Avaliação da expressão gênica do fator tissular (F3) induzido pelo heme: artigo 2

A PCR quantitativa (qPCR) é fundamental nesse etapa para avaliar o real papel do heme na indução da expressão gênica do FT. Células mononucleares foram obtidas de buffy coat de voluntários depois da separação com Ficoll Histoque (Ficoll-paque Plus, GE Healthcare). Em seguida a lise das hemácias foi feita e as células recuperadas depois da lavagem com PBS 1X. O número de células foi padronizado para 5*106 células, uma quantidade suficiente para uma quantidade adequada de RNA. As células foram tratadas com heme (5 µM, 10 µM, 20 µM, 30uM) e o veículo (NaOH 0,1M). Para minimizar o efeito do veículo sobre as células em cultura usamos em cada experimento uma solução de trabalho concentrada de heme (5mM). Desta forma reduzimos drasticamente o volume aplicado por condição (de 43ul reduzimos para 6ul em cada 1000ul de meio de cultura para o heme 30µM). Esta estratégia decorreu de observações anteriores (início do projeto) de uma tendência de aumento da ativação da coagulação em sangue tratado com o veículo em relação ao basal (sem tratamento) no Rotem (110).

As células foram recuperadas depois de 4h e o RNA foi extraído usando um kit comercial (RNeasy mini kit, Qiagen). Depois da extração do RNA fizemos a transcrição com o kit “High-capacity cDNA Reverse Transcription Kit” que otimiza a qualidade do cDNA obtido (Figura 8). As reações foram realizadas em placas de 96 poços em duplicata, com um volume total de 12μL, sendo: 6μl SYBR Green, 3μl para

cada conjunto de primer 3μl de amostra de cDNA na concentração de 5ng/μL. Para verificar a contaminação dos reagentes o cDNA, foram utilizados controle-negativos sem adição de amostra de cDNA (NTC – no template controls) por cada conjunto de primers. A amplificação foi realizada no equipamento Step One Plus (Applied Biosytems, Life Technologies, Foster City, EUA) e os dados obtidos foram gerados em gráficos de fluorescência versus número de ciclos.

O equipamento gera no final da reação gráficos que permitem analisar a qualidade da reação (ausência de contaminantes ou produtos inespecíficos) devido à diferença de Tm (Temperatura de melting ou curva de dissociação) entre os produtos de PCR. A expressão relativa do FT foi determinada depois da normalização usando dois transcritos dos genes EEF2 e MYH9 como transcritos de referência. Estes transcritos foram escolhidos da base de dados HRT Atlas (111), por apresentarem uma expressão estável em mais de 12.000 amostras de tecidos e células humanas, e uma baixa variabilidade em células mononucleares. Esta base de dados foi desenvolvida durante nosso projeto por seu autor (BWH) para disponibilizar à comunidade científica uma lista de transcritos housekeeping que podem ser usados como endógenos para normalização da expressão gênica (www.housekeeping.unicamp.br). As concentrações e as sequências dos primers são apresentadas na tabela 1.8. O algoritmo de normalização (112) foi utilizado para calcular o Fator de Normalização (FN) da amostra, que é a média geométrica entre os genes de referência. A expressão dos genes de interesse foi estimada pela razão entre o valor da quantificação relativa (Q) pelo FN da cada amostra. O valor do Q expresso em unidades arbitrárias (UA) é determinada pela formula:

Figura 8: Avaliação da expressão gênica por qPCR.

Esquema da técnica e do desenho experimental nos experimentos que utilizaram para avaliação da expressão gênica de FT.

Tabela 1: Sequência e concentração dos primers usados na avaliação do FT.

Genes Sequência Concentração

padronizada (ng/µl) EEF2 F 5’ TGAACAAGATGGACCGCG 3’ R 5’ GGATCGATCATGATGTTGCC 3’ 150 MYH2 F 5’ AAGAACAAGCTCAGGCGC 3’ R 5’ GCTGTGGTGTCTGTCTGTCC 3’ 150 F3 F 5’ TCAGGAAAGAAAACAGCCAAAAC 3’ R 5’ GGGAGGGAATCACTGCTTGA 3’ 150

3.4.4 Teste funcional avaliando a atividade do fator X

Esse teste é um ensaio coagulométrico em que a cinética da conversão de um substrato de fator X ativado é medida. Trata-se portanto de um teste que mede a ativação da coagulação através de uma leitura funcional, que é a geração de fator X ativado, proteína localizada na convergência das vias intrínseca e extrínseca da coagulação. Os ensaios foram realizados em células mononucleares isoladas de

buffy coat de doadores do banco de sangue obtidas por gradiente de ficoll como

i. Na primeira etapa, células foram tratadas e incubadas com os estímulos por 4 horas após a separação da população de interesse, como descrito a seguir:  Um volume de amostra que conteria o equivalente a 2*106

monócitos foi usado. Este volume depende do número de células mononucleares e proporção da população monocítica contada por amostra;

 Em seguida as células foram estimuladas com heme ou veículo;

 Por fim, o volume foi ajustado para 1ml com meio de cultura e as placas foram incubadas a 37°C na incubadora com 5% de CO2, pelo tempo previsto para cada experimento.

ii. Depois da incubação, o sobrenadante foi descartado para eliminar os linfócitos e neutrófilos em suspensão, e a placa foi lavada com 1ml de PBS pré-aquecido. Dessa forma recuperamos somente os monócitos aderentes com 1ml de HBSA, usando um raspador de células. O raspador usado auxilia mecanicamente na remoção dos monócitos aderentes evitando perda de células e dano. As amostras são armazenadas no -80°C até o dia do experimento. Destacamos aqui que esta estratégia é considerada por nós crítica para a obtenção de resultados mais reprodutíveis, pois a eliminação da etapa de tripsinização utilizada nas primeiras tentativas de padronização desta técnica pode ter levado à ativação do FT durante o processamento, por ser esta proteína de membrana facilmente ativável. Acreditamos que este mecanismo pode ter mascarado os resultados obtidos nos primeiros experimentos, quando observávamos ativação do FT tanto nas células tratadas com heme quanto nas tratadas com veículo).

iii. O teste funcional foi realizado segundo um protocolo desenvolvido na Universidade da Carolina do Norte em Chapel Hill (EUA) (113):

 As amostras foram descongeladas por 3 min a 37°C no banho maria;  O teste foi realizado numa placa de 96 poços com fundo claro e as

concentrações calculadas usando uma curva-padrão:

- 30ul de cada uma das 10 concentrações do calibrador padrão em duplicata (Innovin, reagente comercial de FT ressupendido com fosfolipídios). O ponto inicial tem uma concentração de 5pM e o último é o branco;

- 30ul de cada amostra com e sem anticorpo anti-fator tecidual (HTF-1; Ref 16-1429-85 eBioscience) e IgG controle (SC-2025, Santa Cruz). A placa é incubada por 15 min na temperatura ambiente para permitir o efeito dos anticorpos;

- Depois dessa incubação foi adicionado 20ul de um mix contendo todos os demais fatores da coagulação necessários para a ocorrência da cascata até o ponto em que o FX é convertido em FX ativado, a saber: 150nM de fator X (HFX 4662, Enzyme Research), 1nM de fator VII ativado (HFVIIa 4460, Enzyme Research) e 3mM de cloreto de cálcio;

- A placa foi incubada em seguida a 37°C por 2 horas e a reação parada com 25ul de EDTA (25mM) por 10min; - Por fim, adicionamos 25ul de um substrato cromogênico

de FX ativado (Perfachrome sFXa 0,3mM) e a leitura foi feita no espectrofotômetro de placa (cinética: A405nm na temperatura ambiente, por 30 min com 30s de intervalos de leitura).

iv. A análise foi feita em planilha excel baseando na curva padrão (Figura 9). Quando necessário, as células foram pré-tratadas por 1h com 2ng/ml de TNF-α.

Figura 9: Avaliação da atividade do FT com o teste funcional.

Esquema da técnica e do desenho experimental nos experimentos que utilizaram para avaliação da ativação do FT.