Efeito crônico nas populações

5.2.2.3.1. Estabelecimento das condições dos ensaios populacionais para Daphnia

similis a 20 e 25°C, Ceriodaphnia dubia e Ceriodaphnia silvestrii.

As condições para ensaios populacionais estabelecidas foram volume e período de ensaio. Para C. silvestrii a metodologia de ensaio foi estabelecida por ROSA (2008). Portanto, neste trabalho, as condições foram definidas apenas para D. similis a 20 e 25°C e para C. dubia.

5.2.2.3.1.1. Daphnia similis a 20°C e 25°C

5.2.2.3.1.1.a. Volume da câmara - teste

Foram realizados 3 tratamentos com 3 réplicas cada (n=3), com D. similis a 25°C a fim de determinar o volume adequado na realização dos ensaios. O número inicial de organismos foi baseado na metodologia de ensaios populacionais para C. silvestrii estabelecida por ROSA (2008), sendo N0 = 5. No primeiro tratamento estabeleceu-se 1 organismo para cada 25 ml de água, considerando os cinco organismos iniciais, foram adotados 125 ml de água nos cultivos. O segundo tratamento foi baseado na ABNT (2009), USEPA (1996) e OECD (1984), que sugerem 1 organismo por 40 mL de água de cultivo (200ml para 5 organismos) e o terceiro baseado na OECD (1998), que sugere 50 mL de água por organismo (250ml para 5 organismos).

Neonatas de D. similis a 25°C, entre 0 - 24 horas de idade, foram cultivadas por um período de 10 dias a 25°C. A água utilizada nos tratamentos foi proveniente de fonte natural (Salto - SP). A troca da água de cultivo, alimentação e contagem dos organismos foram realizadas diariamente.

Os resultados (número de organismos ao final do experimento de cada tratamento) foram analisados quanto a normalidade e homogeneidade e comparados com auxílio da análise estatística de variância (ANOVA) pelo Teste Tukey. Os resultados foram adotados para a mesma espécie, cultivada a 20°C.

5.2.3.3.1.1.b. Duração do ensaio

Após definição do volume, cinco neonatas entre 0-24 horas de D. similis a 20°C e 25°C foram cultivadas e contadas diariamente durante 20 dias. Para o estabelecimento da duração do ensaio observou-se o período no qual a população esteve em crescimento constante em cada experimento, sendo a média estabelecida. Foram realizados 3 experimentos com três réplicas cada.

A taxa intrínseca de crescimento populacional foi determinada por meio de uma equação de crescimento populacional para meio ilimitado, uma vez que as condições estipuladas para os ensaios permitiram sua utilização. A equação é expressa a seguir:

Nt = N0℮ r t , onde:

Nt = número de indivíduos no tempo t; N0 = número de indivíduos no tempo 0; ℮ = base do logaritmo neperiano; r = taxa intrínseca de aumento natural; t = tempo.

5.2.3.3.1.2. Ceriodaphnia dubia

5.2.3.3.1.2.a. Volume da câmara - teste

O volume da solução - teste (75ml) e número inicial de organismos (N0 = 5), adotado para o ensaio populacional com C. dubia foi o mesmo definido por ROSA (2008) para C. silvestrii. Estabeleceu-se somente neste trabalho, o período do ensaio populacional para C. dubia.

5.2.3.3.1.2.b. Duração do ensaio

Cinco organismos foram cultivados durante 20 dias em 75ml de água de cultivo. A troca de água e alimentação foram realizadas diariamente. Os organismos foram alimentados Pseudokirchneriella subcapitata e com alimento composto. As demais condições de ensaio foram as mesmas descritas para D.similis.

5.2.2.3.2. Critérios para aceitabilidade do controle

5.2.2.3.2.1. Daphnia similis a 20 e 25°C

Para a determinação do critério de aceitabilidade do controle (número médio de organismos) dos ensaios populacionais, três ensaios com cloreto de sódio, substância de referência, foram realizados. Os ensaios atenderam aos requisitos (volume e duração) estabelecidos anteriormente, porém a contagem dos organismos foi realizada nos dias de troca de solução (dias alternados). A partir dos dados obtidos nos controles destes ensaios, calcularam-se o número médio de organismos aceitáveis para os ensaios populacionais.

5.2.2.3.2.2. Ceriodaphnia dubia

Após o estabelecimento da duração do ensaio populacional, três ensaios com cloreto de sódio foram realizados. O requisitos, volume (75ml) e número inicial de organismos (N0 = 5) foram baseados na metodologia descrita por ROSA (2008). A partir dos dados obtidos nos controles destes ensaios, calcularam-se o número médio de organismos e os dois desvios-padrão aceitáveis para ensaios populacionais.

A troca das soluções foi realizada a cada dois dias e a alimentação foi oferecida diariamente.

5.2.2.3.3. Avaliação da sensibilidade ao cloreto de sódio

5.2.2.3.3.1. Daphnia similis

A sensibilidade à substância de referência é recomendada para se determinar o grau de saúde dos organismos a serem testados. A sensibilidade da população de D. similis a 20 e 25°C foi determinada através dos ensaios populacionais nas seguintes concentrações: 1,00; 1,40; 1,96; 2,60 e 3,70g.L-1, baseadas nos ensaios realizados por JACONETTI (2005).

A CEO (p), ou seja, a concentração de efeito observado populacional, foi calculada. Os dados foram analisados de acordo com USEPA (2002), como descritos anteriormente nos ensaios crônicos individuais.

A taxa intrínseca de aumento natural foi calculada conforme descrito no item 5.2.3.3.1.1.2.

5.2.2.3.3.2. Ceriodaphnia dubia

As concentrações utilizadas nos ensaios populacionais com Cloreto de sódio foram; 0,04; 0,10; 0,27; 0,72 e 1,90g.L-1, baseadas nas concentrações estabelecidas por ROSA (2008) para C. silvestrii.

A CEO (p), ou seja, a menor concentração de efeito observado populacional foi calculada. Os dados foram analisados de acordo com USEPA (2002), como descritos anteriormente nos ensaios crônicos individuais.

A taxa intrínseca de aumento natural foi calculada conforme descrito no item 5.2.3.3.1.1.2.

5.2.2.3.3.2. Ceriodaphnia silvestrii

As concentrações utilizadas nos ensaios populacionais com Cloreto de sódio foram as estabelecidas por ROSA, (2008), sendo ela: 04; 0,10; 0,27; 0,72 e 1,90g.L-1.

Calculou-se a CEO (p), de acordo com a USEPA (2002), como descritos anteriormente nos ensaios crônicos individuais.

A taxa intrínseca de aumento natural foi calculada conforme descrito no item 5.2.3.3.1.1.2.

5.2.2.3.4. Ecotoxicidade nas populações

5.2.2.3.4.1. Daphnia similis a 20 e 25°C - Influência da temperatura

Uma vez definidos os parâmetros e aceitabilidade dos ensaios populacionais para D.similis (20 e 25°C), foram realizados três ensaios para cada organismo com paracetamol e com dipirona sódica.

Para D. similis a 20 e 25°C, as concentrações adotadas para paracetamol foram: 0,78; 1,56; 3,12; 6,25; 12,50; 25,00 e 50,00mg.L-1 e 1,56; 3,12; 6,25; 12,50; 25,00 e 50,00mg.L-1 para dipirona sódica.

5.2.2.3.4.2. Ceriodaphnia dubia

Os ensaios populacionais foram realizados de acordo com a metodologia estabelecida neste trabalho. Foram realizados 3 ensaios populacionais com paracetamol e 3 ensaios com dipirona sódica.

Para C. dubia concentrações adotadas na exposição ao paracetamol foram: 0,75; 1,50; 3,00; 6,00; 12,00; 24,00 e 48,00mg.L-1 e 0,23; 0,47; 0,94; 1,87; 3,75 e 7,50mg.L-1 para dipirona sódica.

5.2.2.3.4.3. Ceriodaphnia silvestrii

As condições do ensaio populacional com C. silvestrii basearam-se na metodologia descrita por ROSA (2008).

Cinco organismos foram cultivados em 75 ml de solução. A água de diluição utilizada foi proveniente de fonte natural (Salto-SP) e a dureza foi ajustada (48mg.L-1 CaCo3) 24 horas antes do início do ensaios. O pH da água de diluição foi ajustado inicialmente para 7,0 (±2). As soluções-teste de ambos os fármacos foram preparadas no momento da realização do teste.

A troca de solução foi realizada em dias alternados porém a alimentação foi oferecida diariamente. Os organismos foram alimentados com Pseudokirchneriella subcapitata (1x105 céls/mL) e alimento composto.

As concentrações adotadas foram as mesmas utilizadas nos ensaios com C. dubia, sendo elas: 0,75; 1,50; 3,00; 6,00; 12,00; 24,00 e 48,00mg.L-1 para o paracetamol e 0,23; 0,47; 0,94; 1,87; 3,75 e 7,50mg.L-1 para dipirona sódica.

5.2.2.3.4.4. Análise estatística

A CEO (p), ou seja, a concentração de efeito observado populacional foi calculada de acordo com USEPA (2002), como descrito anteriormente para os ensaios crônicos individuais.

As CI25 e CI50 (concentrações do tóxico que causaram a inibição de crescimento a 25% e de 50% da população, respectivamente), foram calculados pelo programa estatístico "A Linear Interpolation Method for Subletal Toxicity: The Inhibition Concentration (ICp) Approach" (NORBERG-KING, 1993).