Avaliação dos efeitos letais

Os ensaios de ecotoxicidade aguda com D. similis a 20 e 25°C, foram realizados de acordo com as normas USEPA (2002), NBR 12713 (ABNT 2009) e os ensaios de ecotoxicidade aguda com C.dubia e C. silvestrii a 25°C, foram realizados de acordo com as normas USEPA (2002) e NBR 13373 (ABNT, 2010).

5.2.1.1. Daphnia similis - Influência da temperatura na ecotoxicidade

Um ensaio preliminar com D. similis a 25°C foi realizado para paracetamol e para dipirona sódica, de modo a determinar a faixa de concentração dos produtos a ser utilizada nos ensaios agudos definitivos (TAB.4). A mesma faixa de concentração estabelecida para D. similis a 25°C foi adotada para D. similis a 20°C.

Tabela 4 – Condições do ensaio preliminar e definitivo para D. similis a 25°C.

PARÂMETROS

Tipo de teste Estático

Diluições Controle e 5 concentrações

Organismo-teste Neonatas com idade entre 6-24 horas

Fotoperíodo 12 horas/luz

Câmara-teste Tubos de ensaio/10mL

Nº de organismos/câmara 5 Nº de réplicas/tratamento 4

Alimentação Sem

Água de diluição Água de fonte natural (Salto-SP); dureza: 40-48mg.L-1 de CaCO3 Duração do teste 48 Horas

Efeito observado Imobilidade CE50

Os seguintes requisitos foram considerados para validação do ensaio: mortalidade inferior a 10% dos organismos expostos no controle e teor de oxigênio superior a 2mg.L-1. Ao final do ensaio preliminar com D. similis a 25°C foi estabelecida à concentração que causou imobilidade a 100% dos organismos e a concentração mais elevada na qual não se observou nenhuma imobilidade. A partir destes resultados, foram estabelecidas as concentrações dos ensaios definitivos para a espécie a 20 e 25°C..

As concentrações de paracetamol para D. similis a 20 e 25°C foram de 20,0; 33,6; 56,4; 94,8 e 159,3mg.L-1..

Para dipirona sódica as concentrações adotadas foram de 33,6; 56,4; 94,8; 159,3; 267,7mg.L-1 para D. similis a 20 e 25°C.

Os ensaios definitivos foram realizados de acordo com o protocolo adotado nos ensaios preliminares (TAB.4). Foram realizados 3 ensaios definitivos com D. similis a 20°C e 3 ensaios definitivos para a mesma espécie a 25°C para cada fármaco. Os resultados obtidos nos ensaios com D. similis a 20 e 25°C foram comparados de modo a determinar a influência da temperatura na ecotoxicidade dos organismos.

5.2.1.2. Ceriodaphnia dubia

5.2.1.2.1. Influência da água de diluição - água natural reconstituída e água destilada reconstituída

Um ensaio preliminar com C. dubia para ambos os fármacos foi realizado de modo a determinar a faixa de concentração dos produtos a ser utilizada nos ensaios

agudos definitivos. A metodologia adotada para o ensaio preliminar foi a mesma descrita para D. similis, (TAB.4).

Ao final do ensaio preliminar foi estabelecida à concentração que causou imobilidade a 100% dos organismos e a concentração mais elevada na qual não se observou nenhuma imobilidade. A partir destes resultados, foram estabelecidas as concentrações dos ensaios definitivos para C.dubia.

As concentrações adotadas para os ensaios definitivos com paracetamol foram de 10,0; 14,1; 19,9; 28,0; 55,7mg.L-1.

Para dipirona sódica, as concentrações adotadas foram de: 20,0; 33,6; 56,4; 94,8; 159,3mg.L-1.

Definidas as concentrações, ensaios com água de natural reconstituída e com água destilada reconstituída para C. dubia foram realizados a fim de se determinar a influência do tipo de água na ecotoxicidade dos fármacos.

A solução - estoque e a água de diluição utilizadas nas soluções - teste dos ensaios com água natural reconstituída foram preparadas com água coletada no Ribeirão Pires, Salto-SP. A cada coleta de água, foram realizados ensaios de viabilidade a fim de observar a qualidade da água utilizada nos ensaios (ABNT, 2009).

A solução - estoque e a água de diluição utiizada nas soluções - teste dos ensaios com água destilada reconstituída foram preparadas com água obtida pelo Sistema MILLI- Q®, filtrada por osmose reversa.

Os dois tipos de água tiveram a dureza ajustada para 40-48mg.L-1 CaCo3, e aeradas por no mínimo 24 horas para a diluição completa dos sais, de acordo com ABNT (2009). Antes do preparo das soluções, o pH da água de diluição foi ajustado para 7,0(±0,2). Tanto as soluções-estoque quanto as soluções-testes foram preparadas no momento da realização do ensaio.

Foram realizados 3 ensaios de ecotoxicidade agudos com paracetamol e 3 ensaios com dipirona sódica com água destilada reconstituída e água natural reconstituída como água de diluição de modo a comparar os resultados.

5.2.1.2.2. Influência do fotoperíodo

Com o objetivo de conhecer a influência do fotoperíodo na ecotoxicidade de dipirona e paracetamol, foram realizados ensaios de ecotoxicidade aguda (n=3) com C. dubia com água destilada reconstituida sem fotoperíodo.

As concentrações adotadas para os ensaios com paracetamol foram de 10,0; 14,1; 19,9; 28,0; 55,7mg.L-1.

Para dipirona sódica, as concentrações adotadas foram de: 20,0; 33,6; 56,4; 94,8; 159,3mg.L-1.

Os ensaios sem fotoperíodo foram cobertos com papel pardo e inseridos na câmera de incubação. As demais condições de ensaio foram as mesmas descritas na TAB.4.

Os resultados obtidos nos ensaios com C. dubia com água destilada reconstituída com fotoperíodo (item 5.2.1.2.1.) e sem fotoperíodo foram comparados.

5.2.1.3. Ceriodaphnia silvestrii - Influência do fotoperíodo

Foram realizados ensaios com água natural reconstituída com e sem fotoperíodo para C. silvestrii a fim de se comparar a influência do fotoperíodo na ecotoxicidade do paracetamol e da dipirona sódica.

As mesmas concentrações adotadas para C. dubia foram utilizadas nos ensaios com C. silvestrii, considerando que as espécies apresentam sensibilidade e ciclo de vida semelhante, segundo estudos de JACONETTI (2005).

A metodologia adotada foi a mesma descrita na TAB 4.

Foram realizados 3 ensaios de ecotoxicidade aguda com paracetamol e 3 ensaios de ecotoxicidade aguda com dipirona sódica nestas condições e os resultados foram comparados.

5.2.1.4. Análise estatística

A CE(I)50;48H foi calculada para cada ensaio através do método Spearman - Karber (HAMILTON et al., 1977) e a média das CE(I)50;48H foi determinada.

A diferença entre os tratamentos, ou seja, tipo de água de diluição e fotoperíodo foi calculada mediante análise Teste t' - student (WEST & GULLIEY, 1996).

De acordo com BERTOLETTI et al., (1989) é importante que se conheça a precisão analítica dos ensaios, de modo a avaliar a variabilidade entre os resultados obtidos, evidenciando desta forma a confiabilidade dos métodos. A avaliação da precisão entre os testes realizados foi estabelecida de acordo com USEPA (1991), que adota que o coeficiente de variação entre os resultados deve compreender a faixa de 8 a 41 %, para serem considerados ótimos.

5.2.1.5. Danio rerio

Os ensaios de ecotoxicidade aguda com D. rerio foram realizados de acordo com a NBR 1508 (ABNT, 2011).

Um ensaio preliminar foi realizado para cada fármaco, de modo a determinar a faixa de concentração do produto a ser utilizada nos ensaios agudos definitivos. As concentrações utilizadas foram: 0,1; 0,2; 0,4; 0,8; 1,6; 3,2g.L-1 para paracetamol e 0,4; 0,8; 1,6; 3,2; 6,4 e 12,8g.L-1 para dipirona sódica.

Como água de diluição, utilizou-se água destilada com dureza ajustada para 40 - 48mg.L-1 de CaCO3. A TAB.5 apresenta os demais parâmetros adotados nos ensaios preliminares agudos.

Tabela 5 – Condições do ensaio de ecotoxicidade aguda para D. rerio.

Parâmetros D. rerio

Tipo de teste Estático

Diluições Controle e 5 concentrações Substâncias-teste Dipirona sódica e paracetamol Organismo-teste Organismos adultos com

comprimento total de 2,0 cm (±1).

Temperatura 25ºC (±2)

Fotoperíodo 12 horas-luz

Câmara-teste Aquários para 5 litros Volume da solução-

teste

1g de peixe para 1 litro de solução

Nº de

organismos/câmara 10

Nº de

réplicas/tratamento 1

Troca de soluções Diária, parcial, 25%

Alimentação Sem

Água de diluição Água destilada reconstituida Duração do teste 96 Horas

Efeito observado Letalidade

Os organismos foram observados diariamente e os mortos, quando presentes, eram retirados dos aquários.

5.2.1.5.1. Análise estatística

A CL(I)50;96H foi calculada para cada ensaio através do método Trimmed Spearman - Karber (HAMILTON et al., 1977) e a média das CL(I)50;96H foi determinada. No que se refere ao coeficiente de variação, adotou-se o mesmo critério descrito no item 5.2.1.4.

5.2.1.6. Síntese dos ensaios agudos

Uma síntese dos ensaios realizados com dipirona sódica e paracetamol é apresentada na TAB.6

Tabela 6 - Síntese dos ensaios agudos realizados com dipirona sódica e paracetamol .

Tipo de água Fotoperíodo Organismos - teste Temperatura (ºC) Água natural recontituída com D. similis 20 D. similis 25 C. dubia 25 C. silvestrii 25 sem C. silvestrii 25 Água destilada reconstituída com C. dubia 25 D. rerio 25 sem C. dubia 25

*As cores iguais indicam os resultados que foram comparados.