4.11.1 Avaliação do Índice de Atividade da Doença
A evolução do processo inflamatório intestinal foi realizada por determinação do índice de atividade da doença (IAD), adaptado de Cooper et al. (1993). O IAD é o somatório de pontuações referentes à perda de peso corporal, consistência fecal e sangramento nas fezes. Durante o protocolo experimental da colite induzida pelo DNBS, os animais foram
examinados diariamente em relação ao índice de atividade da doença. Os escores estão descritos no Quadro 2.
Quadro 2.Índice de Atividade da Doença (IAD)
Escore Perda de peso corporal (%) Diarreia Sangue nas fezes*
0 0 Normal -
1 1-5 +
2 6-10 Fezes brandas ++
3 11-20 +++
4 > 20 Diarreia ++++
* Presença de sangue na região perianal ou sangue oculto nas fezes. Fonte: COOPPER et al. (1993).
4.11.2 Avaliação da Relação Peso/Comprimento Colônicos
Seguimentos colônicos foram extraídos em sua totalidade, lavados com solução fisiológica para retirada de sangue e material fecal; colocados sobre uma placa de Petri com gelo para a remoção das aderências mesentéricas e gordura visceral. Posteriormente, o peso e o comprimento colônicos foram verificados para determinação da relação peso/comprimento colônico. Em seguida, amostras do tecido colônico foram separadas longitudinalmente e congeladas a -20 ºC para a determinação de parâmetros bioquímicos, do estresse oxidativo, de marcadores do processo inflamatório intestinal, assim como de marcadores anti-inflamatórios e de proteção do eptélio intestinal.
4.11.3 Avaliação do Índice do Dano Macroscópico
Após os cólons terem sido abertos longitudinalmente, o índice de dano macroscópico (IDM) foi avaliado de acordo com Bell et al. (1995), com valores que variam a de 0-10 (Quadro 3), quanto à presença de ulceração, pontos de inflamação e zonas de dano tissular.
Quadro 3.Critérios de avaliação da gravidade do Dano Macroscópico Intestinal
Escore Critério
0 Cólon normal (sem dano)
2 Ulceração sem hiperemia nem engrossamento da parede
3 Ulceração com ponto de inflamação
4 Dois sítios ou mais de ulceração e/ou inflamação
5 Zonas grandes de inflamação e ulceração com uma extensão maior que 1 cm 6-10 Zonas grande de dano tissular com uma extensão maior que 2 cm, adicionando-se
1 cm (até 10) ponto a cada 1 cm adicional de extensão Fonte: BELL et al. (1995).
4.11.4 Determinação da Atividade da Enzima Mieloperoxidase
O ensaio da atividade da mieloperoxidase (MPO), um marcador sensível da inflamação, foi realizado utilizando o método descrito por Krawisz et al. (1984). As amostras dos cólons foram homogeneizadas (homogeneizador Marconi MA1102, SP, Brasil) em tampão de brometo de hexadeciltrimetilamônio (HTAB) a 0,5% e pH=6,0 na proporção de 1:20 m/v. Em seguida, foram sonicadas em lavadora ultrassônica por 5 min (Schuster L200, RS, Brasil) e submetidas a um triplo processo de congelamento/descongelamento para liberação da enzima MPO pelos grânulos azurófilos dos neutrófilos. Em seguida, os homogenatos foram centrifugadas (Novatécnica NT 805, SP, Brasil) a 8.285 rpm a 4 ºC durante 10 min e ao sobrenadante foi adicionado 150 μL do reativo cromogêno, composto pela dihidrocloreto de o-dianisidina, tampão fosfato potássico e peróxido de hidrogênio a 0,05% (Figura 10). A leitura foi realizada por meio de cinética de dois pontos, tempo 0-2 min a 450 nm em leito de microplacas (Mindray MR-96, SP, Brasil). Os resultados foram calculados por meio de curva padrão de neutrófilos humanos e expressos em U/g de tecido, considerando-se que uma unidade de MPO seja capaz de degradar 1 mmol de peróxido de hidrogênio/min a 25 ºC. Todos os reagentes foram adquiridos da Sigma-Aldrich, Darmstadt, Germany.
4.11.5 Determinação do Conteúdo Total de Glutationa
A determinação do conteúdo total de glutationa (GSSH+GSH), a qual é uma estimativa indireta do dano oxidativo produzido por um processo inflamatório foi determinada pelo método descrito por Anderson (1985). As amostras dos cólons foram homogeneizadas (Marconi MA1102, SP, Brasil) na proporção de 1:20 m/v em tampão de ácido tricloroacético (TCA) a 5% em água destilada. Os homogenatos foram centrifugados a 10.000 rpm por 15 min a 4ºC (Novatécnica NT 805, SP, Brasil). Aos sobrenadantes foram adicionados 15 μl de PBS-EDTA, 20 μl de ácido ditiobisnitrobenzóico (DTNB) e mantidos em banho-maria por 30 min, com o intuito de promover a formação da glutationa oxidada (GSSH). Em seguida foi adicionado 15 μl de gluationa redutase, completando assim o ciclo de oxidação-redução e transformando a gluationa oxidada em reduzida (Figura 11). A leitura do conteúdo total de glutationa foi realizada no leitor de microplacas (Mindray MR-96, SP, Brasil) a 412 nm; o cálculo das concentrações foi realizado através de curva padrão de glutationa reduzida e os resultados expressos como nmol/g de tecido. Todos os reagentes foram adquiridos da Sigma- Aldrich, Darmstadt, Germany.
Figura 10.Reação coloriméttrica da dianisidina oxidada a partir atividade da mieloperoxidase.
4.11.6 Determinação dos Níveis de Malondialdeído
A análise dos níveis de malondialdeído (MDA), que constitui um produto final da peroxidação lipídica e um importante marcador de estresse oxidativo, foi realizado pelo método descrito por Esterbauer; Cheeseman (1990)- Figura 12. As amostras dos cólons foram homogeneizadas (homogeneizador Marconi MA1102, SP, Brasil) na proporção de 1:5 m/v em tampão Tris HCl (pH = 7,4). O homogenato foi centrifugado a 4950 rpm por 10 minutos a 4 ºC (Novatécnica NT 805, SP, Brasil). Foram retirados 300 μL do sobredante e adicionado em novos eppendofs, acrescentando-o 750 μL do reativo cromogêno (1-metil-2-fenilindol 10,3 M em acetonitrila 3:1) e 225 μL de ácido clorídrico a 37 % e incubados por 40 min a 45 ºC. A determinação dos níveis de MDA foi realizada pela leitura das absorbâncias das amostras em leitor de microplacas (Mindray MR-96, SP, Brasil) a 492 nm e os dados foram expressos em nmol/g de tecido; o cálculo das concentrações foi realizado através de curva padrão com o 1,1,3,3–tetraetoxipropano (10 mM). Todos os reagentes foram adquiridos da Sigma-Aldrich, Darmstadt, Germany.
Figura 11.Reação coloriméttrica da redução enzimática da GSSG e determinação do conteúdo total de glutationa.
4.11.7 Dosagem de Citocinas
Os níveis de citocinas no tecido do colônico foram avaliados usando os protocolos dos kits (Sigma-Aldrich, São Paulo, Brasil) para as citocinas IL-1β, TNF-α, e IL-10. As amostras do tecido colônico foram pesados, homogeneizados (homogeneizador Marconi MA1102, SP, Brasil) com tampão fosfato potássico (10 mM, pH 7,2-7,4) e centrifugados a 3500 rpm a 4 ºC durante 10 min (Novatécnica NT 805, SP, Brasil), de modo que o sobrenadante da centrifugação foi utilizado para determinar as citocinas a uma absorbância de 450 nm (expressas em ng/g), em leitor de ELISA (Mindray MR-96, SP, Brasil).