4. Fundamentos de LC-MS/MS ... 25
1.2. Justificativa ... 27
1.3. Objetivos ... 28
1.4. Procedimento Experimental ... 28
1.4.1. Reagentes e Materiais ... 28
1.4.2. Instrumentação e tratamento de dados ... 30
1.4.3. Estudo de Ionização de AAL ... 31
1.4.4. Estudo de formação de adutos e supressão de sinal de AAL ... 31
1.4.5. Planejamento experimental para otimização de condições de Eletrospray... 31
1.4.6. Avaliação de especificidade de aminoácidos livres e aminoácidos derivatizados por n-butanol ... 33
1.4.6.1. Derivatização de AAL e aquisição em Q1 ... 33
1.4.6.2. Estudo de fragmentação de AAL e AABE ... 33
1.4.7. Estudo de limite de detecção e limite de quantificação por Eletrospray utilizando padrões de aminoácidos em perda neutra e monitoramento de reações selecionadas ... 34
1.5. Resultados e Discussão ... 35
1.5.1. Estudo de eficiência de ionização por Eletrospray ... 35
1.5.2. Avaliação da formação de adutos e supressão de sinal de AAL ... 49
1.5.3. Planejamento experimental para otimização de condições de Eletrospray... 52
1.5.5. Estudo de limite de detecção e limite de quantificação por Eletrospray utilizando padrões de aminoácidos ... 68
Capítulo 2 – Exemplo de aplicação para análise de aminoácido por LC-MS/MS: estudo preliminar de supressão Iônica e recuperação de fenilalanina em amostra de dried blood spot ...
2.1. Introdução ... 74
2.1.1. Análise de aminoácidos na triagem neonatal ... 74
2.1.2. Importância da fenilalanina em triagem neonatal ... 75
2.2. Justificativa ... 76 2.3. Objetivo ... 76 2.4. Parte Experimental ... 77 2.4.1. Reagentes e Materiais ... 77 2.4.2. Preparo de Padrões ... 77 2.4.3. Preparo de Amostra ... 77
2.4.4. Estudo de Supressão Iônica de Phe em DBS ... 78
2.4.5. Estudo de Recuperação de Phe em DBS ... 78
2.5. Resultados e Discussão ... 79
2.5.1. Estudo de Supressão Iônica de Phe em DBS ... 79
2.5.2. Estudo de Recuperação de Phe em DBS ... 84
2.6. Conclusão ... 88
3. Conclusões Gerais ... 90
Referências bibliográficas ... 91
CAPÍTULO 1: Estudo e otimização da detectabilidade de aminoácidos em padrão por Eletrospray
1.1. Introdução
1.1.1. Aminoácidos: classificação e características físico-químicas
A bioquímica dos aminoácidos é complexa e interdependente1-2. Os aminoácidos têm muitas funções no metabolismo, servindo para a construção de peptídeos e proteínas, precursores de mediadores hormonais e outras moléculas funcionais, e também como fonte de produção de energia3-4. Uma característica que distingue o grupo de metabólito de outros como lipídeos e carboidratos é o grupo amino4.
Os aminoácidos são compostos que apresentam, em sua molécula, um grupo amino (-NH2) e um grupo carboxila (-COOH); a única exceção é a prolina, que contém um grupo imino (-NH-) no lugar do grupo amino. Em pH fisiológico, esses grupos estão na forma ionizada: -NH3+ e -COO-. Os aminoácidos têm um átomo de hidrogênio e um grupo variável chamado cadeia lateral ou grupo R4.
Os aminoácidos individuais são classificados de acordo com diversos critérios, dois dos quais são especialmente importantes. O primeiro deles é a natureza polar ou apolar da cadeia lateral. O segundo depende da presença de um grupo ácido ou básico na cadeia lateral3-4.
Os aminoácidos podem ser divididos segundo suas cadeias laterais da seguinte maneira:
- Aminoácidos apolares, que contêm grupo R constituídos por cadeias com caráter de hidrocarbonetos e não interagem com água (glicina, alanina, valina, leucina, isoleucina, metionina, prolina, fenilalanina e triptofano)4-5,
- Aminoácidos polares são sub-classificados em três classes de acordo com a característica do grupo R em pH 7: aminoácidos básicos, com carga positiva (lisina, arginina, histidina); aminoácidos ácidos, carga negativa (aspartato e glutamato); e aminoácidos polares, sem carga (serina, treonina e tirosina)4-5.
Na Tabela 1 são apresentados os pKa’s dos aminoácidos para que a classificação através da polaridade das cadeias laterais e a evidência do grupo ácido ou básico na cadeia lateral auxilie na interpretação da sua classe. O valor do pH em que um ácido se apresenta 50% dissociado equivale ao seu pKa e constitui uma medida da sua força ácida: quanto maior for o valor do pKa, mais fraco será o ácido.
Os aminoácidos sem grupos carregados em suas cadeias laterais existem em solução neutra como zwitterions (anfóteros) sem nenhuma carga líquida. Um zwitterion tem tanto cargas positivas como negativas iguais, em solução, ele é eletricamente neutro4. O conceito de basicidade por Bronsted é definido como a tendência de uma molécula para aceitar um próton (B(g) + H+(g) BH+(g) G° = GB(B), -PA(B) ). A basicidade na fase gasosa é definida como o sinal negativo da variação de energia livre para a reação(-G° = H° - TS°) fornecendo a relação para a afinidade por próton (PA(B) = G(B) - TS°)5-6. Para uma dada espécie M, a afinidade
protônica é o negativo da variação de entalpia para a reação de protonação em fase gasosa a 298 K do tipo M + H+
[M + H]+ 7. Os valores das colunas nomeadas
Harrison e DFT (density functional theory) são cálculos de afinidade protônica em fase gasosa realizada por dois autores diferentes. Na Tabela 1 são também apresentados os valores de ponto isoelétrico.
Na Tabela 2 são comparadas as características físico-químicas entre os aminoácidos e o nível de similaridade entre os mesmos é categorizado de 5 (mais parecido) a 215 (mais diferente). A quantificação do grau de similaridade entre dois aminoácidos realizada na Tabela 2 é baseada em suas propriedades como polaridade, volume molecular e composição química, em que números maiores expressam menos similaridade. A tabela demonstra que os pares mais similares são: Leucina e isoleucina (5), metionina e isoleucina (10) e metionina e leucina (15). Os menos similares são cisteína e triptofano (215), cisteína e fenilalanina (205) e cisteína e lisina (202)8.
O pKa 1 dos aminoácidos é mais de duas unidades menor do que o dos ácidos carboxílicos comuns (pKa CH3COOH = 4,74), uma observação válida para todos os outros do grupo -amino-carbóxi. Esta diferença é uma consequência do efeito retirador de elétrons do grupo amino protonado. Quando a cadeia lateral do aminoácido tem outras funções ácidas ou básicas, o ponto isoelétrico aumenta ou diminui de acordo com as características dos substituintes4.
Tabela 1. Representação das nomenclaturas de aminoácidos, pKa’s do grupo amino, do grupo ácido e da cadeia lateral R de aminoácidos, ponto isoelétrico e basicidade em fase gasosa. Tabela adaptada de Marzzoco et al 3; Beilholder, et al 6.
Onde: DFT – Density Functional Thery – Resultados obtidos de Bleiholder, et al. ; PI – Ponto isoelétrico;
Aminoácido Sigla Letra Harrison kcal/mol
DFT
kcal/mol α−COOH α−NH3 Outro Radical (R) PI
Alanina Ala A 214.2 215.0 2,34 9,69 6,02
Arginina Arg R 2,17 9,04 12,48 (guanidino) 10,76
Ácido Aspártico Asp D 216.4 218.0 2,09 9,82 3,86 (carboxil) 2,97
Asparagina Asn N 220.6 224.2 2,02 8,80 5,41
Ácido Glutâmico Glu E 223.4 225.8 2,19 9,67 4,25 (carboxil) 3,22
Glutamina Gln Q 222.0 231.9 2,17 9,13 5,65
Cisteína Cys C 214.0 214.4 1,96 10,28 8,18 (sulfidril) 5,07
Cistina Cys2 1,65-2,26 7,85-9,85 5,06
Fenilalanina Phe F 219.9 220.6 1,83 9,13 5,48
Glicina Gly G 210.5 211.4 2,34 9,60 5,97
Histidina His H 231.5 233.7 1,82 9,17 6,00 (imidazol) 7,59
Hidroxilisina Hyl 2,13 8,62 9,67 (ε-amino) 9,15
Hidroxiprolina Hyp 1,92 9,73 5,83
Isoleucina Ile I 218.6 218.7 2,36 9,68 6,02
Leucina Leu L 217.4 218.2 2,36 9,60 5,98
Lisina Lys K 235.6 237.3 2,18 8,95 10,53 (ε-amino) 9,74
Metionina Met M 221.1 224.0 2,28 9,21 5,75
Prolina Pro P 222.1 224.0 1,99 10,60 6,30
Serina Ser S 215.2 217.3 2,21 9,15 5,68
Tirosina Tyr Y 220.9 221.2 2,20 9,11 10,07 (fenol) 5,66
Treonina Thr T 219.5 218.7 2,63 10,43 6,53
Triptofano Trp W 223.9 223.8 2,38 9,39 5,66
Tabela 2. Comparação das características físico-químicas entre os aminoácidos. Tabela adaptada de Grantam et al 8.
1.1.2. Análise de aminoácidos e detectabilidade do sinal analítico
As abordagens para análise de aminoácidos são diversas. Uma longa lista de métodos para análise destas moléculas tem sido publicada nos últimos 50 anos9, demonstrando a particularidade e dificuldade das análises destes compostos. Os aminoácidos são compostos importantes em diversas áreas, destacando-se sua importância nas análises da área de diagnóstico clínico, de alimentos e de produtos naturais10-23.
Segundo a IUPAC (2013), o limite de detecção do método é dado como a menor quantidade de material detectável numa matriz em relação à quantidade de material analisado. O significado de detectável deve ser especificado com um critério. É importante destacar que a detecção do método não é a sensibilidade do mesmo, pois este é um parâmetro relacionado à inclinação da curva analítica24. O limite de detecção do método depende da relação entre a magnitude do sinal analítico e a dimensão das flutuações estatísticas no sinal do branco. Isto é, a menos que o sinal analítico seja maior do que branco por um múltiplo k devido a erros aleatórios do branco, é impossível detectar o sinal analítico com certeza. Assim, à medida que o
R L P T A V G I F Y C H G N K D E M W 110 145 74 58 99 124 56 142 155 144 112 89 68 46 121 65 80 135 177 S 102 103 71 112 96 125 97 97 77 180 29 43 86 26 96 54 91 101 R 98 92 96 32 138 5 22 36 198 99 113 153 107 172 138 15 61 L 38 27 68 42 95 114 110 169 77 76 91 103 108 93 87 147 P 58 69 59 89 103 92 149 47 42 65 78 85 65 81 128 T 64 60 94 113 112 195 86 91 111 106 126 107 84 148 A 109 29 50 55 192 84 96 133 97 152 121 21 88 V 135 153 147 159 98 87 80 127 94 98 127 184 G 21 33 198 94 109 149 102 168 134 10 61 I 22 205 10 116 158 102 177 140 28 40 F 194 83 99 143 85 160 122 36 37 Y 174 154 139 202 154 170 196 215 C 24 68 32 81 40 87 115 H 46 53 61 29 101 130 Q 94 23 42 142 174 N 101 56 95 110 K 45 160 181 D 126 152 E 67 M
limite de detecção é aproximado, o sinal analítico e seu desvio padrão se aproximam do sinal do branco (Sb1) e de seu desvio padrão (Ssb1). O sinal analítico mínimo distinguível (LD) é então tomado como a soma do sinal do branco médio (mSb1) mais um múltiplo k do desvio padrão do branco (Ssb1)25.
Experimentalmente o valor médio do branco pode ser definido por um protocolo experimental de medidas, preferencialmente em um período longo de tempo. Os resultados devem ser tratados estatisticamente para se obter Ssb1. São numerosas alternativas para se obter o valor de k. Existem autores que indicam estatísticas dos testes t enquanto outros recomendam utilizar o valor de 3 como um número razoável para dar segurança ao valor do LD26-27.
Existem estratégias analíticas com modificações na estrutura dos aminoácidos para possibilitar melhor detectabilidade na análise por diferentes técnicas. Em espectrometria de massas com fonte Eletrospray, as modificações nos AAL não são realizadas porque há incompatibilidade da estrutura destas moléculas com a técnica, mas para melhorar a detectabilidade dos analitos, diminuindo os limites de detecção dos métodos.
Há vários interferentes que podem diminuir a estabilidade do sinal analítico em um instrumento, como a calibração28, interferência de matriz e baixas concentrações de analitos que possuem baixa eficiência de detecção na técnica de interesse29-35. A modificação de moléculas através de reações denominadas derivatizações são muito comuns em diversos contextos para o aumento da detectabilidade. Em toxicologia, por exemplo, onde as amostras são de matrizes complexas e as concentrações de analitos são baixas, os desafios da detectabilidade são interessantes e amplamente explorados na literatura29-35.
A análise de aminoácidos foi primeiramente desenvolvida por Moore e Colaboradores36 nos anos 50 para determinar a quantidade de aminoácidos presentes em proteínas puras. O método usava HCl 6 mol L-1 para promover uma hidrólise ácida, em um ambiente livre de oxigênio em temperatura de 100°C por 22 horas liberando os aminoácidos das proteínas. Na sequência, o método utilizava uma cromatografia por troca iônica e os aminoácidos eram detectados e quantificados utilizando uma derivatização pós-coluna com ninidrina (Figura 1A)36-37. Métodos mais atuais utilizam outras derivatizações para posterior análise por cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC), destacando-se os reagentes
pré-coluna por OPA (ortho phthalaldehyde) (Figura 1B) e FMOC (fluorenylmethoxy chloroformate) (Figura 1C). Estas derivatizações reduzem a polaridade e aumentam o tempo de retenção das espécies, permitindo uma melhor separação em fase reversa. Além disso, as espécies derivatizadas aumentam sua sensibilidade nos detectores de UV e fluorescência. Estes métodos normalmente são realizados em mais de 15 minutos de análise (podem chegar a 7 minutos com colunas e sistemas específicos de Rapid Resolution) e são capazes de detectar mais de 15 aminoácidos distintos, atingindo concentrações em mol.mL-1 38.
Em espectrometria de massas, existem diversas abordagens na análise de aminoácidos. Por GC-MS (cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massas), foram realizadas aquisições e comparações de métodos por impacto de elétrons e ionização química39, além de também ser utilizada a quantificação usando padrão externo (por exemplo, através de nor-leucina ou metionina sulfona)40 e comparações com a utilização de padrões internos marcados41. Entretanto, a abordagem de análise de aminoácidos por GC-MS, sempre exigiu a modificação das moléculas antes da injeção para proporcionar a volatização destas espécies que são bem polares. Na análise de aminoácidos por MS ou MS/MS a reação de alquilação dos aminoácidos é usualmente empregada.
Figura 1. Reações de derivatização utilizadas para cromatografia por troca iônica com (A) ninidrina e em cromatografia líquida com (B) OPA e (C) FMOC. Em GC-MS, através de sililação e acetilação, os AALs podem ser analisados através de sua forma derivatizada com TMS-TFA42. Figura adaptada de Rutherfurd et al 42.
Com o desenvolvimento de novas tecnologias na ionização de moléculas, como o surgimento da ionização por Eletrospray em 198443, houve possibilidade da análise destes compostos sem a necessidade de derivatização para que os aminoácidos pudessem ser volatilizados diretamente a partir da solução. O uso da espectrometria de massas passou a facilitar a análise dos aminoácidos por sua especificidade intrínseca à técnica além de não exigir, necessariamente, a derivatização no preparo de amostras para a detecção das espécies, apesar de muitos métodos desenvolvidos por MS utilizarem a derivatização44-45.
Na evolução dos métodos apresentados para a análise de aminoácidos no contexto de diagnóstico clínico, as abordagens por flow injection analysis com fonte Eletrospray e cromatografia líquida acoplada a detector de massas do tipo triplo quadrupolo são bem variadas, inclusive com a incorporação de outros marcadores interessantes para diagnóstico46-47. As abordagens que possibilitem as análises de aminoácidos sem a necessidade da derivatização destas moléculas são mais raras
de serem aplicadas, pois a reação em meio ácido com n-butanol melhora os limites de detecção e minimiza os efeitos de supressão iônica48. Entretanto, métodos que analisam aminoácidos livres possuem a estratégia analítica de incluir separações cromatográficas49 que acabam aumentando o tempo de análise e tornando o método menos viável para rotina analítica com o objetivo de triagem.
Atualmente muitos laboratórios clínicos têm utilizado um método que utiliza uma reação de esterificação de aminoácidos com a extração dos analitos do papel filtro com metanol e análise da amostra em um espectrômetro de massas, através de método de aquisição por SRM ou NL. Muitos destes laboratórios utilizam os testes comerciais para preparo de amostra e também softwares já configurados para facilitar a aquisição de dados. Entre os métodos comerciais avaliados, destaca-se o kit comercial Neobase® non-derivatized50, que realiza o teste com preparo simples de amostras e sem a necessidade de derivatização. O tempo de análise por amostra utilizando metodologias FIA-MS/MS (do inglês flow injection analysis) é de cerca de 1 minuto, possibilitando uma rotina analítica com grande quantidade de diagnósticos por dia.
Figura 2. Reação de derivatização utilizada em análises clínicas. O n-butanol é adicionado em meio ácido para uma reação de esterificação do aminoácido em seu grupo ácido carboxílico.
1.1.3. Espectrometria de massas com fonte de ionização Eletrospray
A espectrometria de massas é uma das mais importantes ferramentas analíticas disponíveis aos cientistas, pois é capaz de fornecer informação sobre: i) a composição elementar de amostras; ii) a estrutura molecular; iii) a composição qualitativa e quantitativa de misturas complexas; iv) a estrutura e a composição de superfícies sólidas; v) as proporções isotópicas de átomos em amostras. Tudo isso deve-se a recentes avanços em instrumentação e no desenvolvimento de novas técnicas de ionização. Existente há quase um século, a MS é uma técnica analítica
que permite discriminar íons de acordo com a relação massa/carga (m/z) de cada espécie analisada51.
Como a MS não analisa átomos neutros ou moléculas neutras antes de discriminar os íons é necessário gerá-los, utilizando um sistema de ionização ou fonte de íons. A versatilidade da técnica de espectrometria de massas com fonte de ionização por ESI é abrangente. ESI é uma técnica de ionização suave que promove a mínima fragmentação dos analitos, tendo como uma de suas vantagens facilitar a identificação do íon molecular da espécie de interesse. Além disso, a suavidade do processo de ESI traduz a seletividade em termos de quais espécies estarão carregadas e o quão eficientemente as mesmas recebem carga. Dentre os parâmetros que são importantes quanto à eficiência da ESI destaca-se a ionização das espécies de acordo com o pKa e pH da solução, formação de adutos, processos eletroquímicos na fonte, competição e supressão de sinal, transferência de próton na fase gasosa, efeitos de nebulização e vazão de fase móvel e formas de aquisição (modo positivo e modo negativo)52.
Em ESI (Figura 3), o líquido no qual o analito de interesse se encontra dissolvido (na fase móvel, no caso do eluente ser proveniente da injeção de um cromatógrafo líquido) passa através de um capilar, à pressão atmosférica, mantido sob alta voltagem. Na saída do capilar são formadas pequenas gotas altamente carregadas (spray) que são dessolvatadas ao se deslocarem em sentido contrário ao posicionamento de um eletrodo em uma região de pressão atmosférica. A dessolvatação é assistida por um fluxo contínuo de gás seco (geralmente N2) na região do spray. À medida que ocorre a dessolvatação, o tamanho das gotas é reduzido até o ponto em que a força de repulsão entre as cargas similares fica maior que as forças de coesão da fase líquida (tensão superficial). Neste momento, ocorre a chamada “explosão coulômbica”, que gera gotas com tamanhos equivalentes a 10% do tamanho das gotas a partir das quais se originaram. Uma série de explosões passa a ocorrer até que são produzidos íons do analito a partir destas gotas os quais são transferidos para o interior do espectrômetro de massas por uma série de dispositivos de focalização53.
Figura 3. Em ESI-MS, a solução diluída do analito é bombeada através um capilar a uma baixa vazão (~ 3 a 10 mL.min-1). Uma alta tensão (2-5 kV) é aplicada ao capilar. Esta tensão pode ser negativa ou positiva, dependendo dos analitos escolhidos53. Figura adaptada de Cech et al 53.
1.1.4. Fundamentos de LC-MS/MS
Após a introdução da amostra e ionização das moléculas, as espécies são analisadas pela m/z. O espectrômetro de massas utilizado neste trabalho para análise de aminoácidos foi do tipo de analisador triplo quadrupolo, onde são colocados três analisadores de massas do tipo quadrupolo em sequência.
O quadrupolo é constituído de 4 hastes. Os pares opostos das hastes estão conectados eletricamente e uma voltagem com radiofrequência de 180° fora de fase é aplicada entre eles. Em um valor específico de voltagem, íons de uma determinada m/z atravessam o quadrupolo descrevendo uma trajetória estável54.
Este instrumento é constituído por três quadrupolos em série, sendo que o segundo quadrupolo não é utilizado para separar íons de mesma m/z, mas sim como cela de colisão, na qual ocorre a fragmentação dos íons selecionados no primeiro quadrupolo (Q1), geralmente por dissociação induzida por colisão com um gás inerte (collision-induced dissociation) – CID (Q2), e também é empregado como direcionador dos íons produzidos ao terceiro quadrupolo (Q3). Na CID, o íon
precursor proveniente do primeiro quadrupolo é acelerado por um potencial elétrico para uma região de alto vácuo no interior do segundo quadrupolo, onde sofre repetidas colisões com um gás inerte de elevada energia (geralmente Ar, He ou N2), o que leva a um aumento na energia potencial deste íon até ocasionar sua fragmentação, conduzindo à formação dos íons produto. Quando a CID é configurada em baixa energia, as reações de fragmentação levam geralmente à perda de fragmentos neutros (H2O, MeOH, CO, CO2 etc.), dependendo da natureza do íon precursor. Esta perda de fragmentos neutros é muito importante na determinação estrutural da molécula do analito, uma vez que fornece informações de grupos funcionais presentes na molécula. Quando a CID é realizada sob elevada energia, as reações de fragmentação geram informações estruturais mais significativas, uma vez que pode levar à quebra das moléculas em posições características. Além de informações estruturais, a CID pode melhorar a detectabilidade do método quando usada para gerar um íon característico de uma molécula e, assim, realizar sua detecção a partir deste íon fragmento quando a molécula do analito de interesse se encontra em presença de outras moléculas de mesma massa molar nominal, uma vez que reduz o ruído e aumenta a detectabilidade. Todos os quadrupolos são controlados para transmitir íons de uma única m/z ou de um intervalo de m/z para gerar informação analítica mais exata55.
Figura 4. Diagrama esquemático de um sistema de um analisador de massas do tipo triplo quadrupolo.
Existem algumas formas de se operar um espectrômetro de massas do tipo triplo quadrupolo, sendo elas: varredura do íon produto (do inglês product-Ion scan), varredura do íon precursor (do inglês precursor Ion Scan), PN e MRS. Além disso, o instrumento triplo quadrupolo pode operar também em modo Scan, onde somente
um dos quadrupolos filtra uma faixa de massa e o outro opera em modo de orientação dos íons, sem seleção com base em sua relação m/z54.
Para análise de aminoácidos em sangue o recomendado pela Clínica Mayo é a operação do triplo quadrupolo em modo NL ou SRM56, uma vez que estes modos de operação contribuem para melhores valores de sinal/ruído e favorecem a quantificação57.
No modo perda neutra, os dois espectrômetros de massas fazem uma varredura em conjunto, porém com uma diferença constante de massa entre os dois. Assim, para uma diferença de massa a, quando um íon de massa m atravessa o primeiro quadrupolo, a detecção ocorre se o íon tiver formado um íon com m/z de m-a. No modo SRM, a detecção ocorre quando se monitora a fragmentação de vários íons precursores simultaneamente. No modo SRM tanto o primeiro como o terceiro analisador de massas estão com massas selecionadas e não ocorre varredura (scan). Neste modo de aquisição, o íon selecionado no MS1 é somente detectado se ele produzir um determinado fragmento, selecionado por uma reação específica. A ausência do modo scan permite que os analisadores fiquem mais tempo focados em massas de precursores e fragmentos especificados no método de análise, permitindo, assim, aumento da detectabilidade54.
1.2. Justificativa
Os obstáculos e diversas abordagens desenvolvidas para análise de aminoácidos em diversos tipos de matrizes permitem inferir que as análises de aminoácidos não sejam triviais. Os aminoácidos possuem características especiais que devem ser estudadas individualmente, pois as mesmas podem interferir diretamente no método analítico de escolha. Apesar de métodos de diagnósticos clínicos serem consagrados com procedimentos específicos para derivatização e aquisição de dados por espectrometria de massas, ainda existem diversas questões em nível analítico e também de características físico-químicas dos aminoácidos que são interessantes de serem estudadas.
1.3. Objetivos
Esse trabalho tem como objetivo principal avaliar e otimizar diferentes fatores que podem interferir na ionização e na detectabilidade de aminoácidos livres em fonte ESI. Para esta avaliação, foram abordados os seguintes itens:
- Condições de fonte ESI em sistema LC-MS/MS: Verificar quais fatores instrumentais e de solução podem interferir em cada aminoácido, além de configurar a melhor condição para detectabilidade de 24 aminoácidos;
- Eficiência de ionização entre os aminoácidos: avaliar quais os aminoácidos que possuem maior dificuldade de ionização e como fatores relacionados aos cátions podem interferir no processo (supressão iônica e formação de adutos);
- Avaliação da seletividade do método SRM para aminoácidos livres e aminoácidos derivatizados: Para verificar a seletividade do método de SRM foram comparadas interferências de aminoácidos livres e derivatizados por modo de varredura de íons produto, com objetivo de avaliar se existem fragmentos diferentes e específicos para isóbaros, permitindo um método mais seletivo com derivatização do que aquele com aminoácidos livres. Este experimento não foi realizado com o objetivo de validar o método, mas sim de verificar se há ganho em seletividade com a modificação da molécula antes da sua fragmentação;
- Avaliação de limites de detecção e quantificação do método: verificar os valores mínimos detectáveis no método de SRM e NL, avaliando qual possui menor valor para trabalhar com aminoácidos livres.
1.4. Procedimento Experimental 1.4.1. Reagentes e Materiais
Metanol grau HPLC, acetonitrila grau HPLC, n-butanol com ácido clorídrico 3 mol L-1, ácido fórmico (49-51%), acetato de sódio (99,95%), acetato de lítio (99%),
acetato de potássio (99%), acetato de amônio (98%), hidrazina e hidróxido de amônio foram adquiridos da Sigma Aldrich (St. Louis, MO, EUA). A água ultra pura 18,2 MΩ.cm a 25 °C foi obtida de um instrumento Mili-Q® . Os AAL utilizados são da marca Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, EUA) e foram disponibilizados pelo Laboratório ThoMSon de Espectrometria de Massas, do Prof. Dr. Marcos Eberlin para Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Glu, Gln, Gly, His, Iso, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr, Val, Orn, Cit, Cys2 e Hyp. Os aminoácidos foram diluídos em solução metanol: água (1:1) com concentrações entre 0,5-15 mmol.L-1 para definir as soluções estoque (SE) armazenadas a -20ºC com validade de 6 meses. Posteriormente, foram preparadas as soluções trabalho (ST) diluídas em metanol e as concentrações estabelecidas variaram entre 500-4500 nmol L-1, conforme Tabela 3, armazenadas a de 5-8ºC com validade de 1 mês.
Tabela 3. Concentração de AAL utilizados para realizar testes em FIA-ESI-MS/MS.
1.4.2. Instrumentação e tratamento de dados
As análises foram conduzidas em um espectrômetro de massas híbrido triploquadrupolo/ Ion Trap linear 5500 QTRAP® (SCIEX, Ontário, Canadá) equipado com fonte ESI por infusão direta e FIA-MS ou FIA-MS/MS. As aquisições foram realizadas e os dados tratados com o software Analyst ® versão 1.6.1. Os dados obtidos dos planejamentos de experimentos foram tratados no Excel 2010 e no software Design Expert® (versão 10).
Ala 89,0935 A7627 C3H7NO2 0,01299 14,58 7 1000 Arg 174,2017 A5131 C6H14N4O2.HCl 0,00860 82% 3,37 22 750 Asn 132,1184 A0884 C4H8N2O3 0,00684 5,18 14 750 Asp 133,1032 A9256 C4H7NO4 0,00669 5,03 15 750 Cit 175,1857 C7629 C6H13N3O3 0,00868 4,95 15 750 Cys 121,1590 C1276 C3H7NO2S.HCl 0,00615 77% 3,00 50 1500 Cys2 240,2800 C8755 C5H12N2O4S2 0,01201 0,50 150 750 Gln 146,1451 G3126 C5H10N2O3 0,00751 5,14 10 750 Glu 147,1299 G1251 C5H9NO4 0,00735 5,00 15 750 Gly 75,0669 G7126 C2H5NO2 0,01094 14,58 31 4500 His 155,1552 H8125 C6H9N3O2.HCl.H2O 0,00790 74% 2,79 27 750 Hyp 131,1300 H5534 C5H9NO3 0,00722 5,51 18 1000 Ile 131,1736 I2752 C6H13NO2 0,00660 5,03 10 500 Leu 131,1736 L8000 C6H13NO2 0,00656 5,00 10 500 Lys 146,1882 L5626 C6H14N2O2.HCl 0,00738 80% 3,23 23 750 Met 149,2124 M9625 C5H11NO2S 0,00773 5,18 14 750 Orn 132,1610 O2375 C5H12N2O2.HCl 0,00670 78% 3,11 40 1250 Phe 165,1900 P2126 C9H11NO2 0,00812 4,92 15 750 Pro 115,1310 P0380 C5H9NO2 0,00586 5,09 10 500 Ser 105,0930 S4500 C3H7NO3 0,00532 5,06 20 1000 Thr 119,1197 T8625 C4H9NO3 0,00621 5,21 14 750 Trp 204,2262 T0254 C11H12N2O2 0,01018 4,98 15 750 Tyr 181,1894 T3754 C9H11NO3 0,00932 5,14 19 1000 Val 117,1469 V0500 C5H11NO2 0,00579 4,94 15 750 Onde:
CSE (mmol.L-1) ALSE (L) CST (nmol.L-1)
AA MM (g.mol-1) PN FM / FMS MP (mg) FCS
AA= Aminoácido; MM= Massa molecular; PN= Part number do padrão utilizado; FM/FMS = Fórmula molecular / Fórmula molecular do sal
MP= Massa pesada de cada aminoácido em mg; FCS= Fator de correção do sal;
CSE= Concentração da solução em estoque; ALSE= Alíquota utilizada da solução estoque para ST; CST=Concentração da solução de trabalho
1.4.3. Estudo de Ionização de AAL
O estudo de ionização de AAL foi realizado através de um método infusão direta com vazão de 7 L.min-1 das ST dos aminoácidos com adição de 0,1% (v/v) de ácido fórmico, 0,1% (v/v) de hidrazina ou 0,1% (v/v) de hidróxido de amônio. Os padrões e aditivos foram diluídos em metanol, acetonitrila, metanol:água (80:20) e acetonitrila:água (80:20). As concentrações de AAL utilizadas estão descritas na Tabela 3. Os espectros de massas (modo scan em Q1) foram adquiridos em modo positivo e modo negativo nas faixas de massas de m/z 75-240. Foram acumulados 10 scans no período de aquisição do espectro com taxa de scan de 10 Da/s. Na fonte foram configurados os parâmetros de curtain gas (CUR) em 10 psi, ion source gas 1 (GS1) em 20 psi, ion spray voltage (IS) em 3,50 kV e ion source gas 2 (GS2) em 10 psi. Estes valores foram inicialmente utilizados conforme recomendações em manual do fabricante e testes univariados que demonstraram boa intensidade dos AAL.
1.4.4. Estudo de formação de adutos e supressão de sinal de AAL
Os AAL foram diluídos em solvente (Metanol em 0,1% (v/v) ácido fórmico) conforme concentrações descritas na Tabela 3 em quatro soluções com as concentrações de 5 mmol L-1 de acetato de lítio, acetato de potássio, acetato de amônio e acetato de sódio. Foram realizadas as análises por infusão direta como descrito no item 1.4.3 e adquiridos dados em faixa de m/z 70-290 para adutos e m/z 75-240 para AAL.
1.4.5. Planejamento experimental para otimização de condições de Eletrospray Foi realizado um planejamento experimento fracionado 29-4 com ponto central conforme Figura 5, para avaliar os efeitos significativos na resposta da ionização dos AAL com a fonte ESI.
Figura 5. Planejamento 29-4 para avaliação exploratória de efeitos significativos para fonte na análise de aminoácidos livres em modo positivo. (a) Efeitos estudados na fonte ESI. (b) Perfil dos espectros de massas adquiridos em Q1 para AAL. (c) Valores codificados de 33 experimentos realizados para avaliação exploratória da fonte.
Após a realização do planejamento fracionado, um planejamento experimento completo 26 com ponto central foi realizado para otimizar as respostas utilizando somente os efeitos significativos encontrados no planejamento fracionado. A otimização foi realizada utilizando os quatro aminoácidos com menor eficiência de ionização em solvente metanol:água com 0,1% (v/v) de ácido fórmico.
1.4.6. Avaliação de especificidade de aminoácidos livres e aminoácidos derivatizados por n-butanol
1.4.6.1. Derivatização de AAL e aquisição em Q1
O protocolo adotado foi o mesmo praticado pelo laboratório de triagem nacional neonatal do Uruguai. Foi montado um mix de estoque com os AAL de modo a obter as concentrações descritas na tabela 3 (CSE) após diluição final. Foram adicionados em um vial de 1,5 mL ocupando o volume de 145 L do Mix. O volume de 145 L foi seco a 60º C por 30 minutos em concentrador a vácuo da Eppendorff. Foram adicionados 60 L do n-butanol com 3 mol L-1 de ácido clorídrico e deixou-se a 60°C por 15 minutos com auxílio de agitação para o processo de derivatização e formação dos AABE. O excesso de derivatizante foi seco a 60°C por aproximadamente 1 hora sob vácuo. Após resfriar, os AABE foram ressuspendidos em 1000 µL de metanol e após homogeneização foram transferidos para balão de 25 mL com metanol afim de se obter a concentração da solução trabalho especificada na Tabela 3. O mix foi injetado em modo infusão direta e avaliado os fragmentos conforme item 1.4.6.2.
1.4.6.2. Estudo de fragmentação de AAL e AABE
Foram realizados testes em MS2 para identificação de fragmentação dos AAL e AABE, através da otimização de energia de colisão para cada espécie de aminoácidos. A porcentagem de 20 a 30% do íon molecular (M+H+) foi mantido em cada espectro obtido em MS2 para padronização. Neste experimento, o primeiro quadrupolo (Q1) seleciona um determinado íon com a m/z de interesse, fragmentado na cela de colisão (CID) e os fragmentos são conduzidos no terceiro quadrupolo (Q3). Foram empregadas rampas de energia de colisão (CE) de 15 a 40 eV com energia de saída do segundo quadrupolo (CXP) padronizadas em 5 eV. As condições da fonte estão descritas em item 1.4.3 e foram adquiridos 50 scans de cada transição. Os isômeros e isóbaros de AAL e AABE foram adquiridos individualmente para avaliação de fragmentação de cada espécie sem a
possibilidade da co-eluição que ocorre em equipamentos de resolução unitária como o triploquadrupolo.
1.4.7. Estudo de limite de detecção e limite de quantificação por Eletrospray utilizando padrões de aminoácidos em perda neutra e monitoramento de reações selecionadas
Foram realizados testes de limite de detecção e limite de quantificação para avaliação dos métodos desenvolvidos em NL e SRM em solventes MeOH e MeOH:H2O (80:20). O método de SRM utilizou os fragmentos obtidos conforme item 1.4.6.2 e as energias de CXP, DP e CE foram otimizadas pelo software Analyst®. Todas as condições otimizadas no método SRM referente às voltagens foram transferidas para o método em NL. As condições da fonte ESI foram otimizadas conforme item 1.4.5. Foram acumulados 48 scans no período de aquisição do espectro com taxa de scan de 10 Da/s. Na fonte foram configurados os parâmetros de curtain gas (CUR) em 10 V, ion source gas 1 (GS1) em 30 psi, ion spray voltage (IS) em 3,50 kV, ion source gas 2 (GS2) em 20 psi e temperatura (Temp) em 250°C. Foram padronizados 48 ciclos de aquisição para ambos os métodos. O dwell time do método de SRM aplicado foi de 300 ms e o tempo de ciclo de 6,41 s. O método de NL foi realizado para as perdas de 46 Da, 63 Da e 105 Da. O tempo do ciclo do método de NL foi de 0,61 s, cada 5 scans somados e uma taxa de aquisição de 1000 Da/s.
Foram realizadas leituras de 7 brancos em cada método e o desvio padrão calculado. O LD e o LQ foram calculados utilizando as seguintes expressões conforme guia de Validação do INMETRO58:
LD = X + t(n-1, 1-a).s Equação 1 LQ = X + 10.s Equação 2 Onde:
X = média dos valores dos brancos dos padrões (somente solvente); t = distribuição de Student com o valor de 6 graus de liberdade e 95% de confiança;
As concentrações dos analitos utilizadas para realização do cálculo de LD e LQ foram estimados como 3 e 10 vezes o valor do branco no canal do SRM específico ou na NL. Por exemplo, a média de três brancos para o canal da Gly foi de 56,67 de altura no XIC. A concentração utilizada inicialmente na solução de Gly era 4500 nmol L-1. Através de uma relação de proporcionalidade, concluiu-se que para chegar a uma resposta 10 vezes superior ao branco da Gly, era necessária uma concentração de 3282 nmol L-1. Esta nova solução foi injetada dez vezes e a média utilizada como referência para estimativa de concentrações de LD e LQ conforme
Equação 1 e Equação 2. Os coeficientes de variação encontrados das 10 injeções
dos padrões dos aminoácidos utilizados como referência foram menores que 20%.
1.5. Resultados e Discussão
1.5.1. Estudo de eficiência de ionização por Eletrospray
A análise de biomoléculas por MS requer uma compreensão das reações de transferência de prótons porque duas técnicas de ionização mais comumente usadas, dente elas inclusive a que foi utilizada no experimento, ESI e MALDI envolvem a adição e remoção de prótons para que a ionização seja possível. A avaliação das reações de transferência de prótons em fase gasosa fornece uma visão diferenciada para as estruturas dos aminoácidos, pois a alteração do estado de protonação pode impactar nas ligações de hidrogênio na molécula. Este fato pode afetar os padrões das intensidades dos íons por ESI e não refletir necessariamente a quantidade de íons em solução aquosa.
O pKa permite prever a relação de espécies ionizadas por aquelas sem carga presentes em solução de acordo com o pH do meio através da equação de Henderson-Hasselbalch (Equação 3).
pH = pKa + log [base conjugada]/[ácido conjugado] Equação 3
A Figura 6 demonstra o perfil de espectro de massas de 24 AALs adquirido em Q1 por ESI (+). A Figura 7 mostra a média de três medidas de infusão direta da mistura de AAL da Tabela 3 que descreve as concentrações de cada analito. Os resultados demonstram que a aquisição em modo positivo com metanol promove
uma maior detectabilidade dos aminoácidos. A acetonitrila é um solvente aprótico e, sem o aditivo doador de prótons, não favorece a formação de espécies carregadas positivamente. O modo negativo possui uma menor eficiência do que os resultados obtidos em modo positivo. Apesar disso, o modo negativo pode ser vantajoso de ser utilizado porque em alguns casos ele pode promover um espectro com menor ruído do que espectros adquiridos em modo positivo. Uma das principais diferenças entre modo positivo e negativo é o aumento do comportamento da descarga corona quando uma voltagem negativa é aplicada. Este é um fenômeno que proporciona maior ionização da atmosfera ao redor do capilar do spray, que leva à formação de uma variedade de produtos detectáveis. Estes íons formados podem complicar o espectro de massas e diminuir os sinais da espécie de interesse. Outra diferença entre as formas de aquisição é o fato de que pode ocorrer redução na fonte em modo negativo. No modo positivo em ESI as espécies que oxidam no capilar são metais e os cátions do metal produzidos são pouco detectáveis pela técnica. Entretanto, as espécies que sofrem redução na fonte ESI não são os metais de contato, porque eles não podem ser reduzidos novamente. Em altas concentrações, as espécies reduzidas podem ser os analitos, mas para as análises típicas em ESI-MS, onde as concentrações são baixas, as espécies que predominante sofrem redução são as moléculas de solvente ou aditivo presente no solvente52. Verifica-se que há desvantagem neste caso para a produção de espécies carregadas negativamente dos aminoácidos, pois ocorre redução de outras espécies com as concentrações baixas empregadas para a verificação da eficiência de ionização dos aminoácidos.
Figura 6. Perfil de espectro de massas de 24 AALs adquirido em Q1 por ESI (+).
Figura 7. Eficiência de ionização dos aminoácidos em metanol e acetonitrila em modo positivo [M+H] (+) e modo negativo [M-H] (-) por infusão direta ESI-MS da mistura de AAL. As barras representam o intervalo de confiança de 3 medidas realizadas. Para estimativa do intervalo de confiança indicado pelas barras considerou-se a ausência de erros sistemáticos e que s não é uma boa aproximação de nível de confiança aplicado foi de 95% com valor de t igual a 4,359.
A Figura 8 mostra a comparação de aminoácidos adquiridos em diferentes solventes com adição de 0,1% (v/v) de ácido fórmico em modo positivo. O aumento da acidez desloca o equilíbrio dos zwitterions para a forma protonada, o que promove melhor detectabilidade em modo positivo se comparado com os resultados obtidos sem aditivos. A adição de água (20%) em metanol diminui a detectabilidade de todos os aminoácidos, enquanto que aumentou o sinal em treze dos aminoácidos diluídos em acetonitrila. Como a água é menos volátil que o metanol, este fator pode influenciar na eficiência da secagem das gotas na formação dos íons. Quando o solvente orgânico utilizado é a acetonitrila, como esta é um solvente aprótico, a água para alguns aminoácidos pode auxiliar na transferência do próton e em outros prejudica na secagem da gota.
Figura 8. Eficiência de ionização dos aminoácidos em metanol, acetonitrila, metanol:água (80:20) e acetonitrila:água (80:20) com adição de 0,1% (v/v) ácido fórmico por infusão direta ESI-MS em modo positivo. As barras representam o intervalo de confiança de 3 medidas realizadas. Para estimativa do intervalo de confiança indicado pelas barras considerou-se a ausência de erros sistemáticos e que s não é uma boa aproximação de nível de confiança aplicado foi de 95% com valor de t igual a 4,359.
A Figura 9 demonstra resultados obtidos em modo positivo com adição de aditivos básicos. Os dois aditivos utilizados foram o hidróxido de amônio (aditivo mais comum para ESI(-)) e a hidrazina, que é uma molécula que possui propriedade de base de Lewis. A hidrazina é uma molécula utilizada em testes de triagem
neonatal na fase móvel de métodos de ESI-MS com o objetivo de derivatizar a succinilacetona, um metabólito importante para determinar a doença tirosinemia tipo I. A escolha da hidrazina foi feita com o objetivo de verificar o comportamento dos aminoácidos livres com uma base de Lewis na fase móvel e a alteração na detectabilidade dos AAL em comparação com adição de ácidos. A adição de hidróxido de amônio e de hidrazina nos solventes não promoveu um aumento de resposta no modo negativo. A porção de água adicionada ao metanol com os diferentes aditivos possui o pH ao redor de 10 na adição de hidróxido de amônio e 8 na adição de hidrazina. Os resultados de baixa ionização no modo negativo podem ser justificados conforme discussão da Figura 7.
Assim como a estrutura da cadeira lateral dos aminoácidos é importante para a formação da estrutura secundária das proteínas diferenciando-as em -hélice e -pregueada, esta mesma característica parece ser relevante para a ionização dos AAL em ESI-MS. Os diferentes aminoácidos variam de acordo com seu tamanho, formato, capacidade de formação de ligações de hidrogênio, características hidrofóbicas e reatividade química. Todas estas características podem influenciar na ionização em ESI-MS além de suas características de ácido e base, traduzidas através de seus respectivos pKa1, pKa2, pKaR.
Para iniciar a avaliação do grau de ionização dos AAL foram estudadas a classificação orgânica das cadeias laterais e respostas obtidas na Figura 9A e 9B. Ao avaliar a Gly, o AAL alifático mais simples, verificamos que este possui uma ionização deficiente por ESI-MS. Seu pKa1 e pKa2 (2,34; 9,60) não diferem em muito de um AAL que tem boa ionização, como a Met (2,28; 9,21), por exemplo. Por ser a menor molécula do grupo, o seu tamanho e a dificuldade em acomodar as cargas com outros grupos pode promover interações eletrostáticas do grupo amino carregado positivamente e do grupo carboxil carregados negativamente dificultando sua saída da gota para a fase gasosa. O aumento da cadeia lateral observado na Ala com um grupo metil, Val com cadeia lateral isopropílica, e da Leu com cadeia isobutila, parecem estabilizar melhor a carga no grupo amino e diminuir a concentração de carga positiva em um único grupo, que pode aumentar as interações intermoleculares.
Figura 9. A). Eficiência de ionização dos aminoácidos em metanol, com adição de 0,1% (v/v) de ácido fórmico, 0,1% (v/v) de hidrazina e 0,1% (v/v) de hidróxido de amônio por infusão direta ESI-MS em modo positivo. B). Apresentação de resultados de ionização por tipo de grupo de cadeia lateral dos aminoácidos: alifáticos, ácidos, amidas, aromáticos, grupos básicos (guanidino, imidazol e amina primária), hidroxil, imino e sulforados.
A interferência isobárica na m/z de 132 das espécies Hyp,Ile,Leu impossibilita a conclusão de que o aumento da cadeia alifática contribui para a eficiência da ionização.
O grupo dos AALs ácidos possuem ácidos mais fracos em sua cadeia lateral, sendo que o grupo ácido do Asp tem pKa de 3,86 e o da Glu de 4,25, do que o grupo ácido de sua cadeia principal (pKa ~ 2). Se compararmos com outros AALs que possuem sua cadeia lateral carboniladas com amidas com o objetivo de verificarmos se a carga negativa da cadeia lateral de Asp e Glu pode prejudicar a eficiência de ionização em modo positivo, é difícil inferir algo, pois ambas as amidas estão sofrendo interferência isobárica. Portanto, as respostas entre os tipos de cadeia lateral podem estar invertidas, ou seja, os aminoácidos com cadeia lateral com as amidas podem ter respostas menores de ionização do que os ácidos. A cadeia lateral com carga negativa de Glu e Asp podem interferir na eficiência de ionização, uma vez que é a carga formal líquida que é importante para a detecção do aminoácido. Se a amina estiver protonada e um dos ácidos carboxílicos estiver desprotonado, ou os dois desprotonados, a carga formal líquida pode ser zero ou negativa.
Os ácidos carboxílicos e as amidas têm duas estruturas que contribuem majoritariamente com a ressonância. A segunda estrutura é mais importante para as amidas do que para os ésteres ou ácidos carboxílicos já que o nitrogênio é menos eletronegativo do que o oxigênio e, portanto, tem mais capacidade de acomodar a carga positiva. Desta forma, as amidas apresentam os pontos de ebulição mais altos porque têm fortes interações dipolo-dipolo, uma vez que a estrutura contribuinte na ressonância com as cargas separadas contribui de maneira significativa com a estrutura total da substância60. Desta forma, pensando que a ESI é uma fonte de ionização que transfere as cargas já existentes em solução para a fase gasosa, caso as cargas tenham interações eletrostáticas mais fortes, elas terão menor tendência de serem expulsas da solução. Esta observação pode prejudicar a ionização de amidas.
O grupo dos aromáticos tem um perfil bem diferente entre os seus representantes: Phe, Tyr e Trp. Phe é puramente hidrofóbica, enquanto Tyr e Trp são mais polares porque possuem um grupo hidróxido e um grupo NH, respectivamente. O pKa1 e o pKa2 destes três aminoácidos não é muito diferente (Phe 1,83 e 9,13; Tyr 2,20 e 9,11; Trp 2,38 e 9,39), entretanto, o perfil deles de ionização em ESI pode ser diferente devido às interações intermoleculares que participam. O grupo fenil da Phe somente realiza interações hidrofóbicas, já a Tyr
