LUCIANA BITENCOURT DE SOUZA
POTENCIAL ANTITUMORAL DO EXTRATO
ETANÓLICO E FRAÇÕES DE Mentha aquatica L.
Piracicaba 2019
POTENCIAL ANTITUMORAL DO EXTRATO
ETANÓLICO E FRAÇÕES DE Mentha aquatica L.
Dissertação apresentada à Faculdade de Odontologia de Piracicaba da Universidade Estadual de Campinas como parte dos requisitos exigidos para a obtenção do título de Mestra em Odontologia, na Área de Farmacologia, Anestesiologia e Terapêutica.
Orientadora: Profa. Dra. Ana Lúcia Tasca Gois Ruiz
ESTE EXEMPLAR CORRESPONDE À VERSÃO FINAL DA DISSERTAÇÃO DEFENDIDA PELA ALUNA LUCIANA BITENCOURT DE SOUZA E ORIENTADA PELA PROFA. DRA. ANA LÚCIA TASCA GOIS RUIZ.
Piracicaba 2019
O presente trabalho foi realizado com apoio do CNPq- Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico. Processo: 132448/2016-5 e 132207/2017-6; com apoio da Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior – Brasil (CAPES) - Código de Financiamento 001 e do CPQBA (Centro Pluridisciplinar de Pesquisas Químicas, Biológicas e Agrícolas)/Unicamp;
À prof. Dra Ana Lúcia Tasca Gois Ruiz, pela orientação, a paciência, a compreensão e todo o aprendizado que me proporcionou;
À Faculdade de Odontologia de Piracicaba, na pessoa do seu Diretor, Francisco Haiter Neto;
À prof. Dra. Paula Pereira Paiva que prestou preciosas informações para a realização deste trabalho;
À Deus que me proporcionou a devida coragem de sempre seguir em frente;
À minha família que sempre me apoia e me inspira a ser uma pessoa melhor a cada dia;
Ao meu namorado, Elison, que me entende, me motiva, me ouve e sempre me faz feliz;
Aos meus amigos de longa data e aos novos que tive a oportunidade de conhecer no CPQBA. Em especial, a Liliane amiga que me encorajou a fazer o mestrado e as meninas alegres que sempre levarei em meu coração, Sirlene, Ilza, Ana Possenti, Karin,Ellen, Tuany, Fabiana, Gisele e Adriana;
Aos demais professores, funcionários do CPQBA e alunos da pós-graduação em Odontologia da área de Farmacologia, Toxicologia e Terapêutica da Faculdade de Odontologia de Piracicaba-UNICAMP;
De fato formamos uma ótima equipe e todos proporcionaram direta ou indiretamente para que eu chegasse até aqui.
Figura 1 - Fases do ciclo celular 20
Figura 2 - Mentha aquatica L. 24
Figura 3 - Esquema geral do estudo realizado com o extrato etanólico total das
partes aéreas de M. aquatica e suas frações 29 Figura 4 - Fracionamento do extrato etanólico total das partes aéreas de Mentha
aquatica por cromatografia em coluna filtrante 31 Figura 5 - Desenho experimental do teste de tumor sólido de Ehrlich 42 Figura 6- CCD das frações agrupadas do EET de M. aquatica obtidas através do
fracionamento por cromatografia em coluna filtrante 45 Figura 7 - Curva de concentração de DPPH (%) em função da concentração (Log)
das frações F5, F6 e F8, de M. aquatica após 30 min de reação 46 Figura 8 - Atividade anti-proliferativa das frações F2, F3, F4 e F6, obtidas das
partes aéreas de Mentha aquatica 50
Figura 9 - Efeito sobre a viabilidade celular após 6 horas de exposição à fração F2 51 Figura 10 - Atividade antiproliferativa da fração F2 em dois tempos diferentes (24
e 48 h) de exposição 52
Figura 11 – Viabilidade celular (%) das células MCF-7 após 144h de exposição à
fração F3, recém diluída, e ao Tamoxifeno no modelo E- screen 56 Figura 12 - Viabilidade celular (%) das células MCF-7 após 144h de exposição ao
extrato etanólico das partes aéreas de Mentha aquatica, recém diluído,
no modelo E- screen 57
Figura 13 - Viabilidade celular (%) das células MCF-7 após 144h de exposição a
F2, recém diluída, no modelo E- screen 57
Figura 14 - Viabilidade celular (%) das células MCF-7 após 144h de exposição à
fração F2, após armazenagem em DMSO, no modelo E- screen 58 Figura 15 - Variação do peso corporal dos animais durante o teste de toxicidade
oral aguda 61
Figura 16 – Peso relativo (%) dos órgãos dos camundongos no teste de toxicidade
Figura 18 - Variação do peso corporal dos camundongos durante o teste de tumor
sólido de Ehrlich 63
Figura 19 - Peso Relativo (%) das massas tumorais dos camundongos no teste de
Tabela 1 - Relação de gradiente da fase móvel utilizada no fracionamento por
cromatografia líquida de adsorção do EBE de M. aquatica 31 Tabela 2 - Linhagens celulares utilizadas nos estudos in vitro 34 Tabela 3 - Frações agrupadas a partir do fracionamento do EBD de M. aquatica
por cromatografia em coluna filtrante 45
Tabela 4 - Capacidade de sequestrar cátion radicalar DPPH+• das frações F5, F6
e F8, de M. aquatica 46
Tabela 5 - Avaliação de atividade redutora pela reação de Folin-Ciocalteu do
extrato etanólico total das partes aéreas de M. aquatica e suas frações 47 Tabela 6 - Atividade antiproliferativa, expressa como concentração necessária
para inibir totalmente a proliferação celular (TGI, μg/ml), do extrato
etanólico das partes aéreas de Mentha aquatica e suas frações 48 Tabela 7 - Atividade antiproliferativa da fração F2, expressa como concentrações
necessárias (μg/ml) para inibir em 50% (GI50) ou totalmente (TGI) a
proliferação celular, em função do tempo de exposição 53 Tabela 8 - Efeito da fração F2, obtida das partes aéreas de M. aquatica, sobre a
formação de colônias (teste clonogênico) após 24 h de exposição 54 Tabela 9 - Efeito da fração F2 após armazenamento em solução (DMSO) em
freezer -80C, obtida das partes aéreas de M. aquatica, sobre a
formação de colônias (teste clonogênico) após 24 h de exposição 54 Tabela 10 - Efeito da fração F2, obtida das partes aéreas de M. aquatica, sobre as
fases do ciclo celular da linhagem NCI-H460 após 24 h de exposição 55 Tabela 11 - Efeito da fração F2, obtida das partes aéreas de M. aquatica, sobre as
fases do ciclo celular da linhagem MCF-7 após 24 h de exposição 55 Tabela 12 - Substâncias detectadas por CG/EM nas frações F2 recém diluída e
F2 armazenada em DMSO 59
3T3 – Linhagem não tumoral de fibroblasto murino
ACHN - Linhagem celular de adenocarcinoma renal humano BHA - Butilhidroxi-anisol
BHT- Butil-hidroxi-tolueno
C32 – Linhagem celular de melanoma humano CCD - Cromatografia em camada delgada
CEMIB - Centro Multidisciplinar para Investigação Biológica na Área da Ciência em Animais de Laboratório
CG/EM – Cromatografia gasosa acoplada a detector de massas
CG/EM - Cromatografia gasosa acoplada a detector seletivo de massas CO2 - Gás carbônico
CPMA - Coleção de Plantas Medicinais e Aromáticas
CPQBA - Centro Pluridisciplinar de Pesquisas Químicas, Biológicas e Agrícolas DFT - Divisão de Farmacologia e Toxicologia
DMSO - Dimetilsulfóxido
DNA - Ácido dexoxirribonucleico DPPH - 2,2-difenil-1-picrilhidrazil EBD - Extrato diclorometânico EBE - Extrato bruto etanólico
EDTA - Ácido etilenodiamino tetra-acético
EET - Extrato etanólico total FE - Fase estacionária
GABA-A - Ácido gama-aminobutírico,
GI50 - Concentração necessária para inibir em 50% a proliferação celular
GRAS - Generally Recognized As Safe H2O2 - Peróxido de hidrogênio
Hep2 - Linhagem celular de carcinoma de laringe humano LNCaP - Linhagem celular de carcinoma de próstata humano MAO - Enzima monoamino-oxidase
MCF-7 - Linhagem celular de adenocarcinoma mamário humano que expressa receptores de estradiol
MDT - Maior dose tolerada Na2CO3 -Carbonato de sódio
NCI - National Cancer Institute
NCI-H460 - Linhagem celular de carcinoma de pulmão, tipo não pequenas células, humano NFкB - Fator de transcrição nuclear kappa B
OECD - Organisation for Economic Co-operation and Development OVCAR-3 – Linhagem celular de adenocarcinoma de ovário humano
PC-12 - Linhagem celular derivada de feocromocitoma da medula suprarrenal de rato PI - Iodeto de propídio
Solução PBS - Tampão fosfato 0,2 M em solução NaCl 0,9%), SRB - Sulforrodamina B
TCA - Ácido tricloroacético
TGI - Concentração necessária para inibição total de crescimento celular Trolox - Análogo solúvel em água de vitamina E
Tween 80 - Polissorbato 80
Unicamp - Universidade Estadual de Campinas UV - Radiação ultra-violeta
v.o - Via oral
apontam o câncer como um problema de saúde crescente em todo o mundo. Tendo em vista a grande diversidade biológica das neoplasias, há uma constante necessidade de desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas. Desde os primórdios da civilização, as plantas têm se mostrado grandes aliadas da humanidade por fornecerem, além de alimento e abrigo, substâncias com inúmeras atividades farmacológicas. Continuando os estudos farmacológicos e toxicológicos de nosso grupo de pesquisa com espécies do gênero Mentha, este trabalho teve por objetivo avaliar as atividades anticâncer (atividade anti-proliferativa in vitro, efeitos clonogênico e sobre ciclo celular, ação no modelo de tumor sólido de Ehrlich), antioxidante (teste de DPPH e de Folin-Ciocalteu), ação anti/estrogênica (modelo E-screen) e anti-inflamatória (modelo de edema de pata induzido por carragenina) do extrato etanólico total (EET), e suas frações (F0 a F8), obtido a partir das partes aéreas de M. aquatica L. Foi possível evidenciar que o EET não apresentou atividades anti-proliferativa ou antioxidante, porém 4 frações obtidas através de cromatografia em coluna filtrante apresentaram atividade antiproliferativa moderada (F3, F4 e F6) a potente (F2). Destas, a fração F2 inibiu a proliferação das células tumorais de mama (MCF-7) e de pulmão (NCI-H460) mesmo após retirar a exposição desta fração do meio de cultura, sem promover alteração do ciclo celular dessas duas linhagens após 24 h de exposição a F2. A fração F2 também não foi capaz de sequestrar radicais DPPH, apresentou baixo teor de compostos fenólicos totais e não apresentou efeito estrogênico e/ou antiestrogênico. Entretanto, descobriu-se que o armazenamento de F2 em solução (DMSO; 0,1 mg/ml) promoveu alterações químicas que resultaram em perda do efeito antiproliferativo e ganho de ação estrogênica significativa, sem alteração do efeito sobre o ciclo celular. Análise por cromatografia gasosa acoplada a espectrometria de massas revelaram diferenças significativas na composição da fração F2 antes e depois do armazenamento. Entretanto, não foi possível identificar a maior parte dos compostos detectados. Com relação a ação (anti)estrogênica, foi evidenciado que o EET apresentou efeito estrogênico (ação agonista) enquanto a fração F3 inibiu totalmente o efeito proliferativo induzido por 17β-estradiol sem apresentar efeito estrogênico. Finalmente, nas condições empregadas foi possível evidenciar que a fração F2 não foi tóxica quando administrada por via oral, porém não foi possível evidenciar ação antitumoral nem efeito anti-inflamatório nos modelos in vivo utilizados. No modelo de tumor sólido de Ehrlich, foi possível evidenciar que as substâncias presentes na fração F2 foram absorvidas, uma vez que o tratamento evitou o aumento no peso relativo do fígado induzido pelo desenvolvimento das células tumorais de Ehrlich. Estes resultados indicam para o potencial uso das partes aéreas de Mentha aquatica para o futuro desenvolvimento de fitoterápico adjuvante para o tratamento de câncer.
as a health problem worldwide. Given the great biological diversity of neoplasia, there is a constant need to develop new therapeutic strategies. Since the dawn of civilization, plants have proved to be great allies of humanity providing substances with numerous pharmacological activities in addition to food and shelter. Continuing the pharmacological and toxicological studies of our research group with the genus Mentha, this work aimed the evaluation of anticancer (in vitro anti-proliferative activity, clonogenic action and cell cycle influence, the in vivo Ehrlich solid tumor model), anti-oxidant (DPPH and Folin-Ciocalteu assays), anti-estrogenic (E-screen assay) and anti-inflammatory (carrageenan-induced edema model) activities of total ethanolic extract (TEE) and their fractions (F0 - F8), obtained from M. aquatica L. aerial parts. Despites the TEE did not present significant antiproliferative or antioxidant activities, after filtration column chromatography TEE afforded 4 fractions with moderate (F3, F4 and F6) to potent (F2) antiproliferative activity. More, F2 inhibited the proliferation of the breast (MCF-7) and lung (NCI-H460) tumor cells even after F2 removal from the culture medium without promoting cell cycle alteration after 24 h exposure. Also, F2 was not able to scavenger the DPPH radicals, presented low content of phenolic compounds and did not showed estrogenic and/or antiestrogenic effects. However, the storage of F2 in solution (DMSO, 0.1 mg/ml) promoted chemical changes that resulted in loss of antiproliferative effect and gain of significant estrogenic action, without effect on the cell cycle. Analysis by gas chromatography coupled to mass spectrometry revealed that there are differences in F2 fraction composition before and after storage. However, it was not possible to identify most of the detected substances. Regarding (anti)estrogenic action, TEE showed estrogenic effect (agonist action) while F3 fraction totally inhibited the 17β-estradiol-induced proliferative effect. Finally, in the in vivo assays, it was possible to show that F2 fraction was not toxic after oral administration in the dose range evaluated. However, the same range was not enough to demonstrate the antitumor and anti-inflammatory activities of F2. Moreover, in the Ehrlich solid tumor model, it was possible to evidence that the substances present in the F2 were absorbed, since the treatment prevented the Ehrlich tumor-induced increase of liver relative weight. These results indicated for the potential use of Mentha aquatica aerial parts for the development of adjuvant therapy for the cancer treatment.
2 REVISÃO DA LITERATURA ... 20 2.1 Câncer ... 20 2.2 Gênero Mentha ... 23 2.3 Mentha aquatica ... 24 3 PROPOSIÇÃO ... 28 3.1 Geral... 28 3.2 Específicos ... 28 4 MATERIAL E MÉTODOS ... 29 4.1 Material Vegetal... 29
4.2 Preparação do Extrato Etanólico Total... 30
4.2.1 Análise Qualitativa por Cromatografia em Camada Delgada (CCD) ... 30
4.2.2 Fracionamento por Cromatografia Líquida de Adsorção em Coluna Filtrante ... 30
4.2.3 Análise Qualitativa por Cromatografia a Gás Acoplada à Espectrometria de Massas (CG-EM) ... 32
4.3 Avaliação Farmacológica in vitro ... 32
4.3.1 Avaliação de Atividade Antioxidante Através de Reações Químicas ... 32
4.3.2 Avaliação Farmacológica em Cultura de Células ... 33
4.4 Avaliação Farmacológica in vivo ... 39
4.4.1 Animais de Laboratório ... 39
4.4.2 Preparo da Amostra ... 40
4.4.3 Avaliação da Toxicidade Oral Aguda ... 40
4.4.4 Avaliação de Atividade Anticâncer – Modelo de Tumor Sólido de Ehrlich ... 41
4.4.5 Avaliação de Atividade Anti-inflamatória – Modelo de Edema de Pata Induzido por Carragenina ... 42
4.5 Análises Estatísticas ... 43
5 RESULTADOS ... 44
5.1 Estudo Fitoquímico ... 44
5.2 Estudo Farmacológico ... 46
5.2.1 Atividade Antioxidante Através de Reações Químicas ... 46
6 DISCUSSÃO ... 66
7 CONCLUSÃO ... 72
REFERÊNCIAS ... 73
APÊNDICES ... 86
Apêndice 1 - Protocolo da Solução de Tampão Fosfato em Solução de NaCl de Dulbecco (D-PBS) ... 86
Apêndice 2 - CCD das Frações Obtidas pelo Fracionamento em Coluna Filtrante ... 87
Apêndice 3 - Perfil de Atividade Anti-proliferativa do Extrato Etanólico Total (EET), e suas Frações, obtido das Partes Aéreas de Mentha aquatica ... 88
Apêndice 4 - Efeito da Fração F2, Obtida das Partes Aéreas de M. aquatica, Sobre as Fases do Ciclo Celular ... 89
Apêndice 5 - Avaliação da Atividade (Anti)Estrogênica do Extrato Etanólico Total (EET) das Partes Aéreas de Mentha aquatica e das Frações F2 e F3 no Modelo E-screen, Expressa como Viabilidade (%) da Linhagem MCF-7 Após 144h de Exposição .. 90
Apêndice 6 - Fragmentogramas das Substâncias Detectadas nas Frações F2 Recém Diluída e F2 Armazenada em DMSO ... 91
Apêndice 7 - Variação de Peso Corporal (g) e Avaliação do Peso Relativo (%) dos Camundongos no Teste de Toxicidade Oral Aguda ... 98
Apêndice 8 - Variação de Peso Corporal (A), Avaliação do Peso Relativo (%) dos Órgãos (B) e das Massas Tumorais no Modelo de Tumor Sólido de Ehrlich no Flanco (C) .... 99
Apêndice 9 - Variação do Volume (ml) da Pata Traseira de Camundongos no Teste de Edema de Pata Induzido por Carragenina (3%), em Função do Tratamento e do Tempo de Exposição ao Agente Flogístico ... 100
ANEXOS ... 101
Anexo 1 - Verificação de Originalidade e Prevenção de Plágio. ... 101
1 INTRODUÇÃO
Dentre as doenças de comunicação não compulsória, o câncer, juntamente com doenças cardiovasculares, doenças respiratórias crônicas e diabetes, é um problema crescente de saúde em todo o mundo (WHO, 2018a). Segundo a Organização Mundial da Saúde, estimou-se que em 2018 houve cerca de 9,6 milhões de mortes, sendo a segunda maior causa de morte principalmente em países em desenvolvimento (WHO, 2018b).
Mundialmente, o câncer de pulmão apresenta incidência semelhante à do câncer de mama, porém é o que apresenta o maior índice de mortalidade, seguido do câncer do fígado, colo e reto, estômago e mama (WHO, 2018b). Já no Brasil, os tumores com maior incidência são o de pele do tipo não melanoma, de próstata, estômago, pulmão, mama feminina, cólon e reto e colo do útero e estimou-se no biênio 2018-2019, a ocorrência de 600 mil casos novos de câncer, para cada ano (INCA, 2017).
Com o aumento da expectativa de vida da população, têm-se observado um aumento da incidência do câncer e isso pode ser explicado tanto pelas alterações fisiológicas relacionadas à idade (fatores carcinogênicos endógenos) quanto ao maior período de exposição a agentes carcinogênicos exógenos, como poluição, radiação ultravioleta (UV), tabagismo, as infecções por vírus, bactérias e parasitas e a contaminação de alimentos por micotoxinas (Hoffe e Balducci, 2012; Bhalla et al., 2013).
Assim, tendo em vista os diferentes agentes carcinogênicos e os diferentes tecidos que podem ser acometidos por esta patologia, é correto dizer que o câncer não é uma doença única, mas um conjunto de várias patologias onde há a formação de um tumor maligno, sendo que as células tumorais que formam esse tumor, possuem capacidade replicativa ilimitada e podem se espalhar pelo organismo (Hellman e Vokes, 1996; NIH, 2015). Tendo em vista esta grande diversidade, há uma constante necessidade de novos medicamentos antineoplásicos eficazes contra tumores sólidos, especialmente em estágios avançados da doença e diferentes estratégias têm sido avaliadas tais como a terapia fotodinâmica e a imunoterapia (Bailly, 2009; Kwiatkowski et al., 2018; Nasiri et al., 2018). Neste contexto, os produtos naturais oferecem muitas oportunidades para a inovação em novos medicamentos, seja no tratamento quanto na prevenção do câncer (Bhalla, 2013; Kinghorn et al., 2016; Mazumder et al, 2018). Diversos levantamentos apontam que mais da metade dos medicamentos anticâncer aprovados internacionalmente desde 1981 são produtos naturais per si ou compostos,
sintéticos ou semissintéticos, baseados em produtos naturais originários de plantas, microrganismos ou animais marinhos (Butler et al., 2014; Newman e Cragg, 2016 e 2017).
Alémde atuar sobre as características básicas do câncer, muitas plantas possuem elevado potencial antioxidante o que tem sido postulado como útil no tratamento de muitas patologias crônicas incluindo câncer, doenças cardiovasculares e doenças inflamatórias (Krishnaiah, 2011). Isso porque as espécies reativas de oxigênio e/ou nitrogênio, de origem endógena (subprodutos dos processos metabólicos aeróbicos) ou exógena, podem reagir com o ácido dexorribonucleico (DNA), proteínas intracelulares e lipídeos das membranas danificando essas estruturas (Sainz et al., 2012; Kardeh et al., 2014). Esses danos podem resultar em alterações epigenéticas e ativação de vários alvos moleculares como fatores de transcrição, fatores de crescimento, citocinas, proteínas-quinases, enzimas e receptores. Por isso, o estresse oxidativo tem sido relacionado com a gênese de várias patologias, incluindo o câncer (Prasad et al., 2017).
Na busca de novos fármacos com ação anticâncer, nosso grupo de pesquisa tem avaliado diversos extratos obtidos a partir de plantas através de um teste de atividade antiproliferativa in vitro em um painel de até dez linhagens tumorais humanas (nove tumores sólidos e uma leucemia) baseado no protocolo NCI60 desenvolvido pelo National Cancer Institute (NCI) (Shoemaker, 2006). Dentre as diversas espécies já avaliadas quanto ao potencial antiproliferativo na Divisão de Farmacologia e Toxicologia (DFT), estão as espécies do gênero Mentha (Lamiaceae).
Estudos iniciais de nosso grupo de pesquisa, avaliaram em painel de células tumorais humanas, os extratos diclorometânicos (EBD) e etanólicos (EBE) da Mentha piperita, M. aquatica e M. arvensis, coletadas no campo experimental do CPQBA (Centro Pluridisciplinar de Pesquisas Químicas, Biológicas e Agrícolas), sendo evidenciado que os EBD apresentavam potencial atividade citostática. Porém, o EBD de Mentha piperita demonstrou que as linhagens de mama (MCF-7) e ovário (OVCAR-3) eram mais sensíveis quando expostas ao EBD desta espécie de Mentha (Fiorito, 2016).
Assim, priorizou-se a continuação do estudo com a espécie Mentha piperita, sendo observado que uma fração de média polaridade apresentou efeito antitumoral in vitro (painel de células tumorais) e in vivo (modelos Hollow Fiber e de tumor sólido de Ehrlich) associado a uma ação anti-estrogênica (modelos in vitro E- Screen e in vivo de ação sobre útero de ratas pré-puberes). Esses efeitos foram parcialmente explicados pela presença de ácido p-cumárico, ácido cafeico, naringenina, arbutina, luteolina, eriodictiol e diosmina na fração ativa (Fiorito, 2016).
Devido as diferenças na composição química dessas espécies inicialmente avaliadas, como apontou a análise por cromatografia gasosa acoplada a detector de massas (CG/EM), foi retomada a triagem inicial para avaliação do potencial antitumoral com a espécie Mentha aquatica.
Porém, nesse trabalho, o extrato bruto foi obtido a partir da maceração com álcool etílico, com o intuito de avaliar frações de média a frações com mais polaridade, sendo um diferencial deste trabalho, pois não havia sido descrito na literatura modelos de carcinogênese in vivo com esta espécie. Além disso, o etanol é considerado um solvente recomendável por ser mais seguro (menos inflamável), tóxico (perigoso a saúde humana) e poluente (menos agressivo ao meio ambiente) (de Marco et al., 2019).
2 REVISÃO DA LITERATURA
2.1 Câncer
A fim de que o organismo atinja e mantenha o tamanho de seus órgãos, as células regulam sua proliferação através do processo conhecido por ciclo celular. Esse processo é composto de 5 fases, à saber, fases Go, G1, S, G2 e M (Figura 1) (Alberts et al., 2010). A fase
G0 é aquela na qual a célula não recebe estímulo para iniciar uma nova divisão (Harashima et
al., 2013).
Figura 1 - Fases do ciclo celular
Fonte: Alberts et al., 2010.
Assim, uma parte das células em nosso organismo estão em constante renovação. Para isso, há um equilíbrio entre os estímulos para divisão celular e a sinalização para os processos de morte celular programada. Além disso, para que o ciclo celular avance, é necessário a ativação de várias proteínas-alvo envolvidas no início de cada fase do ciclo celular, além da checagem de possíveis erros da duplicação celular (Melino, 2001; INCA, 2018).
Porém, mutações em alguns genes, que são segmentos do DNA que controlam as funções normais das células, podem ocorrer (INCA, 2018). Desta forma, pode haver a ativação de proto-oncogenes, ou a inativação de alguma proteína supressora, ocorrendo perda do controle da proliferação celular (Ward, 2002). A célula tumoral ou transformada não finaliza o ciclo de replicação celular, isto é, não retorna à fase G0 passando da fase M para
nova fase G1 (Almeida et al., 2005). Portanto, o crescimento celular descontrolado é uma das características das células cancerosas.
Estas células tumorais apresentam ainda a capacidade de invadir tecidos adjacentes, resultando na gradativa morte nutricional dos tecidos normais e possuem alto risco de metástase, que é a formação de tumores em outras regiões diferentes do tumor de origem (INCA, 2018). Clinicamente, apenas considera-se câncer os tumores malignos que apresentam essas características. Quando o crescimento celular ocorre de forma organizada, geralmente lento e com limites bem definidos, classifica-se como tumor benigno (Kassi et al., 2018).
O tumor abriga uma complexa estrutura composta de vasos sanguíneos e células do sistema imune que formam um ambiente propício para as células imortalizadas se manterem. São reconhecidas como características peculiares dos tumores a capacidade de produzir fatores de crescimento para ativar seus próprios receptores, evasão aos mecanismos supressores de proliferação, resistência aos mecanismos de morte celular, capacidade ilimitada de replicação, indução de angiogênese, ativação de mecanismos de invasão tecidual e metástase. Além disso, a instabilidade genômica, que explicaria a diversidade genética observada para tumores originários de um mesmo tecido e a inflamação, têm sido reconhecidas como características que, paralelamente às seis já descritas, favoreceriam o desenvolvimento das células neoplásicas (Hanahan e Weinberg, 2001, 2011).
O processo inflamatório crônico estimula a produção de fatores de crescimento que, além de ativar oncogenes, também estimulam a angiogênese (Weinberg, 2008). Com isso, cria-se um ambiente tumoral ácido, além de uma hipóxia local, que interfere na permeação dos fármacos (Raghunand et al., 2003). Além disso, a inflamação crônica está diretamente relacionada com aumento do risco de desenvolvimento de alguns tipos de câncer (Maman e Witz, 2018).
Outro fator importante é a resistência a morte celular, pois mutações em genes supressores de crescimento celular, como a proteína p53, e disfunções em proteínas responsáveis pela checagem dos pontos de verificação do ciclo celular, como a pRb, podem alterar o processo de regulação do ciclo celular (Weinberg, 2008).
Com relação aos agentes carcinogênicos, reconhece-se a ligação de alguns tipos de cânceres com fatores externos, tais como o fumo e com o câncer de pulmão, a presença da bactéria do Helicobacter pylori com o desenvolvimento do câncer de estômago, e a radiação ultravioleta (UV), causando o câncer de pele. Essa ligação clara permite o desenvolvimento de estratégias de prevenção desses tipos de cânceres. De maneira geral, os agentes carcinogênicos podem ser divididos em fatores intrínsecos e intrínsecos. Os fatores não-intrínsecos incluem fatores endógenos, como a idade, a presença de hormônios, o processo inflamatório e a suscetibilidade genética, e exógenos, como dieta, atividade física e a
exposição a metais pesados, luz UV e poluição. Esses fatores são passíveis de modificação total ou parcial através de alterações no estilo de vida e no cuidado com o meio ambiente (Wu et al., 2018).
Já os fatores intrínsecos são aqueles relacionados às falhas do ciclo celular que podem ocorrer com qualquer pessoa, em qualquer idade, e que representam cerca de 60% da ocorrência dos tumores de tecidos. Esses fatores são considerados como não modificáveis (Wu et al., 2018).
Normalmente são necessárias várias mutações para que se desenvolva o câncer. Desta forma, o câncer poder ser de origem policlonal (originário de mais de uma célula com alguma mutação) ou monoclonal (originário de uma única célula com uma única mutação capaz de gerar descendentes). Por isso após tratamento quimioterápico, em ambas as situações, existe a possibilidade de recidiva a partir de células tumorais resistentes, dificultando o tratamento (Weinberg, 2008).
O tratamento do câncer pode incluir mais de uma das principais modalidades terapêuticas, que são a cirurgia, a radioterapia e a quimioterapia (WHO, 2018a). Dentre os diferentes alvos terapêuticos da quimioterapia, pode-se destacar estratégias para controle do ciclo celular (indutores de apoptose e inibidores de fatores de proliferação e de replicação celular ilimitada) e do processo de angiogênese (inibidores de crescimento endotelial vascular), além da imunoterapia, hormonioterapia (inibidores de aromatase) e inibidores de ciclooxigenases e lipooxigenases, entre outros (Singh et al., 2018).
Com o intuito de minimizar os efeitos adversos da quimioterapia, que geralmente podem estar relacionados com efeitos tóxicos sobre células formadoras de sangue, folículos pilosos, células do sistema digestivo e do trato urinário, tem sido amplamente estudado o uso de microRNAs, anticorpos e nanopartículas para aumentar a sensibilidade dos tumores aos medicamentos e a seletividade do tratamento (Gandhi et al., 2014; Chakraborty et al., 2018). Outras estratégias que complementam o tratamento do câncer incluem transplante de medula óssea, hipertemia, fototerapia, transfusão de sangue e o uso de lasers (American Cancer Society, 2018).
A busca por medicamentos mais seletivos, isto é que inibam a proliferação apenas das células tumorais, continua sendo um dos principais desafios (Sanches Jr et al., 2010). Sabendo-se que muitos dos medicamentos atualmente aprovados para o tratamento do câncer, como paclitaxel, irinotecano e doxorrubicina, são oriundos e/ou derivados de substâncias isoladas de plantas e microrganismos, os produtos naturais apresentam elevado potencial terapêutico frente a diferentes alvos biológicos. Por exemplo, o mentol que é um dos
compostos presentes em espécies de menta, age sobre topoisomerases e em fatores antiinflamatórios como o fator de transcrição nuclear kappa B (NFкB) (Croteau et al., 2006; Pollier et al., 2011; Singh et al., 2018). Apesar desses efeitos, o mentol é classificado como Generally Recognized As Safe (GRAS) para uso em alimentos e para o uso tópico, em formulações cosméticas e farmacêuticas, seu uso é seguro até a concentração de 16% (Wang et al., 2012).
2.2 Gênero Mentha
As espécies do gênero Mentha (família Lamiaceae) são oriundas da região do Mediterrâneo e leste da Ásia Central. Este gênero inclui 18 espécies e 11 híbridosdistribuídos em quatro seções, com base em análises filogenéticas de morfologia, número de cromossomos e substâncias majoritárias presentes no óleo essencial (Tucker e Naczi; 2007). Hibridação é o cruzamento, natural ou artificial, de indivíduos de espécies diferentes do mesmo gênero, como a Mentha piperita que resulta de um cruzamento entre M. aquatica e M. spicata (Sun et al., 2014). Estas espécies são conhecidas popularmente como hortelãs ou mentas e apresentam grande interesse econômico. A produção do óleo de Mentha é estimada em 40.000-45.000 toneladas contra a produção do ano passado de 35.000 toneladas (ET Markets, 2018).
Industrialmente usada na confecção de cremes dentais, bebidas, gomas de mascar, cosméticos e pesticidas, as mentas são amplamente usadas também na culinária e na medicina popular (Salehi et al., 2018). Os usos populares mais comuns são para tratamento de náuseas, problemas gastrointestinais, doenças do trato respiratório superior e enxaqueca (Cowan, 1999; Barros et al., 2015).
Com relação à composição química, já foram identificados diversos compostos terpênicos e polifenólicos em espécies de mentas. Os terpenos são classificados de acordo com a quantidade de unidades de isoprenos presentes em sua molécula. Dentre todas as classes de metabólitos secundários, esta classe representa a maior e a mais diversificada encontrada em plantas, sendo conhecidos cerca de 30.000 terpenos (Niero e Malheiros, 2016). Já os compostos polifenólicos podem ser classificados, em função da via metabólica, como resultantes da via acetato/malonato, que forma os policetídeos, ou da via do chiquimato que forma fenilpropanoides. Dentre estes últimos, destacam-se os flavonoides, os ácidos fenólicos, os tocoferóis e os taninos (Angelo e Jorge, 2007; Lattanzio, 2013).
Além disso, várias atividades farmacológicas de preparações contendo as mentas já foram comprovadas tais como atividades antimicrobianas, antioxidantes, anti-inflamatórias, neuroprotetoras, inseticida, antivirais, cardiovasculares e antitumorais além de efeitos inibitórios sobre as enzimas colinesterase (acetil e butil) e histona deacetilase (Mimica-Dukić e Božin 2008; Geuenich et al., 2008; Sun et al., 2014; Barros et al., 2015; Brahmi et al., 2017; Salehi et al., 2018). Com relação à atividade antioxidante, alguns estudos apontaram que os óleos essenciais de várias espécies de menta seriam promissores antioxidantes naturais que poderiam substituir em produtos cárneos os antioxidantes sintéticos, como o butilhidroxi-anisol (BHA) e o butil-hidroxi-tolueno (BHT), que são usados para preservar alimentos (Mimica-Dukić e Božin, 2008).
2.3 Mentha aquatica
A Mentha aquatica (Figura 2), é uma planta perene, encontrada em lugares úmidos e ao longo de cursos d’água, comum na Europa, Norte da África, e oeste da Ásia, e foi introduzida na América e Austrália (Tucker e Naczi, 2007). Existem duas variedades de M. aquatica: M. aquatica var. aquatica que é a menta aquatica e a M. aquatica var. citrata que é a menta laranja (Tucker e Naczi, 2007).
Figura 2- Mentha aquatica L.
Fonte: https://www.naturespot.org.uk/species/water-mint
Com o intuito de verificar o que já havia sido estudado a respeito da composição química dos extratos das partes aéreas de Mentha aquatica, bem como suas atividades farmacológicas, foi feito um levantamento bibliográfico nas bases de dados do Scopus, Web of Science e Pubmed em janeiro de 2018.
Para tanto, utilizou como palavra chave o termo “Mentha aquatica” e selecionaram-se todos os trabalhos presentes nas áreas de Farmacologia, Química, Medicina,
Imunologia, Neurologia e Veterinária e o período de busca foi selecionado como o “Full”, ou seja, todo o acervo disponível em cada uma das bases até o momento da pesquisa. Após exclusão dos artigos que descreviam o óleo essencial, as características fisiológicas da espécie e aqueles que apareciam duplicados, chegou-se a um total de 33 artigos, que foram analisados. Com relação aos usos populares, no Irã, as folhas são usadas na forma comestível como tônico e para tratamento da flatulência, enquanto na Turquia é comum o uso da infusão para dor de estômago (Ahvazi e Akbarzadeh, 2017; Güneş et al., 2017). Na África do Sul, é comum usar M. aquatica para tratar desordens mentais, tais como a epilepsia, e para o tratamento da depressão (Stafford et al., 2008). Há relatos de que as folhas secas da Mentha aquatica são queimadas junto com as de Tagetes minuta L. (Asteraceae) e a fumaça é inalada para tratar doenças mentais e como remédio contra resfriados, problemas respiratórios e para proteger contra "espíritos malignos" (Ferhat et al., 2017a).
No norte de Portugal, esta espécie é usada popularmente para tratamento de dor, nevralgia, enxaqueca, como enxaguatório bucal, digestivo, tônico e estimulante do apetite, além do tratamento de asma, tosse e como anti-tabaco (Neves et al., 2009). Já na fitoterapia persa, é usada para tratar náuseas e vômitos (Darvishpor et al., 2018).
Muitos estudos apontam que os extratos de M. aquatica apresentam triterpenos, compostos fenólicos e flavonoides (Ferhat et al., 2017b; Venditti et al., 2017). Assim, a partir do extrato cetônico das raízes foram isolados dois novos compostos triterpênicos, os ácidos maquatico e 3-O- benzoiltormentico juntamente com 8 triterpenos conhecidos, enquanto do extrato clorofórmico das partes aéreas mais quatro derivados triterpênicos conhecidos foram identificados (Ferhat et al., 2017b).
Com relação ao teor de compostos fenólicos totais, as concentrações variaram de 58,05±2,20 (Ferhat et al., 2017b) a 156,15 ± 6,4 mg/g em equivalentes de ácido gálico (Ebrahimzadeh et al., 2010) e há 1 relato de 337 ±2,15 mg/g em equivalentes de ácido clorogênico (Conforti et al., 2008a). Já as análises de flavonoides totais variaram entre 15,75± 0,25mg/g (Conforti et al., 2008a) a 17,05 ± 0,63 mg/g em equivalentes de quercetina (Ebrahimzadeh et al., 2010).
Por sua vez, o ácido rosmarínico frequentemente está presente em espécies da família Lamiaceae havendo relatos de 24,6 ± 0,2 mg/g-1 de ácido rosmarínico no extrato das
partes aéreas de M. aquatica preparado com mistura de água/metanol/2-propranolol (80:10:10), contendo 0,085% de ácido O-fosfórico (Shekarchi et al., 2012). Já a partir do extrato obtido com éter dietílico das folhas de M. aquatica, foram identificadas 4 agliconas
derivadas de apigenina (xantomicrol, gardenina B, salvigenin e pebrelina) (Voirin et al., 1999).
Sabe-se que vários compostos fenólicos apresentam capacidade antioxidante e são promissores substitutos aos antioxidantes usados industrialmente, já que o BHA e o BHT são suspeitos de serem carcinogênicos (Ebrahimzadeh. et al. 2010).
Ainda em relação a atividade antioxidante, diferentes extratos preparados a partir das partes aéreas de M. aquatica foram avaliados através do teste de captura de radicais DPPH com atividade (expressa como IC50) variando de inativo (Ferhat et al., 2017b) para 29
µg/ml (Conforti et al., 2008b) e 46,05 ± 1,7 µg/ml (Ebrahimzadeh et al., 2010). Estas variações podem tanto ser resultantes da influência de fatores ambientais durante o cultivo quanto de pequenas diferenças nas metodologias empregadas para o teste de 2,2-difenil-1-picrilhidrazil (DPPH·+).
Estudos com outros modelos experimentais evidenciaram que os extratos metanólicos das partes aéreas e das raízes da M. aquatica, não apresentaram atividade de inibição da peroxidação lipídica pelo sistema beta-caroteno e ácido linoleico (Ferhat et al., 2017b). Porém, no modelo de peroxidação induzida por peróxido de hidrogênio (H2O2), o
extrato metanólico de M. aquatica apresentou efeito antioxidante significativo protegendo as células de linhagem celular derivada de um feocromocitoma da medula suprarreal de rato (PC12) do dano oxidativo. Esse efeito foi atribuído à presença dos ácidos linoleico e ursólico (López et al., 2010). Mais ainda, o extrato etanólico de M. aquatica foi considerado com moderada atividade inibitória de óxido nítrico, alta atividade de quelação de metais com o ácido etilenodiamino tetra-acético (EDTA) e fraca atividade de inibição da peroxidação lipídica (Ebrahimzadeh et al., 2010).
Em relação a atividade antiproliferativa dos extratos de M. aquatica, foram evidenciados efeitos sobre a proliferação de diferentes linhagens celulares tais como Hela (carcinoma cervical humano), Hep2 (carcinoma humano da laringe), Vero (células de rim de macaco-verde africano) (Rahimifard et al., 2010), MCF-7 (células tumorais de mama, humana); LNCaP (células tumorais de próstata, humana); C32 (melanoma) e ACHN (células renais, adenocarcinoma) (Conforti et al., 2008a) com resultados mais promissores frente as linhagens Hela e MCF-7.
Em relação a atividade antimicrobiana, os extratos metanólicos de M. aquatica se destacaram com atividade contra as cepas Morganella morganii, Salmonella heidelberg e Klebsiella pneumoniae (Ferhat et al., 2017b). Outras atividades comprovadas para diferentes extratos das partes aéreas de M. aquatica incluem fraca atividade anti-inflamatória quando
aplicada topicamente (Conforti et al., 2008a) e inibição total da enzima lipase pancreática (Marrelli et al., 2014; Buchholz et al., 2016).
Uma grande parcela dos estudos farmacológicos com M. aquatica buscou comprovar seu uso para o tratamento de desordens mentais. Assim, o extrato etanólico obtido das folhas apresentou baixa afinidade pelo receptor de recaptação de serotonina (Nielsen et al., 2004), forte afinidade pelo receptor GABA-A (Stafford et al., 2005) e atividade inibitória sobre MAO (fração total e MAO-A) (Stafford et al., 2007; Olsen et al., 2008; López et al., 2010), o que poderia explicar os efeitos sobre epilepsia e ação ansiolítica relatados popularmente. Essas atividades parecem estar relacionadas com a presença de flavonas e flavanonas; dentre elas, postulou-se inicialmente que a naringenina poderia ser a principal molécula envolvida com esses efeitos. Porém, estudos demonstraram que esse composto não promoveu efeito ansiolítico pela modulação do GABA-A, mas sim promoveu uma diminuição significativa no movimento motor de ratos, além de ser capaz de atravessar a barreira hemato-encefálica (Stafford et al., 2007; Anderson et al., 2012). Foi demonstrado ainda que o extrato clorofórmico das partes aéreas de M. aquatica foi capaz de inibir acetilcolinesterase (IC50 =
20,18 ± 0.55 µg/ml) que está relacionada, entre outros eventos, à progressão da doença de Alzheimer (Ferhat et al., 2017b).
Com relação a efeitos tóxicos, foram encontrados relatos de baixa atividade anti-hemolítica (Ebrahimzadeh. et al., 2010), ausência de efeitos tóxicos avaliados pelo teste in vitro de toxicidade aguda Microtox (Conforti et al., 2008a) além de evidências de diminuição nos parâmetros respiratórios e de potencial de membrana em isolado de mitocôndrias hepáticas (Ferreira et al., 2013).
Com base na disponibilidade de material vegetal, nos dados da literatura e nos resultados anteriores de nosso grupo de pesquisa, este trabalho teve por objetivo aprofundar a avaliação do potencial antiproliferativo do extrato das partes aéreas de M. aquatica, a fim de se evidenciar sua atividade anticâncer in vivo e seu possível efeito anti-inflamatório, além do estudo fitoquímico buscando correlacionar a composição química com as atividades observadas, contribuindo assim para o conhecimento da atividade farmacológica e de segurança para uso medicinal desta espécie.
3 PROPOSIÇÃO
3.1 Geral
Estudo fitoquímico e avaliação in vitro e in vivo da eficiência na terapia antitumoral do extrato etanólico total das partes aéreas de Mentha aquatica.
3.2 Específicos
Extração por maceração com etanoldas partes aéreas moídas de M. aquatica; Fracionamento por cromatografia em coluna filtrante com as frações obtidas analisadas por CCD e agrupadas por semelhança;
Avaliação por cromatografia gasosa acoplada a detector seletivo de massas (CG/EM) da fração mais ativa nos modelos in vitro.
Avaliação do extrato etanólico total e frações em linhagens celulares humanas, tumorais e não tumoral, de efeitos sobre viabilidade, proliferação e ciclo celular;
Avaliação da capacidade antioxidante, através dos testes de DPPH e determinação de fenólicos totais, do extrato etanólico total e frações;
Determinação da dose máxima tolerada da fração mais ativa in vitro em camundongos por via oral;
Avaliação das atividades anticâncer (modelo experimental de tumor sólido de Ehrlich) e anti-inflamatória (modelo de edema de pata por carragenina em camundongo).
4 MATERIAL E MÉTODOS
A Figura 3 apresenta o esquema geral do estudo realizado com extrato etanólico total (EET) das partes aéreas de M. aquatica e suas frações. Cada uma das etapas será detalhada ao longo do texto.
Figura 3 - Esquema geral do estudo realizado com o extrato etanólico total das partes aéreas de M. aquatica e suas frações
Análise por CG/EM
•Viabilidade celular •Antiproliferativo •E-screen •Clonogênico •Ciclo celular Partes aéreas M. aquatica
Extrato etanólico total (EET)
F1 F3
•Atividade antiproliferativa in vitro •Atividade antioxidante in vitro
F4 F5 F6 F7 F8 F2 F0 EET F2 1 2 In vitro 3 In vivo
•Dose máxima tolerada •Tumor sólido de Ehrlich •Edema de pata induzido por carragenina Fracionamento
Extração
Fonte: A autora
4.1 Material Vegetal
A coleta das partes aéreas de Mentha aquatica exsicata (CM 19) foi realizada durante o período da manhã, em início de maio,na estufa da Coleção de Plantas Medicinais e Aromáticas (CPMA), localizado no Centro Pluridisciplinar de Pesquisas Químicas Biológicas e Agrícolas (CPQBA), em Paulínia, São Paulo, pertencente à Universidade Estadual de Campinas (Unicamp). As plantas estavam com exposição a luz por 24 h e a coleta foi realizada 40 dias após o plantio. A segunda coleta foi realizada em junho com as plantas nas mesmas condições de cultivo.
A identificação, o cultivo e a coleta foram realizados sob supervisão do Eng. Agrônomo Dr. Ílio Montanari Jr e do biólogo Benício Pereira, ambos da Divisão de Agrotecnologia do CPQBA/UNICAMP.
4.2 Preparação do Extrato Etanólico Total
A etapa fitoquímica foi realizada em colaboração com a Profa. Dra. Mary Ann Foglio, da Faculdade de Ciências Farmacêuticas, da Universidade Estadual de Campinas.
As partes aéreas frescas de M. aquatica foram trituradas com gelo seco e extraídas sucessivamente por maceração dinâmica (3 x 90 min) com etanol (proporção planta:solvente de 1:6, m/v). A cada ciclo, foi feito processo de filtração à vácuo para retirar partículas maiores. O solvente orgânico foi eliminado por evaporação sob vácuo em rotaevaporador.
4.2.1 Análise Qualitativa por Cromatografia em Camada Delgada (CCD)
Para a técnica da adsorção e separação dos compostos em bandas coloridas, foram utilizadas como fase estacionária, cromatoplacas de silicagel 60 F254 (Merck®1.05554) e, 100 ml de fase móvel (60 ml de hexano/ 40 ml de acetato de etila). As amostras foram aplicadas com auxílio de capilares de vidro e a placa foi revelada com solução de anisaldeído [ácido acético/p-anisaldeído/ácido sulfúrico (48:1:1)] seguido de aquecimento em estufa, a 110 ºC, por 3 a 5 minutos. Os capilogramas foram analisados em luz ultravioleta, porém não foi observado fluorescências.
4.2.2 Fracionamento por Cromatografia Líquida de Adsorção em Coluna Filtrante O extrato etanólico total (EET) de M. aquatica (20 g) foi submetido à cromatografia líquida de adsorção em coluna filtrante com o objetivo de se encontrar a fração com maior atividade biológica. Sendo assim, 40 g de terra diatomácea (Celite 545 – Nuclear) foram adicionados ao EET com a finalidade de tornar a amostra espessa (formando uma “papa”) que, após ser seca por sistema de evaporação rotativa, formou um pó.
Para preparação da coluna, foi utilizada como fase estacionária 140 g de sílica-gel (Sílica gel 60 – Merck; 0,0063 – 0,200 mm). A sílica-gel foi colocada em um funil de placa porosa de 500 ml.
Montou-se o funil com sílica, o extrato e o algodão, nessa ordem (Figura 4). A seguir iniciou-se a eluição da fase móvel. Como fase móvel da coluna filtrante, foi utilizado um gradiente em polaridade crescente de hexano, acetato de etila e metanol (Tabela 1).
Figura 4 - Fracionamento do extrato etanólico total das partes aéreas de Mentha aquatica por cromatografia em coluna filtrante
Fonte: A autora
Tabela 1 - Relação de gradiente da fase móvel utilizada no fracionamento por cromatografia líquida de adsorção do EBE de M. aquatica
Eluente 1 2 3 4 5 6 7 8
Hexano 100 95 90 80 70 50 0 0
C4H8O2 0 5 10 20 30 50 100 0
CH3OH 0 0 0 0 0 0 0 100
Fonte: A autora
Durante a eluição foram obtidas 31 frações, de 50 ml cada em frascos âmbar identificados, as quais foram analisadas por cromatografia em camada delgada (CCD) para reunião das frações com perfil cromatográfico semelhante. Em seguida, as frações reunidas tiveram seus solventes evaporados sob vácuo, por meio de sistema de evaporação rotativo (Büchi RE 215), e seus rendimentos mássicos foram determinados.
4.2.3 Análise Qualitativa por Cromatografia a Gás Acoplada à Espectrometria de Massas (CG-EM)
Alíquotas da fração F2 (não diluída em DMSO e previamente diluída e armazenada em DMSO – 100 mg/ml) foram devidamente diluídas (30 mg/ml, em metanol)e analisadas em cromatógrafo a gás Agilent, modelo HP-5890, série II, equipado com coluna capilar (30m x 0.25mm x 0,25µm, HP-5MS) acoplado a um detector seletivo de massas Agilent, modelo HP-5975.
As condições de temperatura foram de 220 °C no injetor, 250 °C no detector e o aquecimento da coluna foi 60 °C com razão de aquecimento de 3 °C /min até 240 °C. Como gás de arraste foi empregado o Hélio (He), com fluxo de 1 ml/min. O volume injetado de amostra foi de 2 µL e o detector seletivo de massas operará a 70 eV, com varredura de m/z entre 30 a 500 u.m.a. A identificação dos constituintes químicos foi feita através da análise comparativa dos espectros de massas das substâncias com a biblioteca eletrônica do sistema CG-EM (NIST-05, Versão 2.0).
Estas análises foram realizadas para a fração F2 (recém diluída e armazenada diluída em DMSO) em colaboração com o prof. Dr. José Luiz da Costa, da Faculdade de Ciências Farmacêuticas, Unicamp.
4.3 Avaliação Farmacológica in vitro
A etapa farmacológica foi realizada na Divisão de Farmacologia e Toxicologia, do CPQBA/Unicamp.
4.3.1 Avaliação de Atividade Antioxidante Através de Reações Químicas
4.3.1.1 Avaliação de Capacidade de Sequestrar Radical DPPH•+
Foi feita uma curva de calibração a partir de uma diluição seriada de Trolox (ácido 6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametilcromano-2-carboxílico), o antioxidante de referência (Brem et al., 2004), com etanol p.a. As concentrações usadas para as amostras EET e frações foram de 31,25; 62,5; 125 e 250 µg/ml.
A seguir, 100 µl da solução da amostra em teste (em cada uma das quatro concentrações) foram colocados em cada compartimento, seguida da adição de 100 µl da solução recém preparada de DPPH•+ (160 μM em etanol), em placa de 96 compartimentos e a
leitura espectrofotométrica foi feita a cada 5 min até um tempo final de 30 min, em leitor de microplacas, a 515 nm.
A porcentagem de DPPH•+ livre foi calculada como % DPPH•+ livre = 100 x
([DPPH•+]livre/[DPPH•+]T0), sendo a concentração efetiva 50 (EC50) definida como aquela
capaz de reduzir a concentração inicial (T0) de DPPH•+ em 50%. Assim, utilizou-se o
programa Graph Pad Prism® para calcular essa concentração, que está relacionada com a
(TEC50), sendo o comportamento cinético da amostra em análise classificado como rápido
(TEC50 < 5 min), intermediário (TEC50 entre 5 e 30 min) ou lento (TEC50 > 30 min). Os
parâmetros EC50 e TEC50 foram correlacionados através do cálculo de eficiência antiradicalar
(AE, do inglês antiradical efficiency) através da expressão AE = 1/(EC50 x TEC50), calculado
em Microsoft Office Excel 2007, conforme preconizado por Jiménez-Escrig e colaboradores (2000).
4.3.1.2 Avaliação de Atividade Redutora pela Reação de Folin-Ciocalteu
Cada amostra (extrato etanólico de M. aquatica e todas as frações obtidas por cromatografia em coluna, 1 mg/ml, 10 µL) foi misturada a 600 µL de água destilada. Alíquotas (em triplicata) de 150 µL foram misturadas, em placas de 96 compartimentos, com reagente de Folin-Ciocalteu (12,5 µL/compartimento), solução de carbonato de sódio (Na2CO3),(10%, 37,5 µL/compartimento) e água destilada (50,0 µL/compartimento). A placa
foi incubada a 37C, por 2h, antes da leitura da absorbância em 765 nm. Ácido gálico foi utilizado como composto fenólico de referência e os resultados foram expressos como mg equivalente de ácido gálico (EAG)/g de amostra (Huang, 2005).
4.3.2 Avaliação Farmacológica em Cultura de Células
4.3.2.1 Linhagens Celulares
Dez linhagens de células tumorais humanas (Tabela 2), gentilmente cedidas pelo Instituto Nacional do Cancer/EUA, foram mantidas em cultura em meio completo [meio RPMI 1640 (GIBCO BRL) com vermelho fenol suplementado com 5% de soro fetal bovino (GIBCO BRL) e 1% de penicilina:estreptomicina (1000U/ml:1000µg/ml)], em garrafas T25 ou T75, em incubadora com atmosfera umidificada, com 5% de CO2, a 37 C. As mesmas
condições foram utilizadas para manutenção da linhagem não tumoral de queratinócitos humanos (HaCaT, doada pelo prof. Dr Ricardo Della Coletta, Faculdade de Odontologia de Piracicaba, Unicamp).
Tabela 2 - Linhagens celulares utilizadas nos estudos in vitro
Linhagem Órgão/Doença D.I.
#
(x 104 cel/ml)
U251 SNC; glioma 4,0
MCF-7 Mama; adecarcinoma 6,0
NCI-ADR/RES * Ovário; adenocarinoma 5,0
786-0 Rim; adenocarcinoma 5,0
NCI-H460 Pulmão; carcinoma tipo não pequenas células 4,0
PC-3 Próstata; adenocarcinoma 4,5
OVCAR-3 Ovário; adenocarcinoma 7,0
HT29 Cólon; adenocarcinoma 5,0
K562 Medula óssea; Leucemia mielóide crônica 6,0
HaCaT Pele (queratinócito); Não tumoral 4,0
* esta linhagem apresenta resistência a múltiplos fármacos; # D.I.= densidade de inoculação para o teste de atividade antiproliferativa.
4.3.2.2 Preparação das Amostras
Todas as amostras avaliadas (extrato e frações) foram previamente diluídas em dimetilsulfóxido (DMSO) na concentração de 10 mg/ml e em seguida submetidas a diluição seriada com meio completo para obtenção das concentrações empregadas em cada teste.
O DMSO é um co-solvente usualmente empregado devido sua grande capacidade em solubilizar vários compostos, permitindo a posterior diluição em meio aquoso, a sua baixa toxicidade (Bosanquet, 1985; Mallick et al., 2007). Além disso, no esquema de diluição empregado, a concentração final de DMSO sempre foi igual ou inferior a 0,25% o que não interfere com a viabilidade celular (Longato, 2014).
4.3.2.3 Avaliação de Atividade Antiproliferativa
A atividade antiproliferativa foi avaliada frente ao painel de células apresentado na Tabela 2, com base no protocolo descrito por Monks e colaboradores (1991). Para a avaliação inicial do extrato etanólico total e suas frações foram testadas, em triplicata, nas concentrações de 0,25 a 250 µg/ml, com tempo de exposição de 48 horas. Em um segundo experimento, a fração F2 foi testada, em triplicata, nas concentrações de 0,0025 a 2,5 µg/ml com tempo de exposição de 24 e 48 h.
Como método para avaliação colorimétrica foi escolhido a coloração com sulforrodamina B, que é um corante usado por se ligar nas aminas presentes nas proteínas celulares
das células viáveis (Monks et al., 1991). Todas as demais condições (densidade de inoculação, faixa de concentração de amostras e desenho da placa experimental) foram padronizadas em nosso laboratório ao longo de 20 anos de pesquisa, tendo como base as informações disponíveis sobre o experimento NCI60 desenvolvido pelo National Cancer Institute, dos EUA (Monks et al., 1991; Shoemaker, 2006; DTP, 2015).
A placa T0 montadas nesses protocolos, permite inferir a quantidade de células presentes no momento da adição das amostras. Assim, para os tempos de exposição de 24 e 48h, os resultados foram expressos como proliferação celular, em porcentagem, considerando-se a diferença entre as absorbâncias das células viáveis sem tratamento ao final (T1) e no início (T0) do período de exposição como o 100% de proliferação. Isto porque esses tempos de exposição (24 e 48h) permitiram que as linhagens testadas completassem pelo menos um ciclo celular.
Além disso, o teste de atividade antiproliferativa permite analisar se a amostra apresenta atividade citostática (inibição da proliferação celular), que é expressa no gráfico por valores de crescimento celular entre 0 e 50%, ou se apresenta atividade citocida (indução de morte celular), representada pelos valores entre 0 e -100% no gráfico de crescimento celular.
As células dispostas em placas de 96 compartimentos (100 µL/compartimento de suspensão celular, densidade de inoculação: Tabela 2) foram expostas às diferentes concentrações de cada uma das amostras em teste e incubadas por 24 ou 48h a 37 °C, em atmosfera úmida com 5% de CO2. Com base em resultados anteriores, sabe-se que a
concentração final de DMSO (< 0,25%) não interfere na viabilidade celular (Longato, 2014). Uma placa controle, contendo alíquotas de todas as suspensões celulares utilizadas, foi fixada com ácido tricloroacético (TCA) 50% (p/v, 50 µL/compartimento) no momento da adição das amostras.
Após o período de exposição, as células foram fixadas com ácido tricloroacético (TCA), mantidas em geladeira a 4ºC por 1 hora e lavadas 4 vezes consecutivas em água
corrente, para a remoção de resíduos de TCA, meio, soro fetal bovino e metabólitos secundários. Após serem secas à temperatura ambiente, todas as células foram coradas com 50 μL/compartimento de sulforrodamina B (SRB Sigma®) 0,4% (p/v) dissolvida em ácido acético 1%; e mantidas por 20 minutos à temperatura ambiente.
A seguir, as placas foram lavadas com solução de ácido acético a 1% para remoção do excesso de corante e secas à temperatura ambiente. Finalmente, o corante ligado às proteínas celulares foi solubilizado com 150 μL/compartimento de Trizma Base (10 μM, pH 10,5) (Sigma®) (Fiorito, 2016). A proliferação celular foi determinada por quantificação espectrofotométrica (540 nm) em leitor de microplacas (Molecular Devices®, modelo
VersaMax). As médias das absorbâncias foram calculadas descontando-se o valor de seus respectivos brancos e, através das fórmulas a seguir, foi determinado o crescimento (%) de cada linhagem testada frente às diferentes amostras.
Se TA ≥ T0, a amostra foi citostática e a fórmula utilizada foi 100 x [(TA- T0)/(T1- T0)]. Se TA< T0, a amostra foi citocida e a fórmula utilizada foi 100 x [(TA- T0)/(T0)].
Sendo TA a média da absorbância da célula tratada, T1 o controle de célula e T0 o controle das células no dia da adição das amostras.
Com esses valores, foram construídas curvas de crescimento celular de cada linhagem em função da concentração da amostra, e a partir delas foram calculadas as concentrações efetivas GI50 (concentração necessária para inibir em 50% a proliferação
celular) e TGI (concentração necessária para inibição total de crescimento celular) através de regressão não linear, tipo sigmoidal, empregando-se software ORIGIN 8.0 (OriginLab Corporation).
4.3.2.4 Avaliação da Viabilidade
Para avaliação da viabilidade, as linhagens tumorais humanas descritas na Tabela 2 foram expostas por 6 h à F2, em triplicata, (0,0025 a 2,5 μg/ml). Para esta avaliação, não foi preparada a placa controle T0, pois com esse tempo de exposição foi inferior ao tempo para finalização do ciclo celular das linhagens avaliadas.Ou seja, o valor de absorbância medido para as células sem tratamento ao final (T1) do período de exposição representaram 100% de células viáveis.
Ao final das 6 horas de incubação a 37 °C, em atmosfera úmida com 5% de CO2,
as células foram fixadas com SRB e quantificadas por espectrofotometria conforme descrito no item 4.3.2.3, usando um protocolo baseado da literatura (Monks et al., 1991; Shoemaker, 2006).
As médias das absorbâncias foram calculadas descontando-se o valor de seus respectivos brancos e, através de regra de três simples, foi determinada a viabilidade (%) de cada linhagem testada frente às diferentes amostras. Com esses valores, foram construídos gráficos de barras de viabilidade celular de cada linhagem em função da concentração da amostra, empregando-se software GraphPad Prism 5.0.
4.3.2.5 Teste Clonogênico
O teste clonogênico foi realizado com base nos protocolos descritos por Franken et al. (2006). Com base nos resultados dos testes de viabilidade celular e de atividade
antiproliferativa, foram selecionadas para esta avaliação as linhagens tumorais de mama MCF-7 (d.i. 6x104 ml-1) e de pulmão NCI-H460 (d.i. 4x104 ml-1) que foram cultivadas em
garrafas T25 (1 garrafa/tratamento). Quando a camada celular atingiu cerca de 80% de confluência (geralmente 24 h após plaqueamento), as células foram tratadas por 24 h com a fração F2, nas concentrações finais de 0,05; 0,25; 0,5 e 1 μg/ml, nas próprias garrafas. Também foram preparadas garrafas contendo células não tratadas (controle negativo). Após o período de exposição, as células foram lavadas com tampão PBS, tripsinizadas e recolhidas em meio completo (5 ml/garrafa). A densidade celular de cada suspensão foi determinada através de contagem de células em câmara de Neubauer. Em seguida, cada suspensão celular ajustada para 100 células viáveis em 2 ml de meio de cultura completo, sem nova adição de amostra, e plaqueada em placas de 6 compartimentos (2 ml/compartimento), em triplicata. Em seguida, as placas foram incubadas por um período de 7 a 10 dias para o desenvolvimento das colônias, sem troca de meio de cultura durante o período.
Por fim, o meio de cultura foi cuidadosamente removido e os compartimentos foram lavados com 2 ml/compartimento, uma única vez, com solução de tampão fosfato em salina de Dulbecco (D-PBS) (Apêndice 1). As colônias foram então fixadas com Metanol:D-PBS (1:1, v/v, 2 ml/compartimento) por 2 minutos, as soluções foram desprezadas e em seguida as colônias foram fixadas com Metanol 100% (2 ml/compartimento) por 10 minutos, ao final dos quais a solução foi desprezada. Após secagem completa à temperatura ambiente, as colônias foram coradas com solução de cristal violeta (MerckMillipore, Brasil; 0,1% em água destilada, 2 ml/compartimento) durante 10 minutos, seguida de três etapas de lavagem em água de torneira (2 ml/compartimento), 3 etapas de lavagem com água destilada (2 ml/compartimento) e secagem completa à temperatura ambiente.
Com auxílio de microscópio óptico invertido, foi determinado o número de colônias por tratamento. Foi considerada como 1 colônia os aglomerados celulares com pelo menos 50 células cada. Com esses resultados foram calculadas a eficiência de plaqueamento (Ep, Equação 1) e a porcentagem de colônias que sobreviveram (SF, Equação 2) após o tratamento com a F2 conforme descrito por Franken et al. (2006).
Ep (%) = [(nº colônias no controle/ nº células semeadas por poço)] / nº de replicatas x 100 (Eq. 1)
SF = [(nº colônias no tratamento/ nº células semeadas por poço)] / nº de replicatas x Ep (Eq. 2).
4.3.2.6 Avaliação de Ciclo Celular Através de Citometria de Fluxo
Este teste foi realizado empregando-se citômetro de fluxo Guava EasyCiteTM MiniSystem Millipore®. O protocolo usado foi com base em experimentos anteriores do nosso grupo de pesquisa (Paiva, 2016) e nas orientações do fabricante.
Foram selecionadas para esta avaliação as linhagens tumorais de mama MCF-7 (d.i. 5,5x104 ml-1) e de pulmão NCI-H460 (d.i. 4 x104 ml-1) que foram cultivadas em placas de
cultura de 12 compartimentos. Quando a camada celular atingiu cerca de 80% de confluência (geralmente 24 h após plaqueamento), as células foram submetidas a um processo de sincronização de ciclo por manutenção das células em meio de cultivo sem soro fetal bovino por 24 h. Ao final deste período, as células foram tratadas por 24 h com a fração F2 de M. aquatica, nas concentrações finais de 0,12; 0,25 e 0,5 μg/ml (volume final 2 ml/compartimento), em triplicata. Após o período de exposição, o meio de cultivo de cada compartimento foi coletado em um tubo de centrífuga, as células foram tripsinizadas e cada suspensão celular foi reunida ao meio previamente recolhido. As suspensões celulares resultantes foram centrifugadas (centrifuga Eppendorf ® 5403, Alemanha) por 5 min, a 2500 rpm, a 4ºC. Os sobrenadantes foram descartados e os pellets celulares foram ressuspensos com 1 ml de PBS e centrifugado nas mesmas condições. Após descarte do sobrenadante, os pellets celulares foram ressuspensos com 100 µl de PBS e transferidos para eppendorfs previamente preparados com etanol 70% gelado, que atua como agente fixador e de permeabilização de membrana celular e mantidos por, 24 h a 4º C. Após este período, as suspensões foram centrifugadas (5 min, 2500 rpm) e o cada pellet celular foi lavado com PBS (1 ml) e centrifugado novamente. Cada precipitado celular foi então resuspendido em 200 μL do reagente Guava® Cell cycle (Merck/Millipore 4500-0220) e incubado por 30 min, a
temperatura ambiente e protegidos da luz. As análises por citometria de fluxo empregaram o software Guava®Cell Cycle (5.000 eventos por replicata). Como controle negativo foram utilizadas células sem tratamento.
Através do uso de um marcador fluorescente com iodeto de propídio (PI), que se liga especificamente aos ácidos nucleicos, são realizadas medidas das quantidades de células e de DNA por célula. Os resultados são obtidos na forma de 2 picos que correspondem às fases G1/G0 (teor DNA = 2N) e G2/M (teor DNA = 4N) enquanto a fase S (2N < teor DNA < 4N) apresenta-se como um faixa de fluorescência entre os dois picos (Alberts et al, 2010). Para evitar interferências de amostras fluorescentes, estas são analisadas previamente ao início do experimento propriamente dito. Assim, verificou-se que tanto a fração F2 quanto as células tumorais não tratadas não possuíam auto-fluorescência.
4.3.2.7 Avaliação de Atividade (Anti)Estrogênica - Modelo E-Screen
Avaliou-se a habilidade do extrato e das frações F2 e F3 de M. aquatica em inibir ou mimetizar a ação do estrógeno. Para isso, células MCF7 (adenocarcinoma mamário que expressa ER; d.i.: 1x104 células/ml) foram dispostas em placas de 12 compartimentos com
meio completo. Após 24 h de incubação, o meio foi cuidadosamente aspirado, os compartimentos foram lavados, delicadamente, com PBS pH 7,0 (1 ml/compartimento), aspirados e substituídos por meio RPMI 1640 sem vermelho fenol, acrescido de 5% de SFB tratado com Dextran e carvão ativo (Hyclone Sigma®) e 1% de penicilina/estreptomicina (1
ml/compartimento), baseado no protocolo descrito por Payne et al. (2000). Esses cuidados visam minimizar a presença de interferentes uma vez que o vermelho-fenol, por causa de sua estrutura química, possui efeito estrogênico, enquanto o soro fetal bovino não tratado possui hormônios esteroidais como estrógeno, progesterona e testosterona.
Após 72 h de incubação, as células foram tratadas (1 ml/compartimento, em duplicata) com EET de M. aquatica (125 μg/ml) e frações F2 (0,25 μg/ml) e F3 (1 μg/ml) na presença e ausência de 17-β-Estradiol (Estradiol, 10-9 M). Tamoxifeno, na concentração final
de 10 μg/ml, foi utilizado como controle positivo (ação anti-estrogênica) e células não tratadas foram consideradas como o controle negativo. Após incubação em estufa a 37oC por
144 horas, as células foram avaliadas pelo método da sulforrodamina B conforme descrito no item 4.3.2.3.
Neste protocolo, além da fração F2, também foram avaliadas o extrato etanólico total (EET) e a fração F3.
4.4 Avaliação Farmacológica in vivo
4.4.1 Animais de Laboratório
Para período de aclimatação no biotério do CPQBA, os camundongos das linhagens Balb/c e Swiss fêmeas, com dois meses de idade, obtidas do Centro Multidisciplinar para Investigação Biológica na Área da Ciência em Animais de Laboratório (CEMIB/UNICAMP), foram acondicionados no biotério da Divisão de Farmacologia e Toxicologia do CPQBA/UNICAMP, com temperatura de 22ºC ± 2ºC, ciclo claro:escuro 12h:12h e com água e ração ad libitum, por período mínimo de 7 dias, antes da realização dos experimentos. Os cuidados dos animais e os protocolos de pesquisas estão de acordo com os princípios e diretrizes adotadas pelo Colégio Brasileiro de Experimentação Animal (COBEA), pela European Union Regarding Animal Experimentation (Directive of the European Counsel
