Para período de aclimatação no biotério do CPQBA, os camundongos das linhagens Balb/c e Swiss fêmeas, com dois meses de idade, obtidas do Centro Multidisciplinar para Investigação Biológica na Área da Ciência em Animais de Laboratório (CEMIB/UNICAMP), foram acondicionados no biotério da Divisão de Farmacologia e Toxicologia do CPQBA/UNICAMP, com temperatura de 22ºC ± 2ºC, ciclo claro:escuro 12h:12h e com água e ração ad libitum, por período mínimo de 7 dias, antes da realização dos experimentos. Os cuidados dos animais e os protocolos de pesquisas estão de acordo com os princípios e diretrizes adotadas pelo Colégio Brasileiro de Experimentação Animal (COBEA), pela European Union Regarding Animal Experimentation (Directive of the European Counsel
86/609/EC) e sob a orientação da médica veterinária Karin Maia Monteiro (CRMV–SP 19683).
Os procedimentos experimentais foram aprovados pela Comissão de Ética no Uso de Animais do Instituto de Biologia da Universidade Estadual de Campinas (CEUA), sob a numeração: 4617-1/2017 (Anexo 2). Os animais foram submetidos a jejum de 8h com água ad libitum para a realização dos testes e após a realização dos mesmos, os animais foram anestesiados e sacrificados por aprofundamento da anestesia com quetamina/ xilasina 300/ 30 mg/kg, seguido de deslocamento cervical.
4.4.2 Preparo da Amostra
A fração F2 previamente pesada foi diluída com o auxílio de 2 gotas de Tween 80 (Polissorbato 80) e solução de PBS (tampão fosfato 0,2 M em solução NaCl 0,9%), com consequentes diluições com PBS para alcançar as doses que foram utilizadas em cada modelo experimental. O grupo controle negativo (veículo), de todos os experimentos, foi tratado com a solução de PBS 10 ml/kg, acrescida de 2 gotas de Tween 80.
4.4.3 Avaliação da Toxicidade Oral Aguda
Este experimento teve por objetivo determinar qual a maior dose tolerada (MDT) pelos animais. Camundongos Swiss fêmeas (8 semanas, n = 5 animais/grupo) foram usadas para o teste, por serem um pouco mais sensíveis a substâncias tóxicas do que os machos (OECD, 2010). O uso dos animais foi aprovado pela CEUA com protocolo nº 4617-1/ 2017 (ANEXO).
Os tratamentos por via oral (gavagem) foram realizados com doses crescentes da fração F2, fração com atividade antiproliferativa in vitro mais promissora, após os animais ficarem 8 horas em jejum, com livre acesso à água.
A dose inicial deste experimento foi obtida a partir de uma adaptação do protocolo descrito pela Organisation for Economic Co-operation and Development (OECD), guia nº. 129 (OECD, 2010) que propõe uma correlação matemática para estimar a dose máxima tolerável (DL50) em estudos de toxicidade aguda, por via oral, a partir da concentração
necessária para reduzir em 50% a viabilidade da linhagem celular 3T3 (fibroblasto não tumoral murino) ou da linhagem NHK (queratinócito humano não transformado, normal). Considerando as condições laboratoriais de nosso grupo de pesquisa, optou-se pela adaptação da correlação proposta pelo guia 129, empregando-se os dados de inibição de 50% da
proliferação (GI50) da linhagem HaCat, que são queratinócitos imortalizados humanos para
estimar a DL50.
Assim, segundo a OECD nº. 219, tem-se que log DL50 = 0,372 x log IC50 + 2,024,
onde DL50 é dado em mg/kg e IC50 é dado em μg/ml. No presente estudo, utilizando-se o
valor obtido de GI50 (0,25 µg/ml) para a linhagem HaCaT (queratinócito não tumoral
humano) foi possível estimar em 50 mg/kg a DL50 da fração F2 por via oral (gavagem). A
partir dessa dose, foram propostas outras duas correspondentes à metade (25 mg/kg) e à quarta parte (12,5 mg/kg) da dose inicial, 1 grupo controle foi composto por animais tratados apenas com o veículo.
Imediatamente após a administração da maior dose de F2 em 2 animais, eles foram colocados em uma caixa quadrada (60 cm de diâmetro) com fundo branco, duas laterais em acrílico transparente e duas brancas. Os animais foram observados por 30 minutos e, não ocorrendo óbito, a maior dose de F2 foi administrada para o restante do grupo, totalizando 5 animais. Todos os animais do grupo foram então observados ininterruptamente por 4 h quanto a parâmetros indicativos de toxicidade geral, tais como locomoção, comportamento (agitação, atividade reduzida, sonolência), respiração, salivação, lacrimejamento, cianose de extremidades e mortalidade (OECD, 2008). Esse procedimento foi repetido para as avaliações das doses de 25 e 12,5 mg/kg de F2 e do veículo. Ao final desse período inicial de observação, todos os animais foram acomodados em gaiolas com maravalha, com livre acesso a ração e água, e observados diariamente durante 15 dias (OECD, 2010). Durante o experimento avaliou-se também a evolução do peso corporal com pesagem nos dias 0, 3º, 7º, 10º e 15º dias. No décimo quinto dia, após a pesagem, os animais foram eutanasiados por aprofundamento de anestesia (quetamina/xilasina), seguido de deslocamento cervical e realizou-se uma análise macroscópica dos órgãos internos. Foram retirados para pesagem e cálculo do peso relativo os órgãos fígado, baço, rins, coração, útero e ovários.
4.4.4 Avaliação de Atividade Anticâncer – Modelo de Tumor Sólido de Ehrlich
Este experimento foi realizado com base no protocolo descrito por Iwamoto et al. (2015). As células de Ehrlich foram descongeladas, ressuspendidas em tampão fosfato (PBS) e centrifugadas por 5 minutos a 2500 rpm, 4º C. O sobrenadante foi descartado e o pellet celular ressuspendido em PBS em volume suficiente para preparar uma suspensão celular na densidade de 5x106 células/animal/100 μl. Dois animais (camundongos Balb/c fêmeas, 6
semanas) receberam esta suspensão celular via i.p. (doadores) e após sete dias foram eutanasiados por aprofundamento de anestesia seguido de deslocamento cervical. O líquido
ascítico foi coletado, diluído em PBS (1:10) e novamente inoculado (i.p.) em dois animais. Este procedimento foi repetido mais uma vez para ativação da linhagem celular e na semana anterior ao experimento, três animais doadores foram preparados.
No início do experimento, realizou-se a coleta do líquido ascítico dos animais doadores com auxílio de PBS (volume final aproximado de 10 ml). Após contagem das células em câmara de Neubauer com auxílio de azul de tripan, a suspensão celular foi ajustada para 2,5x106 células/30 μL/animal) e inoculada no flanco de camundongos Balb-C fêmeas (n
= 10 animais/grupo, 8 semanas). No terceiro dia após o inóculo das células, os animais foram separados aleatoriamente em cinco grupos experimentais que foram tratados a cada três dias com veículo (grupo I, controle negativo, 10 ml/kg, v.o.), doxorrubicina (grupo II, controle positivo, 3 mg/kg, via i.p.), 1 grupo satélite (grupo III) ou a fração F2 (grupos IV-VI, 7,5; 15 e 30 mg/kg, v.o.) (Figura 5).
Assim a maior dose testada nesse experimento, correspondeu a 60% da dose máxima tolerável que foi estipulada conforme guia da OECD (2010).
Durante todo o experimento os animais foram avaliados clinicamente quanto a locomoção, comportamento, respiração, cianose de extremidades e aspecto dos pelos. A evolução do peso de cada animal foi acompanhada por pesagens nos dias 1º, 5º, 8º e 11º do experimento. No décimo segundo dia do experimento, os animais foram eutanasiados por aprofundamento de anestesia com quetamina/ xilasina 300/ 30 mg/kg, seguido de deslocamento cervical para retirada do tumor e avaliação macroscópica de órgãos internos. Os tumores, fígado, rins, coração, pulmão, útero e ovários foram retirados e pesados para cálculo do peso relativo dos mesmos.
Figura 5 - Desenho experimental do teste de tumor sólido de Ehrlich
Fonte: A autora
4.4.5 Avaliação de Atividade Anti-inflamatória – Modelo de Edema de Pata
Induzido por Carragenina
Os experimentos foram conduzidos de acordo com Posadas e colaboradores (2004), com algumas modificações. Os animais foram submetidos a jejum de 8 h e após o
volume basal da pata traseira direita de camundongos Balb/C fêmeas (n = 10/grupo, 8 semanas) ter sido avaliado em aparelho de hidropletismômetro (Ugo Basile®), os grupos
foram divididos aleatoriamente e tratados por via oral (v.o.), com veículo (controle negativo, 10 ml/kg), dexametasona (controle positivo, 25 mg/kg) e a fração F2, em três doses (50, 25 e 12,5 mg/kg). Após 60 min, a inflamação foi induzida pela injeção de 30 μL de carragenina 3% (Sigma-Aldrich®) no coxim plantar da pata traseira direita. A seguir, o edema produzido pela carragenina foi avaliado após 1, 2, 4, 6, 24, 48 e 72 horas da injeção da carragenina. O volume do edema, em cada tempo de avaliação, foi determinado como a diferença entre os volumes da pata traseira direita nos tempos experimental e basal. Para o cálculo de redução do volume do edema, expresso em porcentagem, utilizou-se a seguinte fórmula:
[(Vedemaveiculo – Vedema grupo)/ Vedema veiculo x 100] = Redução de edema (%)