Composição dos venenos de vespas

Os alérgenos encontrados nos venenos de vespas apresentam a propriedade de sensibilizar, ou seja, induzir o sistema imune a produzir anticorpos com elevada especificidade, e, desencadear sintomas alérgicos em pacientes sensibilizados. Um dos maiores desafios da alergologia molecular é predizer o potencial alergênico das proteínas (AALBEESE, 2000). Estudos moleculares que levam à identificação dos epítopos imunogênicos dos alérgenos são muito relevantes, porque permitem identificar as regiões da molécula do alérgeno que interagem com os anticorpos do paciente sensibilizado (ASTWOOD et al., 1996). Os alérgenos mais importantes geralmente são caracterizados por: 1) serem solúveis, estáveis e apresentarem uma compactação na sua estrutura tridimensional (TEUBER et al., 1998) e 2) pela prevalência de IgE nos pacientes que são sensibilizados pelos mesmos (BREITENEDER et al., 1999).

Os venenos de vespas sociais são ricos em peptídeos biologicamente ativos e proteínas, responsáveis pelas dores prolongadas, edema, eritema, reações alérgicas e sistêmicas (LORENZI, 2002). Normalmente, estes venenos contêm vários tipos de aminas biogênicas, peptídeos e proteínas (NAKAJIMA et al., 1986). Os principais alérgenos dos venenos de vespas são: fosfolipases A1, hialuronidases e antígenos 5 (KING et al., 1996). Um quarto alérgeno,

serino-protease, foi identificado recentemente nestes venenos (Mc NAIRY et al., 2000). Além disso, o tamanho das moléculas e a presença de determinadas proteínas aumentam as propriedades antigênicas do veneno, sendo assim, um potente ativador do sistema imune (VETTER et al., 1998).

Estudos de Wood et al. (1983) demonstraram a complexidade de vários venenos de himenópteros. Cerca de 40 proteínas foram isoladas dos venenos de Apis mellifera, Polistes fuscatus, P.apachus, P. Metricus, P. exclamans, P. annularis, Vespula flavopilosa, V. squamosa, V. sulphurea, Dolichovespula maculata e Vespa Cabro; esses registros são pioneiros na literatura mundial na caracterização do perfil protéico de venenos de himenópteros. Esses estudos estimularam a sociedade científica à investigação mais intensa dos venenos

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processos de imunoterapias dependem do conhecimento sobre a composição desses venenos e da compreensão de seus mecanismos de ação.

Hoffman et al. (1984) obtiveram cinco proteínas alergênicas do veneno bruto da vespa Vespula maculifrons, isolando-as por eletroforese bi- dimensional, entre as quais estão a Vmacl (97 KDa), a Hialuronidase (46 KDa), a Vmac3 (39 KDa), as Fosfolipases A e B (34 KDa) e o Antígeno 5 (22 KDa). Há vários antígenos comuns entre os diferentes venenos de vespas sociais do Hemisfério Norte (FOUBERT et al., 1958; HOFFMAN, 1985).

As Polibitoxinas -I, -II, -III e –IV do veneno da vespa Neotropical Polybia paulista foram purificadas e caracterizadas bioquimicamente. Elas são fosfolipases A2 com potentes atividades hemolíticas (OLIVEIRA et al., 1998).

Estudos comparativos sobre o efeito da fosfolipase A2 foram realizados com

anti-soros de venenos de abelhas (Apis melífera) e de vespas (Vespula arenaria, V.vulgaris. e V maculata), onde verificou-se que o anti-soro do veneno de A. melifera foi capaz de neutralizar a atividade da fosfolipase A2 do veneno

bruto da abelha. No entanto, os anti-soros contra a PLA2 das três vespas, não

inibiram a atividade da fosfolipase A2 dos respectivos venenos brutos (NAIR et

al., 1976).

COSTA et al. (2000) isolaram uma toxina a partir do veneno da vespa A. p.palipes, designada Agelotoxina, a qual apresentou atividade de fosfolipase A2

e também mostrou atividade hemolítica cerca de 220 vezes mais potente que a PbTx de P.paulista, 740 vezes mais que a PLA2 de A.mellifera, 570 vezes mais

que a PLA2 de Naja nigricolis e 1250 vezes mais potente que a cardiotoxina de

Naja naja atra.

Entre as diversas espécies de vespas asiáticas, as espécies Vespa basalis, V. mandarinia e V. verutina são responsáveis pela morte de muitos indivíduos dessa região. Dessa forma, Ho e colaboradores (1999) trabalhando com o veneno da V. verutina isolaram três toxinas designadas Verutoxinas VT- 1 (34,9 KDa), VT-2a (33,3 KDa) e VT-2b (33,3 KDa). Neste estudo, a VT-1 mostrou maior atividade fosfolipásica A2, enquanto que, as isotoxinas VT-2 a e

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A fosfolipase A2 constitui cerca de 12% do veneno de abelhas; ela é

capaz de causar efeitos farmacológicos como: hipotensão, aumento da permeabilidade vascular (REISMAN et al., 1987), além de contrações musculares e paradas respiratórias (NAIR et al., 1976).

A purificação e caracterização de duas fosfolipases B, denominadas de e , foram obtidas do veneno da Vespa mandarinia, apresentando massas moleculares de 29,5 e 26,0 KDa, respectivamente; ambas ainda apresentaram atividades hemolíticas e cardiotóxicas, assim como as fosfolipases reveladas em outras espécies de vespas (ABE et al., 2000).

Estudos demonstraram que a toxicicidade do veneno de vespas requerem a ação sinérgica dos componentes inflamatórios do veneno. Segundo King et al. (2003), um mastoparano com ação degranuladora de mastócitos, potencializa a ação da fosfolipase A1 nas respostas associadas aos

processos inflamatórios.

As fosfolipases também induzem IgE específica, hidrolisam fosfolipídeos da membrana celular, agem sinergisticamente com outras toxinas, causando lise de eritrócitos e mastócitos, hipotensão e podem inibir a coagulação sanguínea (NAKAJIMA, 1986; HO et al., 1994). Estudos sobre a estrutura desses alérgenos demonstram vários níveis de identidade entre suas seqüências primárias, variando de 60% para as Fosfolipases e Antígenos 5 a 80% para as hialuronidases (HOFFMAN, 1993; KING et al., 2000).

A função biológica do alérgeno Antígeno 5 ainda é desconhecida, embora muitos estudos demonstrem a sua alergenicidade (HOFFMAN, 1993). Antígenos 5 de várias espécies de Vespula apresentam 95% de identidade em suas seqüências primárias, enquanto que 58-67% de identidade entre as espécies do gênero Dolichovespula e Polistes, respectivamente (KING et al., 1996; PANTERA et al., 2003). Isto promove uma completa reatividade cruzada com as espécies do gênero Vespula, enquanto que entre alguns gêneros da família Vespidae, ocorre uma baixa reatividade cruzada. A estrutura tridimensional do Alérgeno 5 do veneno de Vespula vulgaris foi determinada por cristalografia de raios-X (THORSTED et al., 2000), revelando que a mesma

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caracterizaram a proteína Antígeno 5 do veneno da vespa Neotropical Polybia scutellaris. Ela é uma estrutura monomérica, apresentando 207 resíduos de aminoácidos e massa molecular em torno de 23 KDa com 8 resíduos de cisteína, formando 4 pontes de disulfeto e ponto isoelétrico acima de 9 (CASCONE et al., 1995). Sua estrutura secundária contém 22% de hélices-a, 22% de folhas-ß e 56% entre estruturas dobras e estruturas aleatórios (turn e coil) (PIRGIGNANI et al., 2002).

A Hialuronidase age no interstício celular, potencializando a difusão do veneno, ao hidrolisar parcialmente a matriz extracelular, facilitando a ação dos demais componentes do veneno. A hialuronidase tem sido isolada dos venenos de Hymenoptera sociais por diversos passos de cromatografia, incluindo filtração em gel e troca catiônica (KING et al., 1976; HOFFMAN, 2006). Estudos de Markovic-Housley et al. (2000) elucidaram a estrutura tridimensional da hialuronidase de Apis mellifera por cristalografia de raio-X, a qual apresenta cerca de 350 resíduos de aminoácidos, com duas pontes de disulfeto e quatro sítios de glicosilações. As hialuronidases encontradas nos venenos de vespas são similares àquelas encontradas nos venenos das abelhas (LU et al., 1995), as quais apresentam quantidades significativas de carboidratos em suas cadeias (KUBELKA et al., 1995).

A presença de um quarto alérgeno, a serino-protease, foi identificada nos venenos de Polistes dominulus e Polistes exclamans por McNairy et al. (2000). A serino-protease “Bom p4” foi identificada no veneno da abelha Bombus pennsylvanicus por Hoffman et al (1996). Recentemente, três serino- proteases foram isoladas do veneno de B.pennsylvanicus e do veneno das vespas européias P.dominulus e P.exclamans, as quais demonstraram um elevado grau de resíduos conservados em suas seqüências primárias. Além disso, todas apresentaram atividades significativas de respostas a IgE específica (WINNINGHAM et al., 2004).

Pouco se sabe sobre proteases de veneno de vespas. Uma protease de 36,6 KDa do veneno da vespa Polistes gallicus isolada por cromatografia de afinidade, apresentou a seqüência N-terminal IVNGVXTEINEFPXMV, onde X indica resíduos de aminoácidos com incerteza. Até o momento, somente a

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seqüência completa de duas proteases do veneno das abelhas Apis mellifera (SCHMIDT et al., 2002) e Bombus pennsylvanicus, além de 20 resíduos do N- terminal da protease de Bombus terrestris (HOFFMAN et al., 2001) estão disponíveis nos bancos de proteínas (PANTERA et al., 2003).

Nos últimos anos, a engenharia proteômica tem desenvolvido microtécnicas que possibilitam a caracterização molecular de componentes bioativos, presentes em diferentes tipos de células, tecidos, extratos e/ou fluídos corporais (HEINE, 1997; RESING et al., 1999; PANDEY et al., 2000). A proteômica é uma ferramenta que começou a ser utilizada na identificação e seqüenciamento molecular de alérgenos em geral (BEYER et al., 2002; TICHÁ et al., 2002; TODA et al., 2002).

Embora a quantidade de informações de seqüências de DNAs nas bases de dados seja ampla, não é suficiente para ajudar a elucidar todas as funções biológicas das proteínas de um organismo. A proteômica é uma técnica complementar a genômica, pois ela se concentra nos produtos gênicos, os quais são agentes ativos nas células. Por essa razão, a proteômica contribui diretamente para a identificação de alvos protéicos, contra os quais podem ser desenvolvidas de drogas de uso terapêutico (PANDEY et al., 2000).

A proteômica é uma ferramenta que começou a ser utilizada na identificação e seqüenciamento molecular de alérgenos em geral. A abordagem proteômica utilizada neste trabalho é composta por três tecnologias principais: a) a separação das proteínas; b) o microsequenciamento das proteínas por Espectrometria de Massas e Química Degradativa de Edman; e c) a identificação das proteínas por estratégicas de Bioinformática Proteômica. Além disso, técnicas de eletrotransferência e imunodetecção auxiliarão a caracterizar os alérgenos imunodominantes nessa abordagem adotada. Dessa forma, será possível caracterizar molecularmente as proteínas presentes no veneno da vespa social Polybia paulista, que se trata de uma das vespas que mais causam acidentes de relevância médica no Sudeste do Brasil.

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