4. RESULTADOS
4.3 Análise comparativa de características fenotípicas de C parapsilosis, C.
4.3.2 Avaliação de crescimento em caldo hipertônico
As amostras de C. parapsilosis, C. orthopsilosis, C. metapsilosis e as cepas referência ATCCs, quando inoculadas em caldo hipertônico, ou seja, solução de cloreto de sódio 6,5%, e incubadas por 96 horas a 30º C, apresentaram crescimento satisfatório. Logo, em meios com alta concentração salina, as três espécies comportaram- se de forma semelhante.
4.3.3 Análise da micromorfologia
Estas mesmas amostras, quando submetidas a microcultivo em meio contendo ágar fubá com Tween-20 e incubadas a 30o C, foi observado que algumas cepas apresentavam pseudohifas curvas, outras pseudohifas retas, finas e pouco desenvolvidas, e, ainda, alguns isolados apresentavam pseudohifas mais desenvolvidas e alongadas (Figura 5). No entanto, essas características não demonstraram distribuição peculiar e consistente entre as espécies, não podendo, portanto, ser utilizadas como critério discriminatório na identificação de C. parapsilosis, C. orthopsilosis e C. metapsilosis.
4.3.4 Caracterização bioquímica pelo kit ID32 C
As 24 amostras de C. parapsilosis, 13 C. orthopsilosis, 4 C. metapsilosis e as cepas controle ATCCs, identificadas pela técnica de RAPD, foram avaliadas pelo sistema de caracterização bioquímica ID32 C (bioMérrieux, Marcy-I’Étoile, França), com a finalidade de obtermos os padrões de assimilação de fontes de carbono para cada uma destas espécies. Um total de 12 perfis de identificação foi gerado neste sistema, sendo que o mais prevalente foi o de número 5547350317, respondendo por 76% (19) dos isolados de C. parapsilosis e 42,8% (6) de C. orthopsilosis, incluindo suas respectivas cepas referência. As amostras de C. orthopsilosis apresentaram maior heterogeneidade de perfis, totalizando 6 (50%) destes. Nenhum perfil resultante da espécie de C. metapsilosis correspondeu aos encontrados pelos isolados de C. parapsilosis e C. orthopsilosis. Estes resultados estão descritos na Tabela 5.
Em relação às fontes de carbono testadas nesse sistema (Tabela 6), com exceção de: ácido láctico, celobiose, rafinose, ramnose, eritritol, melibiose, inositol,
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lactose, glucosamina que não foram assimilados por nenhum isolado, os demais açucares foram assimilados em menor ou maior porcentagem pelas amostras estudadas.
Foi possível observar que 60% (3/5) dos isolados de C. metapsilosis foram tolerantes a actidiona, que de acordo com os fabricantes do ID32 C, a porcentagem de reações positivas esperadas para amostras de C. parapsilosis para este composto é apenas de 25%. Os demais isolados das outras espécies apresentaram reações negativas para esta substância.
Em relação à porcentagem esperada (93%) de assimilação da fonte de carbono potássio 2-cetogluconato, 100% dos isolados de C. parapsilosis e C. metapsilosis apresentaram reação positiva para este composto. No entanto, somente 64,3% (9/14) isolados de C. orthopsilosis positivaram frente a este composto.
De acordo com o padrão do fabricante, o perfil de assimilação da xilose pela C. parapsilosis é de 96%. Observou-se que todas as cepas de C. parapsilosis e C. orthopsilosis obtiveram reação positiva para este açúcar, diferindo de C. metapsilosis, onde somente 40% (2/5) dos isolados apresentaram assimilação para a mesma substância.
Segundo o banco de dados do ID32 C, é esperado um baixo perfil de assimilação de C. parapsilosis para o açúcar ribose (1%). Observamos que 20% (1/5) dos isolados de C. metapsilosis apresentaram reação positiva para este açúcar, sendo ausente sua assimilação para as demais espécies.
A palatinose tem como referência 100% de positividade para C. parapsilosis. Todos os isolados de C. parapsilosis, C. metapsilosis apresentaram concordância com o banco de dados do ID32 C. Entretanto, 71% (10/14) isolados de C. orthopsilosis assimilaram essa fonte de carbono.
Já a sorbose apresenta 70% de assimilação pela C. parapsilosis, segundo o fabricante. Todos os isolados de C. orthopsilosis do nosso estudo apresentaram reações positivas em relação a esse composto. No entanto, C. parapsilosis e C. metapsilosis demonstraram uma positividade na reação de 96% (24/25) e 100% (5/5) dos isolados, respectivamente.
O ácido levulínico foi o que apresentou maior heterogeneidade de assimilação pelos isolados. Segundo o banco de dados do ID32 C, esse composto é positivo em 70% das reações com C. parapsilosis. Um total de 50% (7/14) de cepas de C. orthopsilosis foi positivo para essa substância, seguido de 20% (1/5) de C. metapsilosis e 12% (3/25) de C. parapsilosis.
Todos os isolados estudados de C. orthopsilosis e 96% (24/25) das cepas de C. parapsilosis apresentaram positividade para a assimilação do gluconato de potássio. Já C. metapsilosis, 60% (3/5) dos isolados tiveram reação positiva. O esperado, segundo o fabricante, é de 92% de assimilação desse composto pela C. parapsilosis.
As demais fontes de carbono foram assimiladas por todos os isolados de acordo com o proposto pelo fabricante para C. parapsilosis. Em relação aos valores esperados, fornecidos pelo fabricante para esta prova, as maiores divergências foram observadas para C. metapsilosis.
4.3.5 Teste de susceptibilidade das cepas de C. parapsilosis, C. orthopsilosis e C.
metapsilosis frente a vários antifúngicos pelo método de microdiluição em caldo
Os perfis de susceptibilidade das 124 cepas de C. parapsilosis, 13 de C. orthopsilosis e 4 de C. metapsilosis aos antifúngicos anfotericina B, fluconazol, 5- fluorocitosina, itraconazol, caspofungina e voriconazol foram analisados pelo método de
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microdiluição em caldo. Em todos os ensaios foi incluído, entre as amostras testadas, organismos-controle de C. parapsilosis ATCC 22019. A variação dos valores de CIMs deste organismo-controle, em diferentes ensaios, foi de 0,25 a 1,0 μg/mL para a anfotericina B, 1 a 4 μg/mL para fluconazol, 0,03 a 0,125μg/mL para itraconazol, 0,125 a 0,5 μg/mL para 5-fluorocitosina, 0,03 a 0,06 μg/mL para voriconazol e 0,03 a 0,5μg/mL para caspofungina. Estes valores são compatíveis com aqueles esperados pela metodologia do CLSI, 2002 e sugeridos por diferentes pesquisadores.
A Tabela 7 ilustra os valores de concentração inibitória mínima obtidos pelo método de microdiluição em caldo dos 141 isolados testados frente aos antifúngicos avaliados neste estudo.
Para a anfotericina B, nenhuma cepa apresentou valores de CIM superiores a 1,0 μg/mL. Apesar disto, vale notar que valores de CIM50 e CIM90 para C.
parapsilosis foram de 1,0 μg/mL. Para C. metapsilosis e C. orthopsilosis, a CIM50 e CIM90
foram de 0,5 e 1,0 μg/mL, respectivamente, sendo, portanto, sensíveis a essa droga.
Todas as cepas testadas ao fluconazol tiveram valores de CIMs ≤ 8 μg/mL e foram classificadas como sensíveis. As cepas de C. parapsilosis e C. orthopsilosis apresentaram CIM50 e CIM90 igual a 1,0 e 2,0 μg/mL, respectivamente, já C.
metapsilosis obteve CIM50 e CIM90 com susceptibilidade diminuída em relação a C.
orthopsilosis e C. parapsilosis (4,0 μg/mL).
Em relação ao itraconazol e voriconazol, todos os isolados foram inibidos por valores de CIM ≤ 0,5 μg/mL e 0,125 μg/mL, respectivamente. Logo, 99,3% (140) cepas foram susceptíveis a esses antifúngicos e somente a amostra de C. parapsilosis, número 51 do Hospital de Clínicas/USP-Ribeirão Preto, apresentou susceptibilidade dose dependente (SDD) ao itraconazol (CIM=0,5 μg/mL) (Anexo 3).
A ocorrência de resistência entre os isolados foi vista somente frente a 5-fluorocitosina, onde 2 isolados (1 de C. parapsilosis e 1 de C. orthopsilosis - cepas 101 e 87 do Hospital Universitário da UFRJ, respectivamente) apresentaram CIM ≥ 64 μg/mL. Em relação a essa mesma instituição e este antifúngico, a amostra 60 de C. orthopsilosis apresentou susceptibilidade indeterminada (CIM=16 μg/mL). As cepas de C. metapsilosis foram mais sensíveis a 5-fluorocitosina que as demais espécies (Anexo 3).
Apesar de não existir ponto de corte pré-estabelecido para a caspofungina, observou-se as cepas do complexo C. parapsilosis apresentaram CIM50
variando de 0,125 a 0,5 µg/mL e CIM90= 1 µg/mL. O Anexo 3 ilustra a sensibilidade
encontrada para todos os isolados testados.
4.3.6 Produção de biofilme por C. parapsilosis, C. orthopsilosis e C. metapsilosis
Foi realizada a avaliação da produção de biofilme dos isolados selecionados para os testes fenotípicos: C. parapsilosis (25), C. orthopsilosis (14), C. metapsilosis (5), já incluindo as cepas referência de C. parapsilosis ATCC 90018, C. orthopsilosis ATCC 96141 e C. metapsilosis ATCC 96143.
A produção de biofilme foi analisada com o intuito de verificar se haveria predomínio de cepas mais produtoras de biofilme em relação às espécies estudadas. Utilizou-se o método de coloração por cristal violeta para a quantificação do biofilme.
A Figura 6 demonstra a habilidade de produzir biofilme de todos os isolados em questão. Somente duas cepas de C. orthopsilosis não produziram biofilme (cepas 38 e 87). Podemos notar que a espécie C. parapsilosis contém as cepas que produzem mais biofilme, seguida da espécie C. orthopsilosis e por fim, C. metapsilosis. ___________________________________________________________________________
Para definir as cepas fortes e as fracas produtoras de biofilme, foi estabelecida a média das absorbâncias para todos os isolados em análise. O valor desta média foi calculado em 0,840 de absorbância. Os isolados com valor de absorbância superior ou igual a 0,840 foram considerados fortes produtores e com valor inferior a esse como fracos produtores.
A análise dos resultados aponta como fortes produtoras de biofilme 60% das cepas de C. parapsilosis (15/25) e 14,3% das cepas de C. orthopsilosis (2/14). Os cinco isolados de C. metapsilosis estudados revelaram ser fracos produtores de biofilme e duas cepas de C. orthopsilosis não produziram biofilme (Tabela 8). Esses resultados foram estatisticamente significativos, com P=0,001.
Concluindo, em nosso estudo, a espécie C. parapsilosis conta com os isolados mais fortemente produtores de biofilme, seguida da espécie C. orthopsilosis. Apesar do pequeno número de isolados de C. metapsilosis, esta parece ser a espécie com isolados de menor capacidade de produção de biofilme.
M I II III 78 6 12 13 34 47 94 M 21 38 60 72 97 127 M 95 46 68
600 pb -
C. orthopsilosis C. metapsilosis C. parapsilosis
Figura 1. Gel de agarose exibindo padrões genotípicos de isolados de leveduras amplificados pela técnica de RAPD, com o iniciador 1281. Nas canaletas temos: M (marcador molecular); I (C.
parapsilosis ATCC 90018); II (C. orthopsilosis ATCC 96141); III (C. metapsilosis ATCC 96143). Os
isolados 78, 6, 12, 13, 34, 47, 94, e 127 foram caracterizados como C. parapsilosis; 21, 38, 60, 72 e 97 como C. orthopsilosis e os isolados 95, 46 e 68 como C. metapsilosis.
53
Dice (Tol 2.0%-2.0%) (H>0.0% S>0.0%) [0.0%-100.0%]
RAPD utilizando o primer 1281
C. orthopsilosis n=6 100 9 8 96 94 92 90 88 86 84 82 80 78 76 74 72 38 60 72 21 97 74% 89,5% 91% C. metapsilosis n=4 ATCC C. orthopsilosis 68 95 ATCC C. metapsilosis 46 13 6 76% ATCC C. parapsilosis 78 127 12 47 34 94 C. parapsilosis n=9
Figura 2. Dendrograma construído a partir dos perfis de bandas de 19 isolados de leveduras, gerados a partir de RAPD com o iniciador 1281 (Figura 1). As linhas azuis demarcam os isolados de C. parapsilosis, vermelhas representam C. orthopsilosis e verdes, isolados de C. metapsislosis.
Figura 4. Prevalência de isolados de C. parapsilosis, C. orthopsilosis e C. metapsilosis identificados pela técnica de RAPD, utilizando o iniciador 1281 e seqüenciamento da região ITS.
II A I I B II II C I
Figura 5. Micromorfologia de três cepas distintas de C. parapsilosis cultivadas em ágar fubá com tween-20. As setas das figuras A, B e C demonstram a formação de pseudohifas (I) e blastoconídios (II). Em A, podemos observar pseudohifas pouco desenvolvidas, em B pseudohifas curvas e em C pseudohifas mais desenvolvidas.
Absor b ânci a (5 70 nm ) Isolados
Figura 6. Produção de biofilme dos isolados de C.parapsilosis, C. orthopsilosis e C. metapsilosis. I - C.parapsilosis ATCC 90018, II - C. orthopsilosis ATCC 96141 e III - C. metapsilosis ATCC 96143.
Tabela 1. Valores de ponto de corte sugeridos para interpretação de testes de susceptibilidade de leveduras
Variação dos valores de CIM (µg/mL) para a categoria
Antifúngicos Sensível (S) SDDependente* /Intermediário Resistente (R) Referências Fluconazol ≤8 16-32 ≥64 CLSI, 2002 Itraconazol ≤0,125 0,25-0,5 ≥1 CLSI, 2002 5-Fluorocitosina ≤4 8-16 ≥32 CLSI, 2002
Voriconazol ≤1 2 ≥4 Pfaler et al., 2006 (a)
Anfotericina B ≤1 ≥2
Nguyen et al., 1998; Dewsnup,
1994; Maenza et al., 1996;
Rex et al., 1995; Rex et al.,
1997, Bachmann et al., 2002,
Pfaller et al., 2006 a/b
Caspofungina
** **
*Susceptibilidade dose-dependente = categoria exclusiva para triazólicos ** Não existe valores de corte pré-estabelecidos
Tabela 2. Distribuição geográfica dos isolados de leveduras identificados fenotipicamente como C. parapsilosis selecionados para o estudo
SP - São Paulo, Unicamp - Universidade de Campinas, USP - Universidade de São Paulo, DF - Distrito Federal, MG - Minas Gerais, ES - Espírito Santo, PR - Paraná, RJ - Rio de Janeiro, RS - Rio Grande do Sul.
Centros médicos N° de isolados
Hospital São Paulo, Univ. Federal de São Paulo - SP 22
Hosp. Servidor Público de São Paulo - SP 23
Hosp. de base, Fac. de Medicina de São José do Rio Preto - SP 6
Hosp. das Clínicas, Unicamp / Campinas - SP 13
Hosp. das Clínicas, USP-Ribeirão Preto - SP 27
Hosp. de base do Distrito Federal / Brasília - DF 15
Hosp. Felício Rocho - Belo Horizonte - MG 1
Hosp. das Clínicas, Univ. Federal do Espírito Santo / Vitória - ES 8
Hosp. das Clínicas, Univ. Federal do Paraná / Curitiba - PR 2
Hosp. Universitário, Univ. Federal do Rio de Janeiro - RJ 14
Hospital da Lagoa, Rio de Janeiro - RJ 5
Hosp. das Clínicas, Univ. Federal de Santa Maria - RS 5
Total 141
Tabela 3. Prevalência das espécies de C. parapsilosis, C. orthopsilosis e C. metapsilosis nos centros médicos que contribuíram com amostras de leveduras
Nº: número, % porcentagem, SP - São Paulo, Unicamp - Universidade de Campinas, USP - Universidade de São Paulo, DF - Distrito Federal, MG - Minas Gerais, ES - Espírito Santo, PR - Paraná, RJ - Rio de Janeiro, RS - Rio Grande do Sul
Centros N° de isolados
Nº - (%) espécies
C.parapsilosis C.orthopsilosis C.metapsilosis
1 São Paulo – SP 22 20 (90,9) 1 (4,55) 1 (4,55)
1*
São Paulo - SP 23 21 (90,9) 2 (9,1)
2 São José do Rio Preto - SP 6 6 (100)
3 Campinas - SP 13 11 (84,6) 1 (7,7) 1 (7,7) 4 Ribeirão Preto - SP 27 25 (84,6) 1 (7,7) 1 (7,7) 5 Brasília - DF 15 13 (86,7) 2 (13,3) 6 Belo Horizonte - MG 1 1 (100) 7 Vitória - ES 8 5 (90,9) 2 (4,55) 1 (4,55) 8 Curitiba - PR 2 1 (50) 1 (50) 9 Rio de Janeiro - RJ 14 11 (78,6) 3 (21,4) 9* Rio de Janeiro - RJ 5 5 (100) 10 Santa Maria - RS 5 5 (100) Total 141 124 13 4 1
Hospital São Paulo, Univ. Federal de São Paulo - SP
1*
Hosp. Servidor Público de São Paulo - SP
2
Hosp. de base, Fac. de Medicina de São José do Rio Preto - SP
3
Hosp. das Clínicas, Unicamp / Campinas - SP
4
Hosp. das Clínicas, USP-Ribeirão Preto - SP
5
Hosp. de base do Distrito Federal / Brasília - DF
6
Hosp. Felício Rocho - Belo Horizonte - MG
7
Hosp. das Clínicas, Univ. Federal do Espírito Santo / Vitória - ES
8
Hosp. das Clínicas, Univ. Federal do Paraná / Curitiba - PR
9
Hosp. Universitário, Univ. Federal do Rio de Janeiro - RJ
9*
Hospital da Lagoa, Rio de Janeiro - RJ
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Tabela 4. Lista de isolados selecionados para estudo comparativo do perfil fenotípico entre C. parapsilosis, C. orthopsilosis e C. metapsilosis
Nº dos isolados
Identificação
Genotípica Nº dos isolados
Identificação Genotípica 1- ATCC 90018 2- ATCC 96143 3- ATCC 96143 C. parapsilosis C. orthopsilosis C. metapsilosis 93 C. parapsilosis 6 C. parapsilosis 9 5 C. m e t a psilosis 9 C. parapsilosis 96 C. parapsilosis 1 1 C. or t h opsilosis 9 7 C. or t h opsilosis 12 C. parapsilosis 1 0 0 C. or t h opsilosis 13 C. parapsilosis 101 C. parapsilosis 1 9 C. m e t a psilosis 1 0 3 C. or t h opsilosis 2 1 C. or t h opsilosis 1 0 6 C. or t h opsilosis 22 C. parapsilosis 108 C. parapsilosis 3 8 C. or t h opsilosis 113 C. parapsilosis 40 C. parapsilosis 116 C. parapsilosis 4 3 C. or t h opsilosis 1 1 9 C. or t h opsilosis 4 6 C. m e t a psilosis 124 C. parapsilosis 50 C. parapsilosis 127 C. parapsilosis 57 C. parapsilosis 130 C. parapsilosis 6 0 C. or t h opsilosis 137 C. parapsilosis 6 8 C. m e t a psilosis 139 C. parapsilosis 7 2 C. or t h opsilosis 146 C. parapsilosis 73 C. parapsilosis 147 C. parapsilosis 78 C. parapsilosis 8 7 C. or t h opsilosis 90 C. parapsilosis 9 1 C. or t h opsilosis Nº: número _________________________________________________________________________________________ 62
Tabela 5. Perfis de identificação gerados pelo ID32 C em relação aos isolados de C. parapsilosis, C. orthopsilosis e C.metapsilosis após 72 h de incubação a 30 º C
Perfis de identificação C. parapsilosis Nº (%) C. orthopsilosis Nº (%) C. metapsilosis Nº (%) Total Nº (%) 5547350717 3 (21,4) 3 (6,8) 5545350317 2 (14,3) 2 (4,5) 5545350717 2 (8) 2 (4,5) 5545350517 1 (7,1) 1 (2,3) 5547350315 1 (4) 1 (2,3) 5547350317 19 (76) 6 (42,8) 25 (56,8) 5547354317 1 (7,1) 1 (2,3) 5547150315 2 (40) 2 (4,5) 7547750717 1 (20) 1 (2,3) 7547350315 2 (40) 2 (4,5) 5546350317 3 (12) 3 (6,8) 5546350115 1 (7,1) 1 (2,3) Total 25 14 5 44
Incluído a C. parapsilosis ATCC 90018 Incluído a C. orthopsilosis ATCC 96141
Tabela 7. Padrão de susceptibilidade dos isolados de C. parapsilosis, C. orthopsilosis e C. metapsilosis aos seis antifúngicos, avaliados por metodologia de microdiluição em caldo
Droga Espécie Variação de CIM µg/mL CIM50 CIM90
ANF-B C. parapsilosis (n=124) 0,25-1 1 1 C. orthopsilosis (n=13) 0,25-1 0,5 1 C. metapsilosis (n=4) 0,25-1 0,5 1 FLUCO C. parapsilosis (n=124) 0,125-8 1 2 C. orthopsilosis (n=13) 0,5-2 1 2 C. metapsilosis (n=4) 2-4 4 4 5FC C. parapsilosis (n=124) 0,125- >64 0,25 0,5 C. orthopsilosis (n=13) 0,125->64 0,5 16 C. metapsilosis (n=4) 0,125-0,25 0,25 0,25 ITRA C. parapsilosis (n=124) 0,03-0,5 0,03 0,06 C. orthopsilosis (n=13) 0,03-0,125 0,06 0,125 C. metapsilosis (n=4) 0,03-0,06 0,06 0,06 CASPO C. parapsilosis (n=124) 0,03-3 0,25 1 C. orthopsilosis (n=13) 0,03-1 0,125 1 C. metapsilosis (n=4) 0,5-1 0,5 1 VORICO C. parapsilosis (n=124) 0,03-0,125 0,03 0,125 C. orthopsilosis (n=13) 0,03-0,06 0,03 0,06 C. metapsilosis (n=4) 0,03-0,125 0,03 0,125 Abreviaturas: ANF-B: anfotericina B, FLUCO: fluconazol, 5FC: 5-Fluorocitosina, ITRA: itraconazol, CASPO: caspofungina, VORICO: voriconazol, CIM: concentração inibitória mínima, CIM50: valor de CIM capaz de inibir
50% das amostras testadas, CIM90 valor de CIM capaz de inibir 90% das amostras testadas, n: número de
Tabela 8. Análise da produção de biofilme entre as cepas das espécies C. parapsilosis, C. orthopsilosis e C. metapsilosis
Espécies Fortes produtora de biofilme (absorbância ≥0,840 ) Fracas produtora de biofilme (absorbância <0,840) C. parapsilosis 15/25 (60%) 10/25 (40%) C. orthopsilosis 2/14 (14,3%) 12/14 (85,7%) C. metapsilosis 0/5 (0%) 5/5 (100%) Total 17 27
C. parapsilosis ATCC 90018, C. orthopsilosis ATCC 96141 e C. metapsilosis ATCC 96143 foram
incluídas nesta análise.
Tabela 6. Porcentagem de assimilação das fontes de carbono testadas no ID32 C pelos isolados
selecionados
Nº de isolados GAL ACT SAC NAG MAL ARA TRE 2KG MDG SOR XYL RIB GLY PLE SBE LVT MLZ GNT MAN GLU GLN
C. parapsilosis* 100 25 100 100 100 96 96 93 98 100 96 1 93 100 72 70 99 92 100 100 97
C. parapsilosis (25) 100 0 100 100 100 100 84 100 100 100 100 0 100 100 96 12 100 96 100 100 100
C. orthopsilosis (14) 100 0 100 100 100 100 100 64,3 100 100 100 0 100 71,4 100 50 100 100 100 100 100
C. metapsilosis (5) 100 60 100 100 100 100 100 100 100 100 40 20 100 100 60 20 100 60 100 100 100
*Perfil de assimilação de fonte de carbono por C. parapsilosis constante no banco de dados do ID32 C. Nº- número de isolados.
GAL: Galactose; ACT: Actidiona; SAC: Sacarose; NAG: N – Acetil – Glucosamina; MAL: Maltose; ARA: Arabinose: TRE: Trealose; 2KG: Potássio 2 – cetogluconato; MDG: Metil-αD-Glucopiranosida; SOR: Sorbitol; XYL: Xilose, RIB: Ribose; GLY: Glicerol; PLE: Palatinose; SBE: Sorbose; LVT: Ácido Levulínico; MLZ: Melizitose; GNT: Gluconato de Potássio; MAN: Manose; GLU: Glucose; GLN: Glucosamina. Os números abaixo de cada fonte de carbono correspondem à porcentagem de reações positivas geradas pelas amostras após 48/72h a 30 º C.
C. parapsilosis é a segunda espécie mais comum de levedura isolada de infecção da corrente sangüínea, em pacientes hospitalizados em alguns países da América do Sul e Europa (Kocsubé et al., 2007; Bassetti et al., 2006; Colombo et al., 2006; Medrano et al., 2006; Messer et al., 2006; Godoy et al., 2003; Safdar et al., 2002; Colombo et al., 1999). Os pacientes mais susceptíveis a infecções por C. parapsilosis são recém nascidos de baixo peso em UTIs e pacientes imunocomprometidos, os quais geralmente requerem o uso de antibióticos e cateter venoso central por um longo período recebendo, freqüentemente, nutrição parenteral total (Al-Tawfiq, 2006; Brito et al., 2006; Medrano et al., 2006; Nakamura e Takahashi, 2006; Bonassoli, 2005; Duran et al., 2005; Clark et al., 2004).
Isolados de C. parapsilosis são fisiologicamente indistinguíveis, mas geneticamente heterogêneos. Recentemente, Tavanti et al. (2005), em estudo baseado em métodos moleculares, sugeriram a reclassificação dos três genótipos de C. parapsilosis considerado-os como novas espécies: C. parapsilosis, C. orthopsilosis e C. metapsilosis. No nosso estudo, adotaremos a nomenclatura “complexo C. parapsilosis” para referirmos as três espécies.
O principal objetivo deste trabalho foi verificar, através de genotipagem, a prevalência das espécies do complexo C. parapsilosis em isolados de ICS de várias regiões do Brasil, com posterior caracterização fenotípica para melhor entender o comportamento dessas espécies em nosso meio. Além do mais, tivemos como meta verificar se haveria um método fenotípico alternativo que pudesse diferenciar estas três espécies.
Vários métodos são empregados para diferenciar isolado de C. parapsilosis ao nível molecular. Em nossa investigação, a técnica utilizada foi o RAPD com o emprego do iniciador 1281, previamente validada em nosso laboratório por Amorim, 2007.
O RAPD é um método molecular que tem se tornado bastante popular no uso da identificação de espécies causadoras de infecções fúngicas e tem sido aplicado com sucesso para C. albicans, C. dubliniensis, C. parapsilosis, C.
lusitaniae, C. tropicalis, C. glabrata, C. famata e C. rugosa (Chong et al., 2007; Kocsubé et al., 2007; Neppelenbroek et al., 2006; Wenjin et al., 2006; Giammanco et al., 2005; Melo et al., 1998; Clemons et al., 1997; Howell et al., 1996; Meyer et al., 1993; Lehmann et al., 1992). Este método é simples, seus iniciadores são facilmente desenhados e freqüentemente detectam variações entre isolados (Taylor et al., 1999; Anderson et al., 1996; Verweij et al., 1996). Embora um único iniciador possa gerar um padrão relativamente complexo de bandas que varia entre isolados, na maior parte dos exemplos um único iniciador fornece uma ou três bandas de alta densidade que pode diferenciá-los. Em alguns casos são necessários usar um número maior de iniciadores para avaliar as informações de formas independentes e associadas (Gil-Lamaignere et al., 2003).
Alguns trabalhos têm citado baixa reprodutibilidade do RAPD, não somente entre laboratórios, mas dentro de um mesmo laboratório. Fatores que podem estar implicados com esse fato são: diferenças no tamanho ou concentração do iniciador, temperatura durante a amplificação, a concentração de magnésio na reação e até mesmo a fonte da enzima Taq (Tyler et al., 1997). Contudo, uma vez padronizada, essa técnica pode ser utilizada com sucesso. No nosso estudo, o iniciador 1281 mostrou uma boa reprodutibilidade e uma alta capacidade para discriminar espécies e isolados não relacionados epidemiologicamente. O padrão de bandas dos isolados testados foram similares às cepas referência e conservados entre si, o que permitiu a identificação das espécies com o iniciador empregado (Figura 1). A escolha do iniciador, materiais e reagentes utilizados satisfizeram as condições exigidas pela técnica, identificando 97,9% dos isolados. Somente 3 de 144 isolados não foram identificados seguramente, porém estes eram bastante sugestivos de C. orthopsilosis, os quais tiveram sua identificação correta confirmada através do seqüênciamento da região ITS do rDNA.
Como mostrado pelo dendrograma da Figura 3, os isolados do complexo C. parapsilosis foram aglutinados em quatro grupos, sendo que 3 deles incluíam suas respectivas cepas referência, e, portanto, foram identificados como contendo as cepas pertencentes às espécies: C. parapsilosis, C. orthopsilosis e C. metapsilosis. O grupo que não se associou a nenhuma cepa controle foi sugestivo de C. orthopsilosis, pois possuía padrões de bandas bem semelhantes a essa espécie,
além de todos os isolados deste grupo ter sua identificação confirmada pelo seqüenciamento da região ITS. Portanto, as cepas de C. orthopsilosis apresentaram uma grande variabilidade genética.
A ocorrência de C. orthopsilosis e C. metapsilosis é pouco encontrada em amostras de leveduras isoladas a partir de hemoculturas. Não há muitos trabalhos na literatura que forneçam dados suficientes para a avaliação da prevalência destas 3 espécies em infecções sangüíneas, infecções em outros sítios ou mesmo colonização.
Nosso estudo observou que C. parapsilosis é a espécie mais prevalente entre amostras isoladas de pacientes com candidemia, respondendo por 124 isolados (87,9%) das 141 amostras estudadas. As demais espécies foram encontradas em menor proporção, 13 isolados (9,2%) foram identificados como C. orthopsilosis e 4 (2,9%) como C. metapsilosis (Figura 4).
Lin et al. (1995) foram responsáveis por um dos primeiros estudos epidemiológicos que avaliaram a ocorrência do complexo C. parapsilosis de amostras oriundas de quatro estados dos EUA. Um total de 45 isolados clínicos, provenientes de vários sítios diferentes, foi avaliado. Somente três amostras de sangue foram analisadas, portanto não foi possível estabelecer relação entre a prevalência de espécies do complexo C. parapsilosis neste estudo em relação ao sítio de isolamento. No entanto, a casuística desse trabalho, levando em consideração os 45 isolados estudados, C. parapsilosis correspondeu a 73% do total de cepas, C. orthopsilosis 22% e C. metapsilosis 4,5%, sendo que as duas cepas desta última espécie eram ATCC e de origem não hematogênica. As espécies deste estudo foram identificadas através de métodos imunoenzimáticos e seqüenciamento da região ITS.