Análise proteômica dos alérgenos imunodominantes do veneno da vespa social Polybia paulista

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UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA

“JÚLIO DE MESQUITA FILHO”

INSTITUTO DE BIOCIÊNCIAS – RIO CLARO

unesp

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOLOGIA CELULAR E MOLECULAR

ANÁLISE PROTEÔMICA DOS ALÉRGENOS IMUNODOMINANTES DO

VENENO DA VESPA SOCIAL Polybia paulista

LUCILENE DELAZARI DOS SANTOS

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UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA

“JÚLIO DE MESQUITA FILHO”

INSTITUTO DE BIOCIÊNCIAS – RIO CLARO

unesp

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOLOGIA CELULAR E MOLECULAR

ANÁLISE PROTEÔMICA DOS ALÉRGENOS IMUNODOMINANTES DO

VENENO DA VESPA SOCIAL Polybia paulista

LUCILENE DELAZARI DOS SANTOS

ORIENTADOR: PROF. DR. MARIO SERGIO PALMA

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595.798 Santos, Lucilene Delazari dos

S237a Análise proteômica dos alérgenos imunodominantes do veneno da vespa social Polybia paulista / Lucilene Delazari dos Santos. – Rio Claro : [s.n.], 2006

198 f. : il.

Tese (doutorado) – Universidade Estadual Paulista, Instituto de Biociências de Rio Claro

Orientador: Mário Sérgio Palma

1. Vespa. 2. Análise proteômica. 3. Alergia. 4. Polybia paulista. I. Título.

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i

“Quando compreendi que em qualquer circunstância, eu estava no lugar certo, na hora certa, no momento exato, eu pude relaxar. Hoje sei que isso é Auto-estima.

Quando pude perceber que a minha angústia, meu sofrimento emocional, não passava de um sinal de que estou indo contra as minhas verdades, encontrei a minha

Autenticidade.

Quando comecei a perceber como é ofensivo tentar forçar alguma situação ou alguém, apenas para realizar aquilo que desejo, sabendo que não é o momento ou que a pessoa não está preparada (inclusive eu mesmo), descobri o Respeito.

Quando parei de desejar que a minha vida fosse diferente e comecei a ver que tudo o que acontece contribui para o meu crescimento, notei meu Amadurecimento.

Quando comecei a me livrar de tudo que não fosse saudável... pessoas, tarefas, tudo e qualquer coisa que me pusesse para baixo, minha razão chamou essa atitude de egoísmo. Hoje sei que se chama Amor-Próprio.

Quando deixei de temer meu tempo livre e desisti de fazer grandes planos, abandonei os projetos megalômanos de futuro. Hoje faço o que acho certo, o que gosto, quando quero e no meu próprio ritmo. Hoje sei que isso é Simplicidade.

Quando desisti de querer ter sempre razão e, com isso, errei muito menos vezes, descobri a Humildade.

Quando desisti de ficar revivendo o passado e de me preocupar com o futuro, me mantendo no presente, onde é que a vida acontece, encontrei a Plenitude.

Percebi que a minha mente pode me atormentar e me decepcionar. Mas quando eu a coloco a serviço do meu coração, ela se torna uma grande e valiosa aliada. Acredito que isso seja Saber Viver”.

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ii

Aos meus queridos pais, à minha irmã

e cunhado, aos meus sobrinhos e ao

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iii

Agradecimentos

Não poderia deixar de agradecer primeiramente ao meu fiel amigo... por me acompanhar em todas os momentos... me protegendo, me conduzindo, me confortando, me dando liberdade de ir e vir sem ao menos me pedir algo em troca... Ele sabe dos meus mais preciosos sonhos e dos meus limites... Deus!

Ao meu orientador, Prof. Dr. Mario Sergio Palma, pelo conhecimento científico, pelas oportunidades proporcionadas, pela acolhida e reconhecimento; pela amizade, por acreditar em meu potencial, por entender que meu amadurecimento possa ocorrer mais devagar.

Aos colaboradores Prof. Dr. Edécio Cunha-Neto e Prof. Dr. Fábio Morato Castro da Universidade Paulista de Medicina, Instituto do Coração, S.P., pela amizade e pelo material biológico fornecido; aos professores Dr. Gilberto Domont da Universidade Federal do Rio de Janeiro e Dr. Jonas Perales da Fundação Oswaldo Cruz, R.J., por me receberem com carinho e pelo auxílio na Espectrometria de Massas.

Aos meus pais, Antônio e Glauci, pelo simples fato de vocês existirem... por serem meus exemplos mais próximos de perseverança, auto-estima, dignidade, caráter... por permanecerem sempre ao meu lado, me estimulando a continuar mesmo quando o cansaço e o desânimo apareciam... por participarem ativamente da elaboração dos meus sonhos e suas concretizações.

À minha irmã querida, Regilene, por me permitir nela espelhar, de mostrar que podemos sempre mais, que fazer as coisas simplesmente por fazer não se faz necessário e sim, de fazer pela vida toda com atitude, com garra... por acreditar que vale a pena ser cientista ... por acreditar que vale a pena ser professor nesse país. Ao meu cunhado Milton e meus sobrinhos João Caetano e Pedro Henrique, por serem constantes alegrias em minha vida... por me mostrarem que constituir uma família é um sonho digno e incomensurável para o ser humano.

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iv

mais essa etapa se você não me cedesse liberdade, paciência, companheirismo, e principalmente, completasse meus dias com sua existência e seu amor.

Aos meus amigos do Laboratório de Biologia Estrutural e Zooquímica.... por dividirem comigo experiências pessoais e profissionais durante todos esses anos. Por me ensinarem à importância do trabalho em grupo, o qual requer comprometimento com a ciência e com o próximo, paciência constante e disposição para novos projetos, experimentos, protocolos e padronizações... à Lílian, Roberta, Nicoli, Daniel, Paulo

César, Luiz Carlos, Meire, Vírginia e Alessandra, Bob, Marília... ao Beto e a Nathália

que, além de todo auxílio fornecido durante esse ano, permitiram que eu transmitisse meus conhecimentos e me sentisse um pouco mais professora e cientista.

À Fernandinha, Thalita, Bibi e Keity, por serem muito mais do que colaboradoras do

meu projeto científico, por participarem de todas as minhas alegrias e tristezas, por lutarem comigo nos meus ideais de vida, por simplesmente, quererem o meu bem. Aos amigos do Mini-TLC de Laranjal Paulista e de Botucatu, pois me mostram constantemente que trabalhar pra Cristo nos engrandece... que ser Igreja por onde passamos se faz necessário, auxiliando o próximo a enxergar que nós temos que diminuir para que Deus cresça em nossa vida... que ajudar o próximo não é somente um dever e sim, a busca da graça de Deus e da construção de seres humanos melhores... por viverem o verdadeiro amor entre irmãos, por fazer da nossa amizade, um constante festa... À Alessandra Camargo, Fernanda Capucho e Nayara Cuani... por serem mais que amigas.... por respeitarem e viverem comigo meu mundo cor-de-rosa.... Irmãs eternas.

Àqueles que de alguma forma contribuíram para meu crescimento pessoal e intelectual em toda minha vida... um simples olhar, um abraço, um consolo, um caminho oferecido, a oportunidade cedida.... qualquer coisa... Tenham certeza de que me proporcionaram tudo aquilo que era preciso e necessário e, talvez, muito mais do que eu merecia.

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v

INDICE

1. RESUMO... 1

2. ABSTRACT... 3

3. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ... 5

3.1. Os insetos da Ordem Hymenoptera... 5

3.2. Alergia a venenos de Himenópteros ... 6

3.3. Diagnósticos e Tratamento de alergia ao veneno de Himenópteros... 9

3.4. Composição dos venenos de vespas ... 12

4. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ... 18

CAPÍTULO 1. ... 28

1. INTRODUÇÃO ... 29

2. OBJETIVOS ... 33

3. MATERIAIS E MÉTODOS... 34

3.1. Obtenção do veneno da vespa Polybia paulista ... 34

3.2. Eletroforese Bidimensional ... 34

3.3. Eletrotransferência... 35

3.4. Espectrometria de Massas ... 36

3.5. Identificação das Proteínas... 37

4. RESULTADOS E DISCUSSÃO ... 39

5. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ... 62

CAPÍTULO 2. ... 70

2. OBJETIVOS ... 78

3.1. Coleta das Amostras de Sangue ... 79

3.1.1. Relatos dos Casos ... 79

3.1.1.1. Acidentes provocados pela vespa Polybia paulista... 79

3.1.1.2. Acidentes provocados pela vespa Agelaia pallipes pallipes... 80

3.1.1.3. Acidente provocado pela abelha Apis mellifera... 80

(9)

vi

3.5. Imunodetecção ... 83

3.6. Espectrometria de Massas ... 84

CAPÍTULO 3. ... 103

2. OBJETIVOS ... 106

3.1. Materiais Biológicos ... 107

3.1.1. Obtenção do veneno da vespa Polybia paulista... 107

3.1.2. Obtenção dos soros dos pacientes sensibilizados ... 107

3.2. Clonagem e Determinação da Seqüência Protéica ... 107

3.3. Quantificação de Proteínas... 108

3.4. Purificação das fosfolipases pela Cromatografia de Troca Iônica ... 108

3.5. Atividade Fosfolipásica ... 109

3.7. Aquisição das Imagens... 110

3.8. Eletrotransferência ... 111

3.9. Microsequenciamento por Química Degradativa de Edman ... 112

3.10. Microsequenciamento C-Terminal ... 112

3.11. Imunodetecção ou Immunoblotting ... 112

3.12. Detecção de Glicoproteínas... 114

(10)

vii

CAPÍTULO 4. ... 138

2. OBJETIVOS ... 142

3.1. Materiais Biológicos ... 143

3.1.1. Obtenção do veneno da vespa Polybia paulista... 143

3.7.1. Obtenção dos soros dos pacientes sensibilizados ... 143

3.4. Imunodetecção ... 145

3.5. Detecção de Glicoproteínas... 147

3.6. Sequenciamento Peptídico ... 147

3.6.1. Sequenciamento por Química Degradativa de Edman ... 147

3.6.2. Microsequenciamento C-Terminal... 147

3.6.3. Microsequenciamento por Espectrometria de Massas MS/MS ... 148

3.8. Modelagem Molecular por Homologia ... 150

3.9. Avaliação do Modelo Estrutural pelo Prockeck ... 151

(11)

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ABREVIAÇÕES

% - por cento - Alfa - Beta L – Microlitros mol – Micromoles 2D – Bidimensional 3D – Tridimensional A° - Angstron

Ala - Resíduo de aminoácido alanina Arg - Resíduo de aminoácido arginina Asp - Resíduo de aminoácido asparagina BSA - Albumina Bovina

CBB – Coomassie Brilliant Blue cDNA – DNA complementar

CHAPS – Sulfato de 3-[(3-Colamidopropil)-dimetil-amônio]-1-propano

cm – Centímetros

Ca-C – Ângulo descrito pelo carbono alfa e carbono

Da – Daltons DDT – Ditioltreitol

DPP - Dipeptidil peptidase ECL – Quimiluminescência

FPLC - Cromatografia Líquida de Baixa Pressão

Gln - Resíduo de aminoácido glutamina Gly – Resíduo de aminoácido glicina HCl – Ácido Clorídrico

His – Resíduo de aminoácido de histidina HPLC – Cromatografia Líquida de Alta Pressão

HRP – Horseradish Peroxidase Complex hs – Horas

HSP – Proteínas de Choque Térmico IAA – Iodoacetamida

IgE – Imunoglobulina do tipo E

IgG – Imunoglobulina do tipo G IgM – Imunoglobulina do tipo M IPG – Gradiente imobilizado de pH Kb – Kilobites

KDa – Kilodaltons Kg – Kilogramas

Leu - Resíduo de aminoácido leucina M – Molar

m/v – Massa por volume m/z – Razão massa/carga mA – MiliAmper

mg – Miligramas min - Minutos mL – Mililitros mm – Milimetros mM – Milimolar

MS – Espectro de massas dos íons pais e/ou fragmentos peptídicos da amostra MS/MS – Espectro de massas resultante da fragmentação de um único íon e/ou fragmento peptídico, gerando sua seqüência peptídica correspondente NaCl – Cloreto de Sódio

N-Ca – Ângulo descrito pelo nitrogênio e carbono alfa

nm –Nanômetros nmol - Nanomol

º

C – Graus

PAGE - Gel de Eletroforese de Poliacrilamidade

PCR – Polymerase Chain Reaction PDB – Banco de dados de proteínas pI – Ponto isoelétrico

PLA1 – Fosfolipase A1

PLA2 – Fosfolipase A2

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Pro – Resíduo de aminoácido prolina PRP – Proteínas relacionadas com patogenicidade

PVDF - Fluoreto de Polivinilideno rpm – Rotação por minuto SDS - Dodecilsulfato de Sodio Ser - Resíduo de aminoácido serina TBS – Tampão Tris

TFA – Ácido trifluoracético U - Unidade

V – Volts

v/v – Volume por volume

Val - Resíduo de aminoácido valina µg - Microgramas

f – Ângulo phi – Ângulo psi

TRADUÇÕES

Coils – estruturas aleatórias

Gaps – espaços vazios numa seqüência de proteína ou DNA.

In-gel - proteínas localizadas na malha da poliacrilamida do gel de eletroforese

Loops – regiões conservadas

Primers – fragmentos de DNA iniciadores

Skin prick test – teste cutâneo para verificar se um individuo é alérgico ou não e, qual a

possível origem da alergia observada

Spot – mancha protéica ou proteína.

Template – modelo estrutural

Turns- voltas

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x

ÍNDICE DAS FIGURAS

CAPÍTULO 1...28

FIGURA 1: Microscopia eletrônica do aparelho de ferroar da vespa social Polybia paulista. (A) representa o reservatório de veneno, e (B) a lanceta do ferrão. Cedido por Rocha, T. (2005)...39

FIGURA 2: Gel de Eletroforese Bidimensional em SDS-PAGE 15%(m/v) do veneno da vespa social Polybia paulista. As proteínas foram focalizadas em fitas de pI de 3 a 10, com 13 cm de comprimento. Aproximadamente, 225 proteínas foram detectadas pela coloração de CBB...40

FIGURA 3: Provável mecanismo de ação dos componentes protéicos veneno da vespa social Polybia paulista durante o envenenamento de suas vítimas...60

FIGURA 1: Dados estatísticos fornecidos pelo Ministério da Saúde e pela Secretaria da Saúde do Estado de São Paulo, sobre o número anual de acidentes de ferroadas causados por insetos da ordem Hymenoptera...77

FIGURA 2: Gel de Eletroforese Bidimensional em SDS-PAGE 15%(m/v) do veneno da vespa social Polybia paulista. As proteínas foram focalizadas em fitas de pI de 3 a 10, com 7 cm de comprimento. Aproximadamente, 225 proteínas foram detectadas pela coloração de CBB...87

FIGURA 3: Imunodetecção com os soros dos pacientes sensibilizados com o veneno da vespa P.paulista, frente ao veneno de vespas da mesma espécie. As 16 proteínas assinaladas são

consideradas imunogênicas ao reagirem com IgE-específicas presentes nos soros dos pacientes sensíveis ao veneno de P. paulista...88

FIGURA 4: Imunodetecção com os soros dos pacientes sensibilizados com o veneno da vespa social Agelaia palipes palipes, frente ao veneno de P. paulista. As proteínas enumeradas conforme a numeração original mostrada na figura 2, apresentaram reação imunogênica cruzada ao reagirem com IgE-específicas presentes nos soros dos pacientes sensíveis ao veneno da A.p.pallipes...93

FIGURA 5: Imunodetecção com soro de paciente sensibilizado com o veneno da abelha Apis mellifera, frente ao veneno de P.paulista. As proteínas enumeradas conforme a numeração

original mostrada na figura 2, apresentaram reação imunogênica cruzada ao reagirem com IgE-específicas presentes no soro do paciente sensível ao veneno de A. mellifera...94

FIGURA 1: Seqüência do cDNA e sua tradução na forma de seqüência primária de aminoácidos para a Fosfolipase A1 do veneno da vespa social P.paulista. A região marcada de

cinza claro indica o peptídeo sinal, enquanto que a região marcada em cinza escuro indica o propeptídeo. O códon de finalização está indicado por *...116

(14)

xi

FIGURA 2: Alinhamento da seqüência da Fosfolipase A1 da P.paulista (PLA1_POLPA) com 12

lipases conhecidas: fosfolipase A1 humana (fosfatidilserina – PS), fosfolipase suína (PLRP2),

lipase pancreática humana (PL), lipase de células endoteliais humana (EDL), lipase lipoprotéica humana (LPL) e lipase hepática humana (HL), fosfolipase A1 de Vespula germânica (PLA1_VESGE), fosfolipase A1 de Vespula maculifrons (PLA1_VESMC), fosfolipase

A1 de Vespula vulgaris (PLA1_VESVU), fosfolipase A1 de Dolichovespula maculata

(PLA1_DOLMA), fosfolipase A1 de Polistes anularis (PLA1_POLAN) e fosfolipase A1 de Polistes dominulus (PLA1_POLDO). As estrelas indicam as posições dos resíduos de

aminoácidos da tríade catalítica, os pontos indicam os resíduos conservados de cisteínas; os resíduos de aminoácidos conservados em todas as seqüências desse alinhamento estão nas áreas negras...118

FIGURA 3: Alinhamento das seis seqüências primárias de Fosfolipases A1 de veneno de

vespas de espécies endêmicas no hemisfério norte (PLA1_VESGE, PLA1_VESMC, PLA1_VESVU, PLA1_DOLMA, PLA1_POLAN e PLA1_POLDO), em comparação com a enzima da espécie de vespa endêmica da região neotropical Polybia paulista; os resíduos de aminoácidos conservados em todas as seqüências desse alinhamento estão nas áreas negras...120

FIGURA 4: Perfil cromatográfico por Troca Catiônica do veneno bruto da vespa social P. paulista. O fracionamento foi realizado em coluna semi-preparativa Hiprep FF CM (160 mm x

10 mm, 20 mL – GE Amersham Biosciences), previamente equilibrada e eluída até os primeiros 20 minutos com tampão Acetato de Sódio 50 mM, pH 5,2, e então sob um gradiente linear de 0 a 1 M de NaCl no mesmo tampão de 20,01 a 180,00 minutos, num fluxo de 2 mL/,min; frações de 2 mL foram coletadas. A eluição foi monitorada por medidas de absorbância a 280 nm. A eluição das proteínas está representada pela linha contínua ( ____ ), enquanto que a linha (o ... o) representa a atividade fosfolipásica e (---) representa o gradiente de NaCl...121

FIGURA 5: Perfil cromatográfico por troca aniônica da fração A. O fracionamento foi realizado em coluna semi-preparativa Hitrap Q (16 mm x 25 mm, 1mL - Amersham Biosciences), pré-equilibrada com tampão Tris-HCl 20 mM, pH 8 acoplada a um sistema AKTA-FPL. A eluição foi realizada sob condições isocráticas durante os 3 primeiros minutos e então, sob gradiente linear de 0 a 1 M de NaCl no mesmo tampão de equilíbrio de 3.01 a 17.00 min; após esse período até os 30 minutos, a eluição foi realizada com tampão Tris-HCl 20 mM, pH 8, contendo NaCl 1M. O fluxo foi de 1 mL/mim, sendo coletadas frações de 1 mL; a eluição foi monitorada a 280 nm. A eluição das proteínas está representada pela linha contínua ( ______ ), enquanto que (o ……o) representa a atividade fosfolipásica e (---) representa o gradiente de NaCl...122

FIGURA 6: Perfil cromatográfico por troca aniônica da fração E. O fracionamento foi elaborado em coluna semi-preparativa Hitrap Q (16 mm x 25 mm, 1mL - Amersham Biosciences), pré-equilibrada com tampão Tris-HCl 20 mM, pH 8 acoplada a um sistema AKTA-FPL. A eluição foi realizada sob condições isocráticas durante os 3 primeiros minutos e então, sob gradiente linear de 0 a 1 M de NaCl no mesmo tampão de equilíbrio de 3.01 a 17.00 min; após esse período até os 30 minutos, a eluição foi realizada com tampão Tris-HCl 20 mM, pH 8, contendo NaCl 1M. O fluxo foi de 1 mL/mim, sendo coletadas frações de 1 mL; a eluição foi monitorada a 280 nm. A eluição das proteínas está representada pela linha contínua ( _____ ), enquanto que (o ……o) representa a atividade fosfolipásica e (---) representa o gradiente de NaCl...123

(15)

xii

FIGURA 8: Gel de Eletroforese Bidimensional 15%(v/v) do veneno bruto da vespa Polybia paulista, mostrando as nove isoformas de fosfolipases identificadas nas frações A1 e E1,

oriundas do fracionamento do veneno da vespa P.paulista por cromatografia de troca aniônica. As proteínas foram focalizadas em fitas de pI de 3 a 10, com 7 cm de comprimento e a coloração realizada com CBB. Os spots enumerados de 1 a 9 representam as nove isoformas de PLA1 identificadas no veneno...125

FIGURA 9: Perfil protéico da eletroforese 2-D da mistura das frações A-1 e E-1, onde as glicoproteínas foram coradas com o corante fluorescente Pro-Q Emerald 300. A visualização foi realizada por fluorescência sob luz UV a 300 nm...129

FIGURA 10: Imunodetecção da mistura das frações A -1 e E-1 com os soros dos pacientes sensíveis ao veneno da vespa P.paulista...130

FIGURA 1: Gel de Eletroforese Bidimensional em SDS-PAGE 15%(m/v) do veneno da vespa social Polybia paulista. As proteínas foram focalizadas em fitas de pI de 3 a 10, com 13 cm de comprimento. Aproximadamente, 225 proteínas foram detectadas pela coloração de CBB. Os

spots enumerados são as isoformas do alérgeno Antígeno 5 e do alérgeno Sol i III

identificados pela análise proteômica do veneno bruto da P. paulista...153

FIGURA 2: Espectro de massas MALDI-TOF-MS obtido após a digestão do spot 125 com a enzima Tripsina. Os fragmentos de massas estão enumerados conforme sua localização na seqüência primária do Antígeno 5 em estudo...156

FIGURA 3: Espectro de Massas MALDI-TOFMS obtido após a digestão do spot 125 com a enzima Quimiotripsina. Os fragmentos de massas estão enumerados conforme sua localização

na seqüência primária do Antígeno 5 em

estudo...157 FIGURA 4: Espectro de massas MALDI-Tof-MS obtido após a digestão do spot 125 com a enzima Protease V8. Os fragmentos de massas estão enumerados conforme sua localização na seqüência primária do Antígeno 5 em estudo...158

FIGURA 5: Seqüência primária do Antígeno 5 do veneno da vespa social Polybia paulista obtida por superposição dos fragmentos peptídicos obtidos por digestão do spot 125 com Tripsina, Quimiotripsina e Protease V8 e seqüenciados por espectrometria de massas tandem, com aqueles seqüenciados por química Degradativa (N- e C-terminal) à partir do sequenciamento da proteína correspondente ao spot 125 por Química Degradativa...159

FIGURA 6: Alinhamento do Antígeno 5 da vespa social Polybia paulista (Ag5_POLPA) com a seqüência primária do Antígeno 5 da P.scutellaris (Ag5_POLSC) e com as seqüências consensos do alérgeno Antígeno 5 dos principais gêneros de vespa: Vespa, Dolichovespula,

Vespula e Polistes. As regiões de identidades mais importantes estão assinaladas em preto,

enfatizando os resíduos altamente conservados nesse tipo de alinhamento...161

FIGURA 7: Modelo da estrutura tridimesional da proteína Antígeno 5 gerado à partir do programa MolMol (KORADI et al., 1996)...163

(16)

xiii

FIGURA 9: Perfil protéico da eletroforese 2-D do veneno bruto da vespa P. paulista, onde 16 glicoproteínas foram coradas com o corante fluorescente Pro-Q Emerald 300. A visualização foi realizada por fluorescência sob luz UV a 300 nm. Os spots 125 e 134 assinalados são isoformas glicoprotéicas do alérgeno Antígeno 5...168

FIGURA 10: Imunodetecção do veneno da vespa P. paulista com os soros dos pacientes sensíveis ao veneno da mesma vespa. Dezesseis proteínas são imunoreativas, sendo que os

spots assinalados correspondem ao alérgeno Antígeno 5...169

FIGURA 11: Seqüência primária do Antígeno 5. A indicação das prováveis clivagens que ocorreram para gerar as isoformas do Antígeno 5 presentes no veneno da P. paulista estão representadas pelos números maiores correspondem aos números dos spots onde tais formas

(17)

xiv

INDICE DAS TABELAS

TABELA 1: Identificação das proteínas que provavelmente constituem o veneno da vespa social Polybia paulista (Hymenoptera, Vespidae)...42

TABELA 2: Proteínas identificadas provavelmente oriundas da musculatura que envolve o reservatório de veneno da vespa Polybia paulista...53

TABELA 3: Proteínas identificadas provavelmente oriundas das células rompidas do reservatório de veneno da vespa Polybia paulista...56

TABELA 1: Proteínas identificadas como imunogênicas ao veneno de P. paulista contra os soros dos pacientes sensibilizados com o veneno dessa vespa...89

TABELA 2: Proteínas identificadas como imunogênicas no veneno da P.paulista que apresentaram reatividade cruzada com IgE-específicas para o veneno de

A.p.pallipes...93

TABELA 3: Proteínas identificadas como imunogênicas no veneno da P.paulista que apresentaram reatividade cruzada com IgE-específicas para o veneno de Apis

mellifera...94

TABELA 1: Dados da purificação das isoformas de fosfolipase A1 e recuperação da atividade

fosfolipásica nas diferentes etapas do protocolo de purificação...126

TABELA 2: Propriedades Proteômicas das Fosfolipases A1 e A2 do veneno da vespa social P. paulista...127

TABELA 3: Seqüências N- e C-terminais, massas moleculares hipotéticas e localização das seqüências das sete isoformas de PLA1 do veneno da vespa P. paulista ao longo de toda

seqüência primaria da enzima intacta em sua forma ativa...128

TABELA 4: Propriedades glicoprotéicas e imunológicas das isoformas de PLA1 do veneno da P.paulista...131

CAPÍTULO 4...138 TABELA 1: Caracterização molecular dos Antígenos 5 e do Alérgeno Sol i III do veneno da vespa social P. paulista. As seqüências parciais foram obtidas pela digestão tríptica dos spots recortados do gel de eletroforese bidimensional do veneno bruto da vespa em estudo, sendo que os peptídeos resultantes foram detectados por espectrometria de massas MALDI-TOF-MS e seqüenciados por espectrometria de massas MS/MS...154

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xv

TABELA 2: Fragmentos peptídicos do spot 125 gerados pela digestão com a enzima tripsina e seqüenciados por espectrometria de massas tandem. Os resíduos de aminoácidos indicam a localização do fragmento na seqüência primária da proteína em estudo...156

TABELA 3: Fragmentos peptídicos do spot 125 gerados pela digestão peptídica com a enzima quimiotripsina e seqüenciados por espectrometria de massas tandem. Os resíduos de aminoácidos indicam a localização do fragmento na seqüência primária da proteína em estudo...157

TABELA 4: Fragmentos peptídicos do spot 125 gerados pela digestão peptídica com a enzima Protease V8 e seqüenciados por espectrometria de massas tandem. Os resíduos de aminoácidos indicam a localização do fragmento na seqüência primária da proteína em estudo...158

TABELA 5: Valores de identidade e similaridade entre as seqüências primárias consensos do alérgeno Antígeno 5 dos principais gêneros de vespa já estudados...162

TABELA 6: Seqüências N- e C-terminais, massas moleculares hipotéticas e localização das seqüências das sete isoformas do Antígeno 5 do veneno da vespa P. paulista ao longo de toda seqüência primaria da enzima intacta em sua forma ativa...166

(19)

Resumo

1. RESUMO

A prevalência de sensibilização de humanos aos venenos de

himenópteros sociais foi estimada entre 9,3% e 28,5% na população mundial;

muitas das alergias causadas por insetos desta ordem são provocadas por

ferroadas de abelhas (família Apidae), vespas (família Vespidae) e formigas

(família Formicidae). Há um interesse crescente no conhecimento da estrutura

e função dos componentes do veneno desses insetos, principalmente no

campo da imunologia clínica. Entre os Hymenoptera sociais, os venenos de

abelhas e vespas endêmicas do hemisfério norte têm sido extensivamente

estudados e, principalmente, seus componentes foram isolados e identificados.

Por outro lado, os venenos de espécies de vespas das regiões neotropicais

como aquelas típicas da biodiversidade brasileira têm sido pouco

caracterizados. Apesar da ausência de dados epidemiológicos sobre esse

assunto, a prática clínica diária mostra que as reações alérgicas ao veneno de

Himenópteros são bastante freqüentes no Brasil. Cerca de 500 espécies

diferentes de vespas sociais são conhecidas em todo Brasil; a maioria dessas

espécies apresenta diferentes tipos de comportamentos biológicos em relação

àquelas espécies endêmicas do hemisfério norte. Os extratos comercialmente

disponíveis de extratos de venenos de vespas usados para diagnósticos e

terapias de pacientes alérgicos a venenos de vespas são oriundos dos Estados

Unidos e/ou da Europa. Apesar da história de reações sistêmicas após a

ferroada destes insetos, a maioria dos pacientes brasileiros (sensíveis aos

venenos de vespas) apresentam testes cutâneos negativos quando extratos de

venenos importados são utilizados nesses testes. Com o objetivo de

aperfeiçoar e alcançar uma melhor compreensão da bioquímica e imunologia

dos venenos das principais espécies de vespas do Sudeste do Brasil, o veneno

da vespa social Polybia paulista (uma espécie muito agressiva que causa

muitos acidentes por ferroadas todos os anos no Estado de São Paulo) foi

investigado. Esse veneno foi submetido a uma abordagem proteômica para

identificar os componentes protéicos e as principais proteínas alergênicas

foram bioquimicamente e imunologicamente caracterizadas. Dois grandes

(20)

Resumo

vespas (toxinas); 2) as proteínas contaminantes provavelmente oriundas da

ruptura das células das membranas dos músculos que envolvem o reservatório

de veneno e da glândula de veneno. A análise proteômica revelou cerca de 225

proteínas, das quais 94 foram identificadas, sendo as mais abundantes:

Fosfolipases -A1 e -A2 (PLA1 e PLA2), Antígeno 5, Hialuronidase,

Metaloproteinases, Desintegrinas, Superóxido Dismutase, Proteínas de

Choque Térmico e Argininas Quinases. Análises de imunodetecção com os

soros de pacientes sensíveis ao veneno da P.paulista revelaram que 16

proteínas foram imunoreativas, as quais provavelmente constituem os

alérgenos imunodominantes desse veneno. Entre essas proteínas, foram

identificadas PLA1, Antígeno 5, Hialuronidase e Arginina Quinase. A

investigação das reações cruzadas com os soros dos pacientes sensíveis aos

venenos de abelha (Apis mellifera) e outra espécie de vespa social (Agelaia

pallipes pallipes) revelou que a forma intacta do Antígeno 5 foi o alérgeno

comum, o qual provavelmente pode ser considerado o principal alérgeno

imunodominante do veneno da P.paulista. Dois importantes alérgenos foram

bioquimicamente e imunologicamente caracterizados: a PLA1 e o Antígeno 5. A

PLA1 foi purificada e a forma intacta e ativa da PLA1 foi clonada a partir de

RNAm, sendo então preparado seu cDNA, que foi seqüenciado; 7 diferentes

isoformas dessa enzima foram identificadas pela abordagem proteômica, das

quais 3 foram imunoreativas à IgE-específica; duas dessas isoformas

apresentaram carboidratos anexados à elas. Seis isoformas de Antígeno 5

foram identificadas; a seqüência completa de forma intacta desse alérgeno foi

obtida pela combinação de Digestões Proteolíticas in gel, Sequenciamento

peptídico por Espectrometria de Massas e pelos métodos de Química

Degradativa (N- e C-terminal). Quatro isoformas dessa proteína foram

imunoreactivas à IgE-específica; duas delas também apresentaram

carboidratos anexados à elas. A estrutura tridimensional da forma intacta do

Antígeno 5 foi modelada por ferramentas de Bioinformática Estrutural,

revelando que a proteína é constituída de 5 regiões de estruturas secundárias

(21)

Abstract

2. ABSTRACT

The prevalence of human sensitivity to social Hymenoptera venom was

estimated from 9.3 to 28.5% of word population; many allergies are caused by

stingings of the insects representatives of Hymenoptera order such as bees

(Apidae), ants (Formicidae) and wasps (Vespidae). There is a keen interest in

the knowledge about the structure and function of the venom components of

these insects, mainly in the field of clinical immunology. Among the social

Hymenoptera the venoms of honeybees and wasps endemic from the North

Hemisphere have been extensively studied and many of their components were

isolated and identified. Meanwhile, the venoms of wasps species from the

Neotropical regions of the planet like those typical of Brazilian biodiversity have

been poorly characterized. Despite the absence of epidemiological data about

this subject in the most of Brazilian regions, it well known by the doctors that

this type of accident of very frequent in Southeast Brazil. About five hundreds

different species of social wasps are reported all over Brazil; the large most of

these species present different biology and aggressive behaviour in relation to

those species endemic from the cold regions of the planet. The commercially

available wasp venom extracts used for diagnosis and therapy of allergic

patients to wasp venoms are produced by foreign pharmaceutical companies

with the venom of wasp species obtained in United States and/or Europe.

Despite of the history of systemic reactions when stung by local wasp species,

the most of Brazilian patients (sensitive of wasps venoms) present negative skin

tests when imported venom extracts are used in these tests. With the aim to

improve the knowledge and to get a better understanding about the

biochemistry and immunology of venoms of the most abundant wasp species

from Southeast Brazil, the venom of the social wasp Polybia paulista (a very

aggressive specie which causes many stinging accidents all over year in São

Paulo Sate) was investigated. This venom was submitted to a proteomic

approach to identify the protein components and the most important allergenic

proteins were biochemically and immunologically characterized. Two large

groups of proteins were identified in the venom: i) the typical wasp venom

(22)

Abstract

disrupture both of the muscles involving the venom reservoirs and also from the

venom glands. The proteomic analysis revealed about 225 proteins, from which

the 94 most abundant ones were identified; The most important are:

Phospholipases -A1 and -A2, Antigen 5, Hyaluronidase, Metalloproteinases,

Desitegrins, Superoxide Dismutase, allergenic proteins and Arginine Kinases.

Immunoblotting analysis with the sera of patients sensitive to P. paulista venom

revealed 16 IgE-immunoreactive proteins, which probably constitute the

immunodominant allergens in this venom. Among these proteins were identified

Phospholipase-A1, Antigen 5, Hyaluronidase and Arginine Kinase. The

investigation of immunological crossed reactions with the sera of patients

sensitive to the venoms of honeybees (A. mellifera) and another social wasp

(A. p. pallipes) revealed that the intact form of Antigen 5 was a common

allergen, which probably constitutes the major immunodominant protein from P.

paulista venom. Two important allergens were biochemically and

immunologically characterized: the Phospholipase A1 and Antigen 5. The

Phospholipase-A1 was purified and the intact and active form of

Phospholipase-A1 was cloned from its cDNA and sequenced; seven different isoforms of this

enzyme were identified by a proteomic approach, from whose three isoforms

were immunoreactive to specific-IgE; two of these isoforms presented

carbohydrates attached to their molecules. Six isoforms of Antigen 5 were

identified; the complete sequence of the intact form of this allergen was

obtained by using the combination of in gel proteolytic digestions, mass

spectrometry peptide sequencing and Western Blotting associated to

microsequencing through degradation chemistry methods (N- and C-terminal

sequencing). Four isoforms of this protein were immunoreactive to specific-IgE;

two of these isoforms also presented carbohydrates attached to their molecules.

The 3-D structure for the intact Antigen 5 was modeled by using structural

biology bioinformatic tools, revealing a protein constituted of five regions of

secondary structure presenting -helices, five regions presenting structure of ß–

(23)

Revisão Bibliográfica

3. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

3.1. Os insetos da Ordem Hymenoptera

A extraordinária dominância dos insetos e outros artrópodes nos

continentes pode ser atribuída à imensa diversidade de mecanismos químicos

de defesa. Além das secreções glandulares de defesa, alguns artrópodes

desenvolveram armas químicas defensivo-ofensivas sofisticadas. Neste

aspecto, o aparecimento de venenos e do aparelho de ferroar entre os insetos

representa atributos evolucionários que contribuíram para a adaptação desses

animais em diferentes ambientes terrestres (WHITMAN et al., 1990). Além

disso, diferentes ordens de insetos “criaram” suas armas biológicas,

particularmente os himenópteros (abelhas, vespas e formigas), que

desenvolveram em seu veneno e aparelho de ferroar de acordo com sua

biologia e comportamento (PALMA, 2006).

A ordem Hymenoptera é composta por aproximadamente 100.000

espécies de abelhas, vespas e formigas. Muitos membros pertencentes a esta

ordem desenvolveram glândulas especializadas na produção de veneno e um

aparelho de ferroar, os quais podem ser usados tanto na caça de presas

quanto em sua própria defesa (STEEN et al., 2005).

Os insetos da ordem Hymenoptera podem ser classificados em dois

grupos, de acordo com sua história evolutiva: social e solitário. A maioria dos

Hymenoptera solitários desenvolveu um veneno especializado, principalmente

para causar paralisia das presas, permitindo assim, o desenvolvimento de suas

larvas em suas próprias presas. Dentre outras atividades, alguns componentes

desses venenos ainda podem causar paralisia parcial ou permanente nas

presas, enquanto outros podem agir na prevenção de contaminações do

alimento ou de infecções da progênie futura.

As vespas pertencentes ao grupo dos Hymenoptera Aculeata (com

ferrão) estão divididas em três grandes superfamílias: Bethyloidea, Sphecoida

e Vespoidea. A família Vespidae é uma subdivisão da superfamília Vespoidea,

onde são encontrados os casos de eusociabilidade em vespas, com mais de

800 espécies eusociais. Estas vespas habitam colônias fundadas por apenas

(24)

família de vespas é composta por três subfamílias, Stenogastrinae, Polistinae e

Vespinae, onde a subfamília Polistinae é a única encontrada no Brasil, sendo

representada por três tribos: Polistini, Epiponini e Mischocyttarini. A tribo

Epiponini é constituída por 23 gêneros e 405 espécies, dentre as quais a

espécie Polybia paulista está localizada (CHAUD-NETTO et al., 1994). Nesse

estudo, o veneno da vespa social Polybia paulista será o estudo alvo, uma vez

que, muitos acidentes por ferroadas dessa vespa ocorrem no Estado de São

Paulo.

3.2. Alergia a venenos de Himenópteros

Os venenos dos himenópteros sociais possuem componentes que estão

relacionados principalmente ao comportamento de defesa desses animais, ou

seja, na proteção de suas colônias contra o ataque de predadores. Os

principais efeitos desses venenos são as reações inflamatórias e/ou

imunológicas em suas vítimas. Algumas vezes é possível observar a ocorrência

de efeitos sistêmicos, como por exemplo, deficiência respiratória podendo

chegar até à morte (CASTRO, 2001).

As reações sistêmicas de maior importância médica são aquelas que

afetam os sistemas respiratório e/ou circulatório. Em geral, são caracterizadas

como reações cutâneas, vasculares ou respiratórias. As reações cutâneas que

afetam somente a pele se manifestam como urticária, angiodema, coceira,

inchaço ou eritema. As reações vasculares envolvem o sistema circulatório,

muitas vezes com queda de pressão arterial e aumento da permeabilidade

vascular. Essas reações podem levar à inconsciência e desmaios. Já as

reações respiratórias, consistem em inchaços ou aumento de fluídos no

sistema respiratório. São caracterizadas por dificuldade de respirar, espirros,

edema de glote, contração do pulmão, displasia e asma. Em pacientes

sensíveis, podem ocorrer ainda, desordens gastrointestinais, cólicas, diarréia,

náusea, vômito, incontinência, dor de cabeça, calafrio e febre (SCHMIDT,

1986).

(25)

permeabilidade dos vasos sanguíneos da pele. A dor pode continuar por várias

horas e a ardência por alguns dias. Além dessa ação direta da ferroada da

vespa, em muitos casos podem ser observadas reações alérgicas, e até

mesmo anafiláticas, que muitas vezes, chegam a ser letais (OLIVEIRA, 2000).

A grande maioria das mortes causadas por ferroadas de vespas está

diretamente relacionada ao desencadeamento de reações imunológicas, porém

algumas se devem à toxicidade direta do veneno (LORENZI, 2002).

Devido a componentes vasoativos do veneno de himenópteros, muitas

pessoas apresentam reações locais quando ferroadas por vespas,

consistindo-se em: rubores, edemas e dores prolongadas. Essas reações são limitadas,

pois desaparecem em poucas horas. Se a ferroada ocorrer próximo da ou na

cavidade oral, pode haver um comprometimento da respiração da vitima.

Ocasionalmente, as vitimas de ferroadas podem permanecer com os edemas

por várias semanas, podendo agravar se infecções secundárias vierem ocorrer

nos locais da ferroada, o que é comum em acidentes de ferroadas de formigas.

Por outro lado, há vários eventos conseqüentes da ferroada de vespas como

pruridos locais, urticária, angiodema, náuseas, vômitos, diarréia, dores

abdominais, perda de memória e tontura. As reações sistêmicas são os

quadros mais agravantes, os quais envolvem hipotensão, aritimia, bronco

espasmos, paradas cardíacas e respiratórias e morte do paciente (REISMAN et

al., 1989; FREEMAN, 2004).

A prevalência de sensibilização contra esses insetos foi estimada entre

9,3% e 28,5% na população mundial (ANTONICELLI et al., 2002). Muitas das

alergias causadas por insetos da ordem Hymenoptera são provocadas por

ferroadas de abelhas (família Apidae), vespas (família Vespide) e formigas

(família Formicidae). Há um interesse crescente em relação aos componentes

químicos dos venenos destes insetos, sobretudo no campo da alergia e

imunologia clínica (ROSS et al., 2000). Dentre os himenópteros sociais, os

venenos de abelhas e vespas endêmicos do hemisfério norte têm sido

extensivamente estudados e muitos de seus componentes moleculares, já

(26)

enquanto que os componentes dos venenos das espécies neotropicais como

as espécies brasileiras, têm sido pouco estudados.

A prevalência de alergia a venenos destes insetos é avaliada

freqüentemente devido aos altos índices de acidentes por ferroada. Estudos

epidemiológicos realizados em países europeus demonstraram que 20% das

vítimas de acidentes por ferroadas por esses insetos apresentam sintomas

alérgicos locais, 15% apresentaram reações sistêmicas e 17% dos casos eram

pacientes assintomáticos. Apesar de não apresentarem reações após as

ferroadas, esses pacientes apresentaram testes positivos de IgE específica, o

que pressupõe que os mesmos estão predispostos a desenvolver sintomas

alérgicos num próximo acidente (NITTNER-MARSZALSHA et al., 2004).

McDougle et al. (1995) ao questionarem indivíduos de 37 estados Norte

Americanos, verificaram que 70% dos indivíduos entrevistados eram sensíveis

a venenos de himenópteros, pois sofreram reações alérgicas e/ou anafiláticas

nos últimos 12 meses, quando ferroados por vespas, formigas ou abelhas,

sendo que poucos procuraram tratamentos imunoterápicos.

Esher et al. (2001), avaliando 138 pacientes com histórico de reações

alérgicas a abelhas, vespas e formigas no Brasil, relataram que os métodos de

determinação para IgE específica, apresentam baixa sensibilidade e

especificidade em nosso meio, principalmente para os componentes dos

venenos de vespas. Provavelmente, a grande diversidade de espécies no

Brasil é diferente daquelas utilizadas para a obtenção dos extratos usados para

diagnóstico e tratamento imunoterápico, provenientes da Europa e Estados

Unidos.

Embora os venenos de himenópteros sociais apresentem vários tipos de

peptídeos e proteínas, alguns dos quais são capazes de induzir toxicidade e

respostas vasoativas, é estimado que aproximadamente 1500 ferroadas

fossem necessárias para injetar uma dose letal de veneno de Hymenoptera

num homem adulto de 70Kg (GODDARD, 2003). Apesar dessa estimativa, 40

mortes por ano são atribuídas a ferroadas de Hymenoptera sociais nos EUA

(27)

desenvolveram IgE específica para vários componentes do veneno (REISMAN

et al., 1989).

Kim et al. (2001), ao estudar um grupo de pacientes sensibilizados pelo

veneno da formiga Pachycondyla chinensis, relatou manifestações clínicas de

processos anafiláticos característicos como: urticária, rinites alérgicas,

hipersensibilidade brônquica, paradas cardíacas e perda da consciência.

Nas reações por venenos de insetos podem estar envolvidos os

mecanismos básicos de hipersensibilidade: (1) imediata, com a participação de

IgE específica, porém, doses elevadas de veneno neste tratamento

(Imunoterapia), podem provocar anafilaxia e até mesmo, morte do indivíduo

alérgico; (2) citotóxica, com a participação de anticorpos IgG e IgM contra

antígenos da superfície celular ou da matriz celular; mas esta

hipersensibilidade pode causar doenças como anemia hemolítica; (3) por

acúmulo de imunocomplexos, com a participação de imunocomplexos

circulantes IgG e IgM com antígenos de venenos, que, quando em grande

quantidade, depositam-se próximos ao leito vascular e ativam o sistema

imunológico complemento. O exemplo clínico mais característico dessa

hipersensibilidade é a doença do soro, ou seja, baixa qualidade e quantidade

de células de defesa presentes no organismo; e (4) por mecanismos tóxicos e

pseudo-alérgicos, que são reações resultantes das ações farmacológicas dos

componentes dos venenos. Isso pode ser exemplificado na mastocitose, na

qual os mastócitos são ativados diretamente, levando a degranulação, seguida

da liberação de mediadores químicos, e também no envolvimento da ativação

do sistema complemento, com a produção de anafilotoxinas e subprodutos

biologicamente ativos (CASTRO, 2001).

3.3. Diagnósticos e Tratamento de Alergia ao Veneno de Himenópteros

Os venenos de insetos são largamente utilizados nos diagnósticos e

tratamentos de alergias provocadas por ferroadas dos mesmos. Nesses

tratamentos imunoterápicos, de nanogramas a microgramas de veneno bruto

são injetados no indivíduo alérgico, para se obter imunidade em ferroadas

(28)

do nível de anticorpos IgG e diminuição do nível do antígeno IgE no organismo

do indivíduo alérgico (KING,1989). Atualmente, a especificidade da

imunoterapia tem mostrado resultados efetivos em pacientes alérgicos; porém,

a mesma deve ser ministrada por especialistas treinados para usar técnicas

emergenciais, caso ocorram reações anafiláticas (BOUSQUET, 1998).

A utilização de venenos de himenópteros para diagnósticos e tratamento

de reações alérgicas a ferroadas de insetos da ordem Hymenoptera foram

introduzidos no final dos anos 70 (JOHANSSON et al., 2001). Métodos

diagnósticos de alergia são extensivamente aplicados para auxiliar no

tratamento de pacientes sensíveis ao veneno desses insetos. História clínica

de reação sistêmica após uma ferroada de insetos venenosos, teste de pele

intradermal, sorologia para quantificação de IgE específica e imunoterapia

específica anti-IgEs são alguns dos métodos empregados atualmente

(HAMILTON et al., 2004).

A eficácia da imunoterapia específica no tratamento de pacientes

hipersensíveis ao veneno de himenópteros sociais foi demonstrada por Ross et

al. (2000) durante uma análise minuciosa em casos de imunoterapias

realizados entre 1966 a 1996, onde 453 pacientes sensíveis foram envolvidos.

Nesta meta-análise, concluiu-se que há uma significativa redução na taxa de

reações sistêmicas quando uma subsequente exposição ao veneno ocorre

paralelamente com um tratamento de imunoterapia específica. Estudos

realizados por Oude Elberink et al. (2002), revelaram que a imunoterapia

resultou numa importante melhoria na qualidade de vida em relação à saúde

dos pacientes alérgicos ao veneno de vespas após essa desensibilização.

Testes de provocação durante a imunoterapia mostraram que 95% dos

pacientes alérgicos a venenos de vespas foram completamente protegidos e

não desenvolveram sintomas de alergia generalizada, enquanto que nos

pacientes sensíveis ao veneno de abelhas, essa proteção foi de 80-90%.

Porém, efeitos colaterais durante a imunoterapia ocorreram em 20-40% dos

pacientes durante o tratamento com veneno de abelha e 5 a 10% dos

(29)

aperfeiçoamento de diagnósticos e da imunoterapia para o tratamento de

alergia a venenos de himenópteros ainda se faz necessário (MULLER, 2002).

Muitos projetos proteoma que envolvem bioquímica, genética e métodos

computacionais (bioinformática proteômica) estão sendo amplamente

utilizados para elucidar funções de milhares de proteínas. Os resultados têm

promovido valiosas informações para a compreensão dos processos

fisiológicos básicos e para o desenvolvimento de novas terapias. O

desenvolvimento de extratos específicos para o tratamento de pacientes

sensíveis ao veneno de vespas se faz necessário, uma vez que, podem existir

proteínas no veneno que causem lesões teciduais e/ou ações farmacológicas

indesejáveis, porém sem apresentar qualquer imunoreatividade.

Atualmente, o diagnóstico de alergias e os processos de imunoterapia

específica a venenos de himenópteros sociais são elaborados com extratos

brutos, os quais geralmente são composições muito complexas, constituídos de

um grande número de proteínas. Não é possível determinar a composição

exata dos venenos; além disso, fatores naturais como degradação das

proteínas e heterogenidade da origem dos alérgenos, podem acarretar

problemas durante os diagnósticos de alergia e processos de imunoterapia

(NIEDERBERGER et al., 2004).

Estudos demonstraram que 20% dos indivíduos que não apresentam

histórico de reações sistêmicas por ferroadas de himenópteros mostraram

testes cutâneos positivos. Desses pacientes, 30 a 50% reagiram a

subseqüentes ferroadas (RUEFF et al., 2001; MULLER, 2002). Dessa forma,

os testes cutâneos e a determinação in vitro da IgE específica apresentam um

valor preditivo limitado, mesmo quando o indivíduo alérgico possui uma história

de reação sistêmica, pois, os extratos comercialmente disponíveis para a

realização dos testes, são provenientes de outros países e em muitas ocasiões

como é o caso das vespas, diferem das espécies encontradas no Brasil e

geralmente não apresentam reações imunogênicas cruzadas (PALMA et al.,

(30)

3.4. Composição dos Venenos de Vespas

Os alérgenos encontrados nos venenos de vespas apresentam a

propriedade de sensibilizar, ou seja, induzir o sistema imune a produzir

anticorpos com elevada especificidade, e, desencadear sintomas alérgicos em

pacientes sensibilizados. Um dos maiores desafios da alergologia molecular é

predizer o potencial alergênico das proteínas (AALBEESE, 2000). Estudos

moleculares que levam à identificação dos epítopos imunogênicos dos

alérgenos são muito relevantes, porque permitem identificar as regiões da

molécula do alérgeno que interagem com os anticorpos do paciente

sensibilizado (ASTWOOD et al., 1996). Os alérgenos mais importantes

geralmente são caracterizados por: 1) serem solúveis, estáveis e apresentarem

uma compactação na sua estrutura tridimensional (TEUBER et al., 1998) e 2)

pela prevalência de IgE nos pacientes que são sensibilizados pelos mesmos

(BREITENEDER et al., 1999).

Os venenos de vespas sociais são ricos em peptídeos biologicamente

ativos e proteínas, responsáveis pelas dores prolongadas, edema, eritema,

reações alérgicas e sistêmicas (LORENZI, 2002). Normalmente, estes venenos

contêm vários tipos de aminas biogênicas, peptídeos e proteínas (NAKAJIMA

et al., 1986). Os principais alérgenos dos venenos de vespas são: fosfolipases

A1, hialuronidases e antígenos 5 (KING et al., 1996). Um quarto alérgeno,

serino-protease, foi identificado recentemente nestes venenos (Mc NAIRY et

al., 2000). Além disso, o tamanho das moléculas e a presença de determinadas

proteínas aumentam as propriedades antigênicas do veneno, sendo assim, um

potente ativador do sistema imune (VETTER et al., 1998).

Estudos de Wood et al. (1983) demonstraram a complexidade de vários

venenos de himenópteros. Cerca de 40 proteínas foram isoladas dos venenos

de Apis mellifera, Polistes fuscatus, P.apachus, P. Metricus, P. exclamans, P.

annularis, Vespula flavopilosa, V. squamosa, V. sulphurea, Dolichovespula

maculata e Vespa Cabro; esses registros são pioneiros na literatura mundial na

caracterização do perfil protéico de venenos de himenópteros. Esses estudos

(31)

processos de imunoterapias dependem do conhecimento sobre a composição

desses venenos e da compreensão de seus mecanismos de ação.

Hoffman et al. (1984) obtiveram cinco proteínas alergênicas do veneno

bruto da vespa Vespula maculifrons, isolando-as por eletroforese

bi-dimensional, entre as quais estão a Vmacl (97 KDa), a Hialuronidase (46 KDa),

a Vmac3 (39 KDa), as Fosfolipases A e B (34 KDa) e o Antígeno 5 (22 KDa).

Há vários antígenos comuns entre os diferentes venenos de vespas sociais do

Hemisfério Norte (FOUBERT et al., 1958; HOFFMAN, 1985).

As Polibitoxinas -I, -II, -III e –IV do veneno da vespa Neotropical Polybia

paulista foram purificadas e caracterizadas bioquimicamente. Elas são

fosfolipases A2 com potentes atividades hemolíticas (OLIVEIRA et al., 1998).

Estudos comparativos sobre o efeito da fosfolipase A2 foram realizados com

anti-soros de venenos de abelhas (Apis melífera) e de vespas (Vespula

arenaria, V.vulgaris. e V maculata), onde verificou-se que o anti-soro do veneno

de A. melifera foi capaz de neutralizar a atividade da fosfolipase A2 do veneno

bruto da abelha. No entanto, os anti-soros contra a PLA2 das três vespas, não

inibiram a atividade da fosfolipase A2 dos respectivos venenos brutos (NAIR et

al., 1976).

COSTA et al. (2000) isolaram uma toxina a partir do veneno da vespa A.

p.palipes, designada Agelotoxina, a qual apresentou atividade de fosfolipase A2

e também mostrou atividade hemolítica cerca de 220 vezes mais potente que a

PbTx de P.paulista, 740 vezes mais que a PLA2 de A.mellifera, 570 vezes mais

que a PLA2 de Naja nigricolis e 1250 vezes mais potente que a cardiotoxina de

Naja naja atra.

Entre as diversas espécies de vespas asiáticas, as espécies Vespa

basalis, V. mandarinia e V. verutina são responsáveis pela morte de muitos

indivíduos dessa região. Dessa forma, Ho e colaboradores (1999) trabalhando

com o veneno da V. verutina isolaram três toxinas designadas Verutoxinas

VT-1 (34,9 KDa), VT-2a (33,3 KDa) e VT-2b (33,3 KDa). Neste estudo, a VT-VT-1

mostrou maior atividade fosfolipásica A2, enquanto que, as isotoxinas VT-2 a e

(32)

A fosfolipase A2 constitui cerca de 12% do veneno de abelhas; ela é

capaz de causar efeitos farmacológicos como: hipotensão, aumento da

permeabilidade vascular (REISMAN et al., 1987), além de contrações

musculares e paradas respiratórias (NAIR et al., 1976).

A purificação e caracterização de duas fosfolipases B, denominadas de

e , foram obtidas do veneno da Vespa mandarinia, apresentando massas

moleculares de 29,5 e 26,0 KDa, respectivamente; ambas ainda apresentaram

atividades hemolíticas e cardiotóxicas, assim como as fosfolipases reveladas

em outras espécies de vespas (ABE et al., 2000).

Estudos demonstraram que a toxicicidade do veneno de vespas

requerem a ação sinérgica dos componentes inflamatórios do veneno.

Segundo King et al. (2003), um mastoparano com ação degranuladora de

mastócitos, potencializa a ação da fosfolipase A1 nas respostas associadas aos

processos inflamatórios.

As fosfolipases também induzem IgE específica, hidrolisam fosfolipídeos

da membrana celular, agem sinergisticamente com outras toxinas, causando

lise de eritrócitos e mastócitos, hipotensão e podem inibir a coagulação

sanguínea (NAKAJIMA, 1986; HO et al., 1994). Estudos sobre a estrutura

desses alérgenos demonstram vários níveis de identidade entre suas

seqüências primárias, variando de 60% para as Fosfolipases e Antígenos 5 a

80% para as hialuronidases (HOFFMAN, 1993; KING et al., 2000).

A função biológica do alérgeno Antígeno 5 ainda é desconhecida,

embora muitos estudos demonstrem a sua alergenicidade (HOFFMAN, 1993).

Antígenos 5 de várias espécies de Vespula apresentam 95% de identidade em

suas seqüências primárias, enquanto que 58-67% de identidade entre as

espécies do gênero Dolichovespula e Polistes, respectivamente (KING et al.,

1996; PANTERA et al., 2003). Isto promove uma completa reatividade cruzada

com as espécies do gênero Vespula, enquanto que entre alguns gêneros da

família Vespidae, ocorre uma baixa reatividade cruzada. A estrutura

tridimensional do Alérgeno 5 do veneno de Vespula vulgaris foi determinada

(33)

caracterizaram a proteína Antígeno 5 do veneno da vespa Neotropical Polybia

scutellaris. Ela é uma estrutura monomérica, apresentando 207 resíduos de

aminoácidos e massa molecular em torno de 23 KDa com 8 resíduos de

cisteína, formando 4 pontes de disulfeto e ponto isoelétrico acima de 9

(CASCONE et al., 1995). Sua estrutura secundária contém 22% de hélices-a,

22% de folhas-ß e 56% entre estruturas dobras e estruturas aleatórios (turn e

coil) (PIRGIGNANI et al., 2002).

A Hialuronidase age no interstício celular, potencializando a difusão do

veneno, ao hidrolisar parcialmente a matriz extracelular, facilitando a ação dos

demais componentes do veneno. A hialuronidase tem sido isolada dos venenos

de Hymenoptera sociais por diversos passos de cromatografia, incluindo

filtração em gel e troca catiônica (KING et al., 1976; HOFFMAN, 2006). Estudos

de Markovic-Housley et al. (2000) elucidaram a estrutura tridimensional da

hialuronidase de Apis mellifera por cristalografia de raio-X, a qual apresenta

cerca de 350 resíduos de aminoácidos, com duas pontes de disulfeto e quatro

sítios de glicosilações. As hialuronidases encontradas nos venenos de vespas

são similares àquelas encontradas nos venenos das abelhas (LU et al., 1995),

as quais apresentam quantidades significativas de carboidratos em suas

cadeias (KUBELKA et al., 1995).

A presença de um quarto alérgeno, a serino-protease, foi identificada

nos venenos de Polistes dominulus e Polistes exclamans por McNairy et al.

(2000). A serino-protease “Bom p4” foi identificada no veneno da abelha

Bombus pennsylvanicus por Hoffman et al (1996). Recentemente, três

serino-proteases foram isoladas do veneno de B.pennsylvanicus e do veneno das

vespas européias P.dominulus e P.exclamans, as quais demonstraram um

elevado grau de resíduos conservados em suas seqüências primárias. Além

disso, todas apresentaram atividades significativas de respostas a IgE

específica (WINNINGHAM et al., 2004).

Pouco se sabe sobre proteases de veneno de vespas. Uma protease de

36,6 KDa do veneno da vespa Polistes gallicus isolada por cromatografia de

afinidade, apresentou a seqüência N-terminal IVNGVXTEINEFPXMV, onde X

(34)

seqüência completa de duas proteases do veneno das abelhas Apis mellifera

(SCHMIDT et al., 2002) e Bombus pennsylvanicus, além de 20 resíduos do

N-terminal da protease de Bombus terrestris (HOFFMAN et al., 2001) estão

disponíveis nos bancos de proteínas (PANTERA et al., 2003).

Nos últimos anos, a engenharia proteômica tem desenvolvido

microtécnicas que possibilitam a caracterização molecular de componentes

bioativos, presentes em diferentes tipos de células, tecidos, extratos e/ou

fluídos corporais (HEINE, 1997; RESING et al., 1999; PANDEY et al., 2000). A

proteômica é uma ferramenta que começou a ser utilizada na identificação e

seqüenciamento molecular de alérgenos em geral (BEYER et al., 2002; TICHÁ

et al., 2002; TODA et al., 2002).

Embora a quantidade de informações de seqüências de DNAs nas

bases de dados seja ampla, não é suficiente para ajudar a elucidar todas as

funções biológicas das proteínas de um organismo. A proteômica é uma

técnica complementar a genômica, pois ela se concentra nos produtos gênicos,

os quais são agentes ativos nas células. Por essa razão, a proteômica contribui

diretamente para a identificação de alvos protéicos, contra os quais podem ser

desenvolvidas de drogas de uso terapêutico (PANDEY et al., 2000).

A proteômica é uma ferramenta que começou a ser utilizada na

identificação e seqüenciamento molecular de alérgenos em geral. A abordagem

proteômica utilizada neste trabalho é composta por três tecnologias principais:

a) a separação das proteínas; b) o microsequenciamento das proteínas por

Espectrometria de Massas e Química Degradativa de Edman; e c) a

identificação das proteínas por estratégicas de Bioinformática Proteômica.

Além disso, técnicas de eletrotransferência e imunodetecção auxiliarão a

caracterizar os alérgenos imunodominantes nessa abordagem adotada. Dessa

forma, será possível caracterizar molecularmente as proteínas presentes no

veneno da vespa social Polybia paulista, que se trata de uma das vespas que

(35)

4. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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