Avaliação do Modelo Estrutural pelo Prockeck

O programa Procheck (LASKOWSKI et al., 1994) analisa a geometria global da estrutura ou cada resíduo individualmente, utilizando parâmetros estereoquímicos derivados de estruturas de alta resolução ou bem refinadas (MORRIS et al., 1992), que constituem sua base de dados. Trata-se de um pacote popular de programas para verificação da qualidade da estrutura 3D de proteínas e peptídeos.

Os parâmetros estereoquímicos usados são aqueles descritos por Morris et al. (1992). Estes parâmetros utilizados como informações estereoquímicas checadas pelo Prockeck são: ligações covalentes, planaridade de grupos planares (aromáticos, ligações peptídicas, etc), ângulos diédricos, quiralidade, interações não covalentes, ligações de hidrogênio da cadeia principal e pontes de dissulfeto.

O Prockeck requer como entrada um arquivo das coordenadas atômicas da estrutura da proteína a ser avaliado no formato “pdb” e produz representações coloridas facilmente interpretadas, descrevendo a estrutura, e também comparando duas estruturas relacionadas. Além disso, mostra uma lista detalhada de resíduo por resíduo, fornecendo uma avaliação da qualidade total da estrutura, em comparação às estruturas bem-refinadas de mesma definição. Dentre as várias análises fornecidas pelo Procheck, utilizou-se o Diagrama de Ramachandran.

G.N. Ramachandran descreveu as conformações possíveis para os aminoácidos em uma cadeia polipeptídica. A conformação da cadeia peptídica é simplesmente descrita pelos valores dos ângulos diedros na estrutura principal da seqüência peptídica, ângulo descrito pelo nitrogênio e carbono alfa (N-Ca) e o ângulo descrito pelo carbono alfa e carbono (Ca-C). Esses ângulos são denominados ângulos de torção f e , respectivamente (GIBAS et al., 2001). Em princípio, f e podem ter qualquer valores entre -180 º e + 180 º, porém, muitos valores dos ângulos f e são proibidos pelas interferências estéricas entre átomos pertencentes ao mesmo esqueleto polipeptídico e pelas cadeias laterais dos resíduos de aminoácidos.

Capítulo 4

O digrama de Ramachandran (RAMACHANDRAN et al., 1963) indica a distribuição dos ângulos f e dos resíduos pertencentes a uma determinada estrutura. Segundo Ramachandran (RAMACHANDRAN et al., 1963), uma estrutura de boa qualidade deve ter 90% ou mais de seus resíduos nas regiões mais favoráveis, as quais serão discutidas na apresentação dos resultados e discussão desse estudo.

Capítulo 4

4. RESULTADOS E DISCUSSÃO

As proteínas do veneno bruto da vespa social Polybia paulista foram separadas por eletroforese bidimensional. Primeiramente, elas foram separadas por carga através de seus pontos isoelétricos e numa segunda etapa, por massa molecular. O fracionamento do veneno bruto por eletroforese bidimensional resultou num gel SDS-PAGE 15% (m/v) com 225 spots, ou seja, 225 prováveis proteínas. A partir da analise proteômica realizada no primeiro capítulo desse estudo, foram identificadas 6 isoformas do alérgeno Antígeno 5 e uma do alérgeno Sol i III (análogo do Antígeno 5 em formigas). A Figura 1 mostra o perfil protéico do veneno bruto da vespa em estudo, onde essas proteínas estão enumeradas conforme a analise proteômica realizada anteriormente.

FIGURA 1: Gel de Eletroforese Bidimensional em SDS-PAGE 15%(m/v) do veneno da vespa social Polybia paulista. As proteínas foram focalizadas em fitas de pI de 3 a 10, com 13 cm de comprimento. Aproximadamente, 225 proteínas foram detectadas pela coloração de CBB. Os spots enumerados são as isoformas do alérgeno Antígeno 5 e do alérgeno Sol i III identificados pela análise proteômica do veneno bruto da P. paulista.

Capítulo 4

Conforme a análise proteômica do veneno bruto da vespa P. paulista realizada anteriormente, as proteínas identificadas foram excisadas do gel, descoradas e submetidas à digestão tríptica. Os fragmentos peptídicos foram submetidos às análises de espectrometria de massas, e com o auxilio de ferramentas de bioinformática, 94 proteínas foram identificadas e caracterizadas. Dentre elas, 6 proteínas foram caracterizadas como Antígeno 5 (spots 125, 134, 188, 189, 194 e 236) e uma como alérgeno Sol i III (spot 161). A Tabela 1 mostra essas proteínas com suas respectivas seqüências parciais obtidas por espectrometria de massas tandem, nome (funcional), massa molecular (KDa), ponto isoelétrico e código de acesso nos bancos de proteínas/genes.

TABELA 1: Caracterização molecular dos Antígenos 5 e do Alérgeno Sol i III do veneno da vespa social P. paulista. As seqüências parciais foram obtidas pela digestão tríptica dos spots recortados do gel de eletroforese bidimensional do veneno bruto da vespa em estudo, sendo que os peptídeos resultantes foram detectados por espectrometria de massas MALDI-TOF-MS e seqüenciados por espectrometria de massas MS/MS.

Os Antígenos 5 identificados apresentam massas moleculares entre 26,5 e 12,8 KDa e ponto isoelétricos entre 9,6 e 8,1. O spot 161 foi identificado como Alérgeno Sol i III do veneno da formiga do gênero Solenopsis, o qual foi caracterizado como proteína semelhante ao Antígeno 5 de vespas nos estudos de HOFFMAN (1993).

O código de acesso Q7Z156 da maioria das isoformas identificadas é o mesmo registro encontrado nos bancos de dados para o Antígeno 5 isolado do veneno da vespa social Polybia scutellaris rioplatensis por Cascone et al. (1995) e caracterizado por Pirpignani et al. (2002). Segundo esses estudos, o

Capítulo 4

alérgeno Antígeno 5 é uma proteína de 207 resíduos de aminoácidos, com estrutura monomérica apresentando 8 resíduos de cisteína ao longo de sua seqüência primária, formando 4 pontes de disulfeto, massa molecular em torno de 23 KDa e ponto isoelétrico acima de 9; porém sua atividade biológica ainda é desconhecida (KING et al., 1990, CASCONE et al., 1995, PIRPIGNANI et al., 2002).

A partir dos dados da espectrometria de massas, os fragmentos peptídicos obtidos nesse estudo foram comparados com a seqüência primária do Antígeno 5 da vespa P.scutellaris, onde pôde se observar que, parte da seqüência do Antígeno 5 da vespa P.paulista tinha sido esclarecida. Dessa forma, uma quantidade maior do veneno bruto da vespa P.paulista foi submetido à eletroforese bidimensional, onde o spot 125 (a isoforma de maior massa molecular identificado) foi excisado dos géis e submetido, individualmente, à digestão enzimática com outras proteinases: Quimiotripsina e Protease V8, a fim de obter outros trechos peptídicos para a determinação da seqüência primária do Antígeno 5 do veneno da P. paulista.

O espectro de massas MALDI-TOF-MS representado na Figura 2 mostra os fragmentos peptídicos gerados após a digestão do spot 125 com a enzima Tripsina. A Tabela 2 mostra as seqüências dos peptídeos trípticos detectados, suas respectivas seqüências obtidas por espectrometria de massas tandem e suas massas moleculares.

Capítulo 4

FIGURA 2: Espectro de massas MALDI-TOF-MS obtido após a digestão do spot 125 com a enzima Tripsina. Os fragmentos de massas estão enumerados conforme sua localização na seqüência primária do Antígeno 5 em estudo.

TABELA 2: Fragmentos peptídicos do spot 125 gerados pela digestão com a enzima tripsina e seqüenciados por espectrometria de massas tandem. Os resíduos de aminoácidos indicam a localização do fragmento na seqüência primária da proteína em estudo.

A figura 3 mostra o espectro de massas MALDI-TOF-MS após a digestão do spot 125 com a enzima Quimiotripsina. A Tabela 3 mostra as seqüências dos peptídeos detectados, suas respectivas seqüências obtidas por espectrometria de massas tandem e suas massas moleculares.

Capítulo 4

FIGURA 3: Espectro de Massas MALDI-TOFMS obtido após a digestão do spot 125 com a enzima Quimiotripsina. Os fragmentos de massas estão enumerados conforme sua localização na seqüência primária do Antígeno 5 em estudo.

TABELA 3: Fragmentos peptídicos do spot 125 gerados pela digestão peptídica com a enzima Quimiotripsina e seqüenciados por espectrometria de massas tandem. Os resíduos de aminoácidos indicam a localização do fragmento na seqüência primária da proteína em estudo.

A Figura 4 mostra o espectro de massas MALDI-TOF-MS obtido após a digestão do spot 125 com a enzima Protease V8. A Tabela 4 mostra as seqüências dos peptídeos gerados por digestão do spot 125 com Protease V8,

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suas respectivas seqüências obtidas por espectrometria de massas tandem e suas massas moleculares.

FIGURA 4: Espectro de massas MALDI-Tof-MS obtido após a digestão do spot 125 com a enzima Protease V8. Os fragmentos de massas estão enumerados conforme sua localização na seqüência primária do Antígeno 5 em estudo.

TABELA 4: Fragmentos peptídicos do spot 125 gerados pela digestão peptídica com a enzima Protease V8 e seqüenciados por espectrometria de massas tandem. Os resíduos de aminoácidos indicam a localização do fragmento na seqüência primária da proteína em estudo.

Além disso, o microsequenciamento N- e C-terminal dessa proteína também foram realizados para auxiliar o mapeamento de sua estrutura primária. A partir dos sequenciamentos dos fragmentos peptídicos obtidos nos

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três processos de clivagens proteolíticas realizados e pelo microsequenciamento N- e C-Terminal, foi realizada a superposição de todas as seqüências obtidas, que por sua vez, foram representadas na Figura 5, que também mostra a provável seqüência primária do Antígeno 5 do veneno da vespa social P. paulista.

FIGURA 5: Seqüência primária do Antígeno 5 do veneno da vespa social Polybia paulista obtida por superposição dos fragmentos peptídicos obtidos por digestão do spot 125 com Tripsina, Quimiotripsina e Protease V8 e seqüenciados por espectrometria de massas tandem, com aqueles seqüenciados por química Degradativa (N- e C-terminal) à partir do sequenciamento da proteína correspondente ao spot 125 por Química Degradativa.

O Antígeno 5 é o alérgeno de veneno de vespa mais estudado. Cerca de 19 seqüências primárias de Antígeno 5 de espécies de vespas de 5 gêneros diferentes já foram reveladas (HOFFMAN, 2006), entre eles os gêneros Polistes, Dolichovespula, Vespa, Vespula e Polybia; todas elas espécies de vespas européias ou norte americanas, com exceção do gênero Polybia. O único estudo realizada com o alérgeno Antígeno 5 de vespas sul americanas

Capítulo 4

sua seqüência primária caracterizada por Pirpignani e colaboradores (2002). No presente estudo, a seqüência primária do Antígeno 5 da vespa social Polybia paulista obtida é muito parecida com a da P. scutellaris.

Seqüências do Antígeno 5 dos principais gêneros de vespa:Vespa Polistes (Ag5_Polistes), Dolichovespula (Ag5_Dolichovespula), Vespa (Ag5_Vespa), Vespula (Ag5_Vespula) e Polybia scutellaris (Pol_SC) foram alinhadas pela ferramenta de bioinformática Multialin (CORPET, 1988 - http://prodes.toulouse.inra.fr/multalin/multalin.html) com a seqüência primária do Antígeno 5 da Polybia Paulista (Ag5_POLPA); o alinhamento final está mostrado na Figura 6.

Capítulo 4

Capítulo 4

Os resíduos de aminoácidos assinalados em preto na Figura 6 são os resíduos de aminoácidos que se conservam em todas as seqüências de Antígeno 5 conhecidas até o momento. A Tabela 5 mostra valores de identidade e similaridade entre: as seqüências primárias do alérgeno Antígeno 5 das espécies Polybia paulista (Ag5_POLPA) e Polybia scutellaris (Ag5_POLSC) e entre as seqüências primárias do Antígeno 5 da espécie P. paulista (Ag5_POLPA) e dos gêneros Polistes (Ag5_Polistes), Dolichovespula (Ag5_Dolichovespula), Vespa (Ag5_Vespa) e Vespula (Ag5_Vespula).

TABELA 5: Valores de identidade e similaridade entre as seqüências primárias consensos do alérgeno Antígeno 5 dos principais gêneros de vespa já estudados. Identidade Similaridade Ag5_POLPA x Ag5_POLSC 94% 98,5% Ag5_POLPA x Ag5_Polistes 76% 95,5% Ag5_POLPA x Ag5_Vespa 64% 94% Ag5_POLPA x Ag5_Dolichovespula 59% 91% Ag5_POLPA x Ag5_Vespula 58% 88%

A Tabela 5 mostra que existe uma identidade relativamente elevada para esta proteína com as demais, especialmente entre as duas espécies neotropicais.

A partir dessa comparação entre as estruturas primárias dos antígenos 5 de vespas descritas na literatura e tendo conhecimento da estrutura tridimensional do Antígeno 5 da vespa Vespula vulgaris, obtido por cristalografia de raios-X, a mesmo foi utilizada como molde (template) para modelagem da estrutura tridimensional do alérgeno Antígeno 5 do veneno da vespa social Polybia paulista (código PDB: 1QNX).

Capítulo 4

FIGURA 7: Modelo da estrutura tridimesional da proteína Antígeno 5 gerado à partir do programa MolMol (Koradi et al., 1996).

Nesse estudo, a estrutura tridimensional do Antígeno 5 da P. paulista foi

obtida pela ferramenta de bioinformática Swiss Model

(http://swissmodel.expasy.org//SWISS-MODEL.html) e a imagem do modelo foi gerada a partir do programa MolMol (KORADI et al., 1996), sendo a mesma ilustrada na Figura 7. Neste modelo molecular pode observar 5 estruturas secundárias do tipo hélice- que cobrem cerca de 20% da seqüência primaria e 5 folhas- que cobrem cerca de 22% da seqüência primária; os outros 58 % da seqüência primária correspondem à voltas e estruturas aleatórias (turn e coil). Em comparação com os estudos de Pirpignani et al. (2002), o Antígeno 5 da vespa P.scutellaris contém 22% de hélice- , 22% de folhas- e 56% da seqüência primaria se encontram na forma de voltas e de estruturas aleatórias, números semelhantes àqueles obtidos no presente estudo, corroborando com a proximidade filogenética das espécies P. paulista e P.scutellaris.

Além disso, dados do estudo de cristalografia de raio-X, correspondente ao Antígeno 5 do veneno da vespa Vespula vulgaris mostram que a estrutura tridimensional do Antígeno 5 da vespa P.paulista também se assemelha a estrutura do Antígeno 5 da V.vulgaris, a qual apresenta 5 hélices-a e 4 folhas-ß (HENRIKSEN et al., 2001). Como essa estrutura tridimensional era o único

Capítulo 4

modelo disponível de antígenos 5 de vespas atualmente, ele foi utilizado para a modelagem molecular acima desenvolvida.

Para validar a estrutura tridimensional do Antígeno 5 da vespa P.paulista gerada utilizou-se o programa Procheck pela análise do diagrama de Ramachandran. As áreas em branco correspondem a regiões onde existem os choques estereoquímicos na proteína. Estas regiões não são permitidas estereoquimicamente e valem para todos os aminoácidos, exceto a glicina (Gly) que é a única que não tem cadeia lateral e pode adotar os ângulos de torção f e em todos os quadrantes do diagrama de Ramachandran. As regiões em vermelho correspondem à conformação onde não há nenhum choque estereoquímico, ou seja, são regiões permitidas e onde se encontram as hélices-a e folhas-ß. As regiões em amarelo escuro e claro mostram regiões limitantes, porém ainda ângulos permitidos ou generosamente permitidos, respectivamente.

O diagrama de Ramachandran da proteína em estudo (Figura 8) mostra que 151 resíduos de aminoácidos do modelo aparecem nas regiões preferencialmente permitidas do gráfico (regiões em vermelho), 29 resíduos estão nas regiões adicionalmente permitidas (regiões em amarelo escuro), 1 resíduo está nas regiões generosamente permitidas (regiões em amarelo claro) e apenas 2 resíduos estão nas regiões não permitidas do gráfico (regiões em branco).

Capítulo 4

FIGURA 8: Diagrama de Ramachandran, o qual avalia a qualidade da estrutura tridimensional do Antígeno 5 da vespa

P. paulista gerada.

A partir dos dados observados pode-se concluir que o modelo gerado é estereoquimicamente possível, pois o modelo apresenta mais que 90% de seus resíduos de aminoácidos em regiões favoráveis do gráfico de Ramachandran. Os 23 resíduos que estão faltando para totalizar os 206 resíduos de aminoácidos que constituem a seqüência são aqueles pertencentes ao aminoterminal, carboxiterminal e resíduos de glicina, que não são considerados por terem liberdade de se localizarem em qualquer região do diagrama de Ramachandran e os resíduos de prolina por não apresentarem cadeias laterais. Além do estudo detalhado sobre a estrutura primária do Antígeno 5 da P. paulista, foi necessário saber se os diferentes Antígenos 5 presentes no veneno da P. paulista representam múltiplas isoformas da mesma proteína. O veneno bruto foi submetido a uma abordagem experimental de análise proteômica, onde as proteínas foram separadas por eletroforese bidimensional. Os perfis resultantes foram submetidos aos protocolos de eletrotrasnferência e as proteínas foram transferidas para membranas de PVDF. Por sua vez, as

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no veneno foram individualmente excisadas e submetidas ao sequenciamento automático por Química Degradativa de Edman. Além disso, as mesmas proteínas foram também submetidas ao microseqüênciamento C-terminal. A Tabela 6 mostra as seqüências N- e C-terminais, massas moleculares hipotéticas e localização das seqüências das seis isoformas do Antígeno 5 do veneno da vespa P. paulista ao longo de toda a seqüência primaria da proteína intacta em sua forma ativa.

TABELA 6: Seqüências N- e C-terminais, massas moleculares hipotéticas e localização das seqüências das seis isoformas do Antígeno 5 do veneno da vespa P. paulista ao longo de toda seqüência primaria da enzima intacta em sua forma ativa.

Todas as seqüências N- e C-terminais obtidas para as seis isoformas do Antígeno 5 identificados no veneno ajustam-se perfeitamente à seqüência primária do Antígeno 5 descrita acima. Isto sugere que os Antígenos 5 descritos correspondem à diferentes isoformas da mesma proteína precursora. Levando em consideração ambas as seqüências N- e C-terminais mostrados na Tabela 6, é possível localizar suas posições ao longo das seqüências primárias (Figura 5), onde clivagens proteolíticas devem ter ocorrido pelas proteinases presentes no veneno em estudo.

Essa observação corrobora a hipótese de que as seis isoformas do Antígeno 5 detectadas e identificadas no veneno da vespa Polybia paulista resultaram de ações proteolíticas em diferentes posições na seqüência primária do alérgeno. Desde que o veneno foi obtido imediatamente após a coleta das vespas e extraído na presença de inibidores de proteinases, a ação proteolítica não deve ser um artefato experimental, mas um processo natural, promovido pelas proteinases presentes no veneno antes da extração de veneno.

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A glicosilação é a modificação pós-traducional mais comum de certas proteínas intracelulares de eucariotos. Resíduos de carboidratos podem ser enzimaticamente anexados às proteínas, através da ligação N-glicosídeo via o nitrogênio amida da asparagina, ou através da ligação O-glicosídeo via a hidroxil das serinas, treoninas, hidroxilisinas ou hidroxiprolina; ou ainda, através do ancoramento de glicosilfosfatidilinositol, o qual é subsequentemente removido (STEINBERG et al., 2001). A glicosilação contribui para atividades biológicas, imunogenicidade, solubilidade, estabilidade e resistência às proteases.

Assim, a identificação de isoformas glicosiladas é um passo importante para a caracterização bioquímica dos Antígenos 5. Para auxiliar essa identificação, o veneno bruto da P. paulista foi fracionado por eletroforese bidimensional e o perfil eletroforético obtido foi submetido à reação com o reagente fluorescente Pro-Q Emerald 300. O conjugado fluorescente foi visualizado por fotodocumentação do gel a 300 nm.

A Figura 9 mostra o resultado desse experimento, onde são visualizados 16 spots, os quais correspondem às proteínas do veneno bruto que apresentam carboidratos anexados a elas.

Capítulo 4

FIGURA 9: Perfil protéico da eletroforese 2-D do veneno bruto da vespa P.

paulista, onde 16 glicoproteínas foram coradas com o corante fluorescente

Pro-Q Emerald 300. A visualização foi realizada por fluorescência sob luz UV a 300 nm. Os spots 125 e 134 assinalados são isoformas glicoprotéicas do alérgeno Antígeno 5.

Os spots 125 e 134 assinalados nessa figura correspondem a duas isoformas do Antígeno 5 que são glicoprotéicas. A introdução de carboidratos nas estruturas das proteínas parece ser relativamente comum entre as toxinas de vespas, assim como hialuronidases do veneno das vespas Vespula vulgaris¸ Dolichovespula maculata e Polistes anularis (KOLARICH et al., 2005), PLA2

dos venenos das vespas Polybia paulista e Agelaia pallipes pallipes, e as PLA1

do veneno da formiga do gênero Solenopsis, previamente descritos como sendo de natureza glicoprotéica (OLIVEIRA et al., 1998; COSTA et al., 2000; HOFFMAN et al., 2006). Porém, estudos anteriores não identificaram a presença de carboidratos associados às estruturas dos Antígenos 5 nos demais venenos de vespas já investigados (HOFFMAN, 2006).

Desde que o veneno de vespas sociais é frequentemente associado a reações imunológicas, a imunoreatividade à IgE-específica foi avaliada no capítulo 2 desse estudo, quando o veneno bruto da vespa P. paulista foi

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submetido à ensaios de imunodetecção com o soro de pacientes sensibilizados pelo veneno da vespa Polybia paulista. Ao contrário dos estudos realizados por Pirpignani et al. (2002) onde o Antígeno 5 da vespa P. scutellaris apresentou uma reduzida resposta à IgE-específica, as diferentes isoformas do Antígeno 5 do veneno da vespa P. paulista foram caracterizadas como imunoreativas nesse estudo. A Figura 10 mostra o resultado da imunodetecção do veneno de P. paulista com os soros dos pacientes alérgicos ao veneno desta vespa, onde 16 proteínas mostraram-se imunoreativas à IgE-específica, sendo que os spots 125, 134, 189 e 194 correspondem às isoformas Antígeno 5.

FIGURA 10: Imunodetecção do veneno da vespa P. paulista com os soros dos pacientes sensíveis ao veneno da mesma vespa. Dezesseis proteínas são imunoreativas, sendo que os spots assinalados correspondem ao alérgeno Antígeno 5.

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Os resultados da detecção das isoformas glicoprotéicas e da imunodetecção das isoformas alergênicas do Antígeno 5 também estão descritos na Tabela 7.

TABELA 7: Seqüências N- e C-terminais, massas moleculares hipotéticas e localização das seqüências

das seis isoformas do Antígeno 5 do veneno da vespa P. paulista ao longo de toda seqüência primária da proteína intacta em sua forma ativa.

A Tabela 7 revela que as isoformas 125 e 134 apresentam carboidratos anexados à elas. Esse fato poderia determinar suas imunogenicidades com as IgEs específicas. No entanto, os IgEs-específicos contra os epítopos de carboidratos são considerados de baixa importância clínica (HERMMER et al., 2004). Desta maneira, se os epítopos de carboidratos são ou não importantes para a imunogenicidade do Antígeno 5, e se os mesmos são muito ou pouco