4.3 Avaliação Farmacológica in vitro
4.3.2 Avaliação Farmacológica em Cultura de Células
4.3.2.1 Linhagens Celulares
Dez linhagens de células tumorais humanas (Tabela 2), gentilmente cedidas pelo Instituto Nacional do Cancer/EUA, foram mantidas em cultura em meio completo [meio RPMI 1640 (GIBCO BRL) com vermelho fenol suplementado com 5% de soro fetal bovino (GIBCO BRL) e 1% de penicilina:estreptomicina (1000U/ml:1000µg/ml)], em garrafas T25 ou T75, em incubadora com atmosfera umidificada, com 5% de CO2, a 37 C. As mesmas
condições foram utilizadas para manutenção da linhagem não tumoral de queratinócitos humanos (HaCaT, doada pelo prof. Dr Ricardo Della Coletta, Faculdade de Odontologia de Piracicaba, Unicamp).
Tabela 2 - Linhagens celulares utilizadas nos estudos in vitro
Linhagem Órgão/Doença D.I.
#
(x 104 cel/ml)
U251 SNC; glioma 4,0
MCF-7 Mama; adecarcinoma 6,0
NCI-ADR/RES * Ovário; adenocarinoma 5,0
786-0 Rim; adenocarcinoma 5,0
NCI-H460 Pulmão; carcinoma tipo não pequenas células 4,0
PC-3 Próstata; adenocarcinoma 4,5
OVCAR-3 Ovário; adenocarcinoma 7,0
HT29 Cólon; adenocarcinoma 5,0
K562 Medula óssea; Leucemia mielóide crônica 6,0
HaCaT Pele (queratinócito); Não tumoral 4,0
* esta linhagem apresenta resistência a múltiplos fármacos; # D.I.= densidade de inoculação para o teste de atividade antiproliferativa.
4.3.2.2 Preparação das Amostras
Todas as amostras avaliadas (extrato e frações) foram previamente diluídas em dimetilsulfóxido (DMSO) na concentração de 10 mg/ml e em seguida submetidas a diluição seriada com meio completo para obtenção das concentrações empregadas em cada teste.
O DMSO é um co-solvente usualmente empregado devido sua grande capacidade em solubilizar vários compostos, permitindo a posterior diluição em meio aquoso, a sua baixa toxicidade (Bosanquet, 1985; Mallick et al., 2007). Além disso, no esquema de diluição empregado, a concentração final de DMSO sempre foi igual ou inferior a 0,25% o que não interfere com a viabilidade celular (Longato, 2014).
4.3.2.3 Avaliação de Atividade Antiproliferativa
A atividade antiproliferativa foi avaliada frente ao painel de células apresentado na Tabela 2, com base no protocolo descrito por Monks e colaboradores (1991). Para a avaliação inicial do extrato etanólico total e suas frações foram testadas, em triplicata, nas concentrações de 0,25 a 250 µg/ml, com tempo de exposição de 48 horas. Em um segundo experimento, a fração F2 foi testada, em triplicata, nas concentrações de 0,0025 a 2,5 µg/ml com tempo de exposição de 24 e 48 h.
Como método para avaliação colorimétrica foi escolhido a coloração com sulforrodamina B, que é um corante usado por se ligar nas aminas presentes nas proteínas celulares
das células viáveis (Monks et al., 1991). Todas as demais condições (densidade de inoculação, faixa de concentração de amostras e desenho da placa experimental) foram padronizadas em nosso laboratório ao longo de 20 anos de pesquisa, tendo como base as informações disponíveis sobre o experimento NCI60 desenvolvido pelo National Cancer Institute, dos EUA (Monks et al., 1991; Shoemaker, 2006; DTP, 2015).
A placa T0 montadas nesses protocolos, permite inferir a quantidade de células presentes no momento da adição das amostras. Assim, para os tempos de exposição de 24 e 48h, os resultados foram expressos como proliferação celular, em porcentagem, considerando-se a diferença entre as absorbâncias das células viáveis sem tratamento ao final (T1) e no início (T0) do período de exposição como o 100% de proliferação. Isto porque esses tempos de exposição (24 e 48h) permitiram que as linhagens testadas completassem pelo menos um ciclo celular.
Além disso, o teste de atividade antiproliferativa permite analisar se a amostra apresenta atividade citostática (inibição da proliferação celular), que é expressa no gráfico por valores de crescimento celular entre 0 e 50%, ou se apresenta atividade citocida (indução de morte celular), representada pelos valores entre 0 e -100% no gráfico de crescimento celular.
As células dispostas em placas de 96 compartimentos (100 µL/compartimento de suspensão celular, densidade de inoculação: Tabela 2) foram expostas às diferentes concentrações de cada uma das amostras em teste e incubadas por 24 ou 48h a 37 °C, em atmosfera úmida com 5% de CO2. Com base em resultados anteriores, sabe-se que a
concentração final de DMSO (< 0,25%) não interfere na viabilidade celular (Longato, 2014). Uma placa controle, contendo alíquotas de todas as suspensões celulares utilizadas, foi fixada com ácido tricloroacético (TCA) 50% (p/v, 50 µL/compartimento) no momento da adição das amostras.
Após o período de exposição, as células foram fixadas com ácido tricloroacético (TCA), mantidas em geladeira a 4ºC por 1 hora e lavadas 4 vezes consecutivas em água
corrente, para a remoção de resíduos de TCA, meio, soro fetal bovino e metabólitos secundários. Após serem secas à temperatura ambiente, todas as células foram coradas com 50 μL/compartimento de sulforrodamina B (SRB Sigma®) 0,4% (p/v) dissolvida em ácido acético 1%; e mantidas por 20 minutos à temperatura ambiente.
A seguir, as placas foram lavadas com solução de ácido acético a 1% para remoção do excesso de corante e secas à temperatura ambiente. Finalmente, o corante ligado às proteínas celulares foi solubilizado com 150 μL/compartimento de Trizma Base (10 μM, pH 10,5) (Sigma®) (Fiorito, 2016). A proliferação celular foi determinada por quantificação espectrofotométrica (540 nm) em leitor de microplacas (Molecular Devices®, modelo
VersaMax). As médias das absorbâncias foram calculadas descontando-se o valor de seus respectivos brancos e, através das fórmulas a seguir, foi determinado o crescimento (%) de cada linhagem testada frente às diferentes amostras.
Se TA ≥ T0, a amostra foi citostática e a fórmula utilizada foi 100 x [(TA- T0)/(T1- T0)]. Se TA< T0, a amostra foi citocida e a fórmula utilizada foi 100 x [(TA- T0)/(T0)].
Sendo TA a média da absorbância da célula tratada, T1 o controle de célula e T0 o controle das células no dia da adição das amostras.
Com esses valores, foram construídas curvas de crescimento celular de cada linhagem em função da concentração da amostra, e a partir delas foram calculadas as concentrações efetivas GI50 (concentração necessária para inibir em 50% a proliferação
celular) e TGI (concentração necessária para inibição total de crescimento celular) através de regressão não linear, tipo sigmoidal, empregando-se software ORIGIN 8.0 (OriginLab Corporation).
4.3.2.4 Avaliação da Viabilidade
Para avaliação da viabilidade, as linhagens tumorais humanas descritas na Tabela 2 foram expostas por 6 h à F2, em triplicata, (0,0025 a 2,5 μg/ml). Para esta avaliação, não foi preparada a placa controle T0, pois com esse tempo de exposição foi inferior ao tempo para finalização do ciclo celular das linhagens avaliadas.Ou seja, o valor de absorbância medido para as células sem tratamento ao final (T1) do período de exposição representaram 100% de células viáveis.
Ao final das 6 horas de incubação a 37 °C, em atmosfera úmida com 5% de CO2,
as células foram fixadas com SRB e quantificadas por espectrofotometria conforme descrito no item 4.3.2.3, usando um protocolo baseado da literatura (Monks et al., 1991; Shoemaker, 2006).
As médias das absorbâncias foram calculadas descontando-se o valor de seus respectivos brancos e, através de regra de três simples, foi determinada a viabilidade (%) de cada linhagem testada frente às diferentes amostras. Com esses valores, foram construídos gráficos de barras de viabilidade celular de cada linhagem em função da concentração da amostra, empregando-se software GraphPad Prism 5.0.
4.3.2.5 Teste Clonogênico
O teste clonogênico foi realizado com base nos protocolos descritos por Franken et al. (2006). Com base nos resultados dos testes de viabilidade celular e de atividade
antiproliferativa, foram selecionadas para esta avaliação as linhagens tumorais de mama MCF-7 (d.i. 6x104 ml-1) e de pulmão NCI-H460 (d.i. 4x104 ml-1) que foram cultivadas em
garrafas T25 (1 garrafa/tratamento). Quando a camada celular atingiu cerca de 80% de confluência (geralmente 24 h após plaqueamento), as células foram tratadas por 24 h com a fração F2, nas concentrações finais de 0,05; 0,25; 0,5 e 1 μg/ml, nas próprias garrafas. Também foram preparadas garrafas contendo células não tratadas (controle negativo). Após o período de exposição, as células foram lavadas com tampão PBS, tripsinizadas e recolhidas em meio completo (5 ml/garrafa). A densidade celular de cada suspensão foi determinada através de contagem de células em câmara de Neubauer. Em seguida, cada suspensão celular ajustada para 100 células viáveis em 2 ml de meio de cultura completo, sem nova adição de amostra, e plaqueada em placas de 6 compartimentos (2 ml/compartimento), em triplicata. Em seguida, as placas foram incubadas por um período de 7 a 10 dias para o desenvolvimento das colônias, sem troca de meio de cultura durante o período.
Por fim, o meio de cultura foi cuidadosamente removido e os compartimentos foram lavados com 2 ml/compartimento, uma única vez, com solução de tampão fosfato em salina de Dulbecco (D-PBS) (Apêndice 1). As colônias foram então fixadas com Metanol:D- PBS (1:1, v/v, 2 ml/compartimento) por 2 minutos, as soluções foram desprezadas e em seguida as colônias foram fixadas com Metanol 100% (2 ml/compartimento) por 10 minutos, ao final dos quais a solução foi desprezada. Após secagem completa à temperatura ambiente, as colônias foram coradas com solução de cristal violeta (MerckMillipore, Brasil; 0,1% em água destilada, 2 ml/compartimento) durante 10 minutos, seguida de três etapas de lavagem em água de torneira (2 ml/compartimento), 3 etapas de lavagem com água destilada (2 ml/compartimento) e secagem completa à temperatura ambiente.
Com auxílio de microscópio óptico invertido, foi determinado o número de colônias por tratamento. Foi considerada como 1 colônia os aglomerados celulares com pelo menos 50 células cada. Com esses resultados foram calculadas a eficiência de plaqueamento (Ep, Equação 1) e a porcentagem de colônias que sobreviveram (SF, Equação 2) após o tratamento com a F2 conforme descrito por Franken et al. (2006).
Ep (%) = [(nº colônias no controle/ nº células semeadas por poço)] / nº de replicatas x 100 (Eq. 1)
SF = [(nº colônias no tratamento/ nº células semeadas por poço)] / nº de replicatas x Ep (Eq. 2).
4.3.2.6 Avaliação de Ciclo Celular Através de Citometria de Fluxo
Este teste foi realizado empregando-se citômetro de fluxo Guava EasyCiteTM MiniSystem Millipore®. O protocolo usado foi com base em experimentos anteriores do nosso grupo de pesquisa (Paiva, 2016) e nas orientações do fabricante.
Foram selecionadas para esta avaliação as linhagens tumorais de mama MCF-7 (d.i. 5,5x104 ml-1) e de pulmão NCI-H460 (d.i. 4 x104 ml-1) que foram cultivadas em placas de
cultura de 12 compartimentos. Quando a camada celular atingiu cerca de 80% de confluência (geralmente 24 h após plaqueamento), as células foram submetidas a um processo de sincronização de ciclo por manutenção das células em meio de cultivo sem soro fetal bovino por 24 h. Ao final deste período, as células foram tratadas por 24 h com a fração F2 de M. aquatica, nas concentrações finais de 0,12; 0,25 e 0,5 μg/ml (volume final 2 ml/compartimento), em triplicata. Após o período de exposição, o meio de cultivo de cada compartimento foi coletado em um tubo de centrífuga, as células foram tripsinizadas e cada suspensão celular foi reunida ao meio previamente recolhido. As suspensões celulares resultantes foram centrifugadas (centrifuga Eppendorf ® 5403, Alemanha) por 5 min, a 2500 rpm, a 4ºC. Os sobrenadantes foram descartados e os pellets celulares foram ressuspensos com 1 ml de PBS e centrifugado nas mesmas condições. Após descarte do sobrenadante, os pellets celulares foram ressuspensos com 100 µl de PBS e transferidos para eppendorfs previamente preparados com etanol 70% gelado, que atua como agente fixador e de permeabilização de membrana celular e mantidos por, 24 h a 4º C. Após este período, as suspensões foram centrifugadas (5 min, 2500 rpm) e o cada pellet celular foi lavado com PBS (1 ml) e centrifugado novamente. Cada precipitado celular foi então resuspendido em 200 μL do reagente Guava® Cell cycle (Merck/Millipore 4500-0220) e incubado por 30 min, a
temperatura ambiente e protegidos da luz. As análises por citometria de fluxo empregaram o software Guava®Cell Cycle (5.000 eventos por replicata). Como controle negativo foram utilizadas células sem tratamento.
Através do uso de um marcador fluorescente com iodeto de propídio (PI), que se liga especificamente aos ácidos nucleicos, são realizadas medidas das quantidades de células e de DNA por célula. Os resultados são obtidos na forma de 2 picos que correspondem às fases G1/G0 (teor DNA = 2N) e G2/M (teor DNA = 4N) enquanto a fase S (2N < teor DNA < 4N) apresenta-se como um faixa de fluorescência entre os dois picos (Alberts et al, 2010). Para evitar interferências de amostras fluorescentes, estas são analisadas previamente ao início do experimento propriamente dito. Assim, verificou-se que tanto a fração F2 quanto as células tumorais não tratadas não possuíam auto-fluorescência.
4.3.2.7 Avaliação de Atividade (Anti)Estrogênica - Modelo E-Screen
Avaliou-se a habilidade do extrato e das frações F2 e F3 de M. aquatica em inibir ou mimetizar a ação do estrógeno. Para isso, células MCF7 (adenocarcinoma mamário que expressa ER; d.i.: 1x104 células/ml) foram dispostas em placas de 12 compartimentos com
meio completo. Após 24 h de incubação, o meio foi cuidadosamente aspirado, os compartimentos foram lavados, delicadamente, com PBS pH 7,0 (1 ml/compartimento), aspirados e substituídos por meio RPMI 1640 sem vermelho fenol, acrescido de 5% de SFB tratado com Dextran e carvão ativo (Hyclone Sigma®) e 1% de penicilina/estreptomicina (1
ml/compartimento), baseado no protocolo descrito por Payne et al. (2000). Esses cuidados visam minimizar a presença de interferentes uma vez que o vermelho-fenol, por causa de sua estrutura química, possui efeito estrogênico, enquanto o soro fetal bovino não tratado possui hormônios esteroidais como estrógeno, progesterona e testosterona.
Após 72 h de incubação, as células foram tratadas (1 ml/compartimento, em duplicata) com EET de M. aquatica (125 μg/ml) e frações F2 (0,25 μg/ml) e F3 (1 μg/ml) na presença e ausência de 17-β-Estradiol (Estradiol, 10-9 M). Tamoxifeno, na concentração final
de 10 μg/ml, foi utilizado como controle positivo (ação anti-estrogênica) e células não tratadas foram consideradas como o controle negativo. Após incubação em estufa a 37oC por
144 horas, as células foram avaliadas pelo método da sulforrodamina B conforme descrito no item 4.3.2.3.
Neste protocolo, além da fração F2, também foram avaliadas o extrato etanólico total (EET) e a fração F3.