MINISTÉRIO DA EDUCAÇÃO
UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE CENTRO DE CIÊNCIAS DA SÁUDE
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS
VALÉRIA COSTA DA SILVA
Avaliação de Toxicidade e da Atividade Anti-inflamatória Intestinal do Extrato Aquoso das Folhas de Ipomoea asarifolia (Desc.) Roem. & Schult.
NATAL/RN 2020
VALÉRIA COSTA DA SILVA
Avaliação de Toxicidade e da Atividade Anti-inflamatória Intestinal do Extrato Aquoso das Folhas de Ipomoea asarifolia (Desc.) Roem. & Schult.
Dissertação de mestrado apresentada à Coordenação do Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas, da Universidade Federal do Rio Grande do Norte, como requisito à obtenção do título de Mestre em Ciências Farmacêuticas.
Orientadora: Gerlane Coelho Bernardo Guerra Coorientadora: Aurigena Antunes de Araújo
NATAL/RN 2020
Silva, Valéria Costa da.
Avaliação de toxicidade e da atividade anti-inflamatória intestinal do extrato aquoso das folhas de Ipomoea asarifolia (Desc.) Roem. & Schult / Valéria Costa da Silva. - 2020. 107f.: il.
Dissertação (Mestrado em Ciências Farmacêuticas)
-Universidade Federal do Rio Grande do Norte, Centro de Ciências da Saúde, Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas. Natal, RN, 2020.
Orientadora: Gerlane Coelho Bernardo Guerra. Coorientadora: Aurigena Antunes de Araújo.
1. Ipomoea asarifolia (Salsa) Dissertação. 2. Flavonoides Dissertação. 3. Toxicidade Dissertação. 4. Colite
-Dissertação. 5. DNBS - -Dissertação. I. Guerra, Gerlane Coelho Bernardo. II. Araújo, Aurigena Antunes de. III. Título. RN/UF/BS-CCS CDU 635.781
Valéria Costa da Silva
Avaliação de Toxicidade e da Atividade Anti-inflamatória Intestinal do Extrato Aquoso das Folhas de Ipomoea asarifolia (Desc.) Roem. & Schult.
Banca Examinadora:
___________________________________________ Profa. Dra. Gerlane Coelho Bernardo Guerra
Presidente – UFRN
___________________________________________ Profa. Dra. Aurigena Antunes de Araújo Coorientador – UFRN
__________________________________________ Profa. Dra. Rita de Cássia Ramos do Egypto Queiroga Examinador Externo – UFPB
____________________________________________ Prof. Dr. Edilson Dantas da Silva Júnior Examinador Interno – UFRN
Natal, 6 de abril de 2020
NATAL/RN 2020
AGRADECIMENTOS
Agradeço primeiramente a Deus, por tudo que tem feito por mim! Por me dá esperanças em dias melhores e forças a galgar cada obstáculo.
Agradeço em especial a minha orientadora, Profa. Gerlane, por acreditar neste trabalho e em mim. Por ser um exemplo de profissional e pessoa. Agradeço pela paciência, ensinamentos, compreensão e atenção que tem me dado!
Agradeço aos meus pais (Maria e Francisco) e a meus irmãos (Joaci e Laudicéia) pelo apoio e por acreditarem em cada projeto, por lutarem juntamente comigo!
Ao meu amigo de longa data e noivo, Jônatas, pelo apoio sempre! Por acreditar nos meus sonhos e sonhar juntamente comigo! Minhas conquistas também são suas!
A Profa. Daline, pela paciência em realizar este trabalho comigo, pelo apoio e todo ensinamento desde a inciação científica!
A Profa. Aurigena pela coorientação neste trabalho e todo apoio. Pelo seu entusiasmo e dedicação à nossa base de pesquisa!
Agradeço também a todos os profissionais da base de pesquisa em farmacologia, Neida da Mata, Flávio Maurício e César, pelo envolvimento, ensinamentos e participação nos trabalhos desenvolvidos pelo nosso grupo de pesquisa.
Aos meus amigos do grupo de pesquisa, Anderson Wilbur, Edilane Araújo, Emmanuella Moura, Emmanuella Aragão, Nadja Maria, Marília Virgo, Júlia e Milza pelo apoio e trabalhos que desenvolvemos juntos!
Aos meus amigos da pós-graduação e parceiros de luta, Luana, Renato e Paulo, pelo apoio durante as disciplinas e descontração!
As minhas amigas de gradução, Ana Luiza e Ana Francielle pelo apoio, torcida e alegria por cada conquista!
Agradeço ao Prof. Matheus Pedrosa e a Profa. Silvana Zucolotto pelo apoio e parceria para a realização deste trabalho!
Agradeço também aos professores Rita de Cássia, Leônia Maria, Edilson Silva e Marcelo Silva pelo aceite ao convite para avaliação deste trabalho!
Agradeço a minha querida UFRN e ao programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas por minha formação! E a CAPES pelo financiamento deste trabalho!
RESUMO
Ipomoea asarifolia (Desc.) Roem. & Schult., popularmente conhecida como “salsa” ou “salsa
brava”, pertence à família Convolvulaceae. Estudos anteriores com o extrato de I. asarifolia e de seus compostos majoritários, ácido clorogênico, ácido cafeíco e rutina, revelaram excelente atividade anti-inflamatória. Dessa forma, o objetivo deste trabalho foi avaliar possíveis efeitos tóxicos do extrato aquoso das folhas de I. asarifolia (IA), por meio dos ensaios de toxicidade aguda e subcrônica, bem como avaliar o efeito preventivo do extrato frente à inflamação intestinal induzida pelo ácido 2,4-dinitrobenzeno sulfônico (DNBS). Nos ensaios de toxicidade aguda e subcrônica foram realizadas administrações em dose única (2000 mg/kg) e doses seriadas por 28 dias (50, 100 e 200 mg/kg) de IA, respectivamente; no ensaio de colite aguda, ratas pré-tratadas com extrato IA (25, 50 e 100 mg/kg) ou sulfassalazina 250 mg/kg receberam instilação intracolônica de DNBS em etanol a 50% (v/v) para avaliação do efeito preventivo de IA. A análise hematológica, hepática, renal e de avaliação do sistema nervoso central nos ensaios de toxicidade, não revelaram efeitos tóxicos. Enquanto que no modelo de colite, IA apresentou efeito protetor frente à inflamação intestinal induzida pelo DNBS, com melhora no índice de atividade da doença, no dano macroscópico intestinal e na relação peso/comprimento colônico. O pré-tratamento com o extrato promoveu downregulation de importantes moléculas envolvidas em vias de sinalização da inflamação intestinal como JNK1, NF-κB-p65 e STAT3, enquanto que SOCS1 teve upregulation. Consequentemente, IA promoveu downregulation de IL-17 e iNOS e redução nos níveis de IL-1β e TNF-α, marcadores pró-inflamatórios. Por outro lado, aumentou significativamente IL-10, uma importante citocina anti-inflamatória. O efeito anti-inflamatório de IA também foi confirmado pela redução da atividade da MPO colônica. Em asssociação a estes resultados, houve uma melhora significativa do estresse oxidativo com redução do MDA e aumento da GSH, resultados que podem ser atribuídos ao rico conteúno de fenóis e flavonoides totais do extrato. Adicionalmente, o efeito de IA foi confirmado na avaliação histológica, demonstrando preservação da citoarquitetura colônica, o que corrobora com os dados referentes à
upregulation para MUC2, glicoproteína envolvida na integridade da barreira intestinal. Diante
dos resultados apresentados, concluímos que o extrato de I. asarifolia apresenta baixa toxicidade e atividade protetora frente a inflamação intestinal, revelando potencial para possível aplicação adjuvante no controle da DII humana.
ABSTRACT
Ipomoea asarifolia (Desc.) Roem. & Schult., Popularly known as “salsa” or “salsa brava”,
belongs to the family Convolvulaceae. Previous studies with the extract of I. asarifolia and its major compounds, chlorogenic acid, caffeic acid and rutin, have shown excellent anti-inflammatory activity. Thus, the objective of this work was to evaluate possible toxic effects of the aqueous extract of the leaves of I. asarifolia (IA), by means of acute and subchronic toxicity tests, as well as to evaluate the preventive effect of the extract in the 2,4-dinitrobenzene sulfonic acid (DNBS)-induced intestinal inflammation. In acute and subchronic toxicity tests, single dose (2000 mg/kg) and serial doses were performed for 28 days (50, 100 and 200 mg/kg) of IA, respectively; in the acute colitis assay, rats pretreated with extract IA (25, 50 and 100 mg/kg) or sulfasalazine 250 mg/kg received intracolonic instillation of DNBS in 50% (v/v) ethanol to evaluate the preventive effect of IA. The hematological, hepatic, renal and central nervous system assessment in toxicity tests did not reveal toxic effects. Whereas in the colitis model, IA showed a protective effect against intestinal inflammation induced by DNBS, with improvement in the disease activity index, in macroscopic intestinal damage and in the colonic weight/length ratio. Pretreatment with the extract promoted downregulation of important molecules involved in intestinal inflammation signaling pathways such as JNK1, NF-κB-p65 and STAT3, while SOCS1 had upregulation. Consequently, IA promoted downregulation of IL-17 and iNOS and reduced levels of IL-1β and TNF-α, pro-inflammatory markers. On the other hand, it significantly increased IL-10, an important anti-inflammatory cytokine. The anti-inflammatory effect of IA was also confirmed by the reduction in colonic MPO activity. In association with these results, there was a significant improvement in oxidative stress with reduced MDA and increased GSH, results that can be attributed to the rich content of phenols and total flavonoids in the extract. Additionally, the IA effect was confirmed in the histological evaluation, demonstrating preservation of the colonic cytoarchitecture, which corroborates with the data referring to upregulation for MUC2, a glycoprotein involved in the integrity of the intestinal barrier. In view of the results presented, conclude that the extract of I. asarifolia has low toxicity and protective activity against intestinal inflammation, revealing the potential for possible adjuvant application in the control of human IBD.
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Figura 1. Ipomoea asarifolia e descrição de grupo, família, gênero e espécie. ... 21 Figura 2. Distribuição geográfica da espécie Ipomoea asarifolia no Brasil ... 21 Figura 3. Cromatograma representativo dos compostos majoritários do extrato aquoso das
folhas de Ipomoea asarifolia por HPLC-DAD (A); ácido clorogênico (B); ácido cafeico (C); rutina (D). ... 22
Figura 4. Prevalência da Doença Inflamatória Intestinal. ... 26 Figura 5. Sinergismo da ação de receptores TLRs e NLRs, mostrando o reconhecimento e
resposta a PAMPs e endossomos. ... 31
Figura 6. Sinalização do NF-κB na inflamação e pontos de controle. ... 32 Figura 7. Efeito de agentes haptenos na ativação imune, estresse oxidativo e dano a
barreira intestinal. ... 37
Figura 8. Representação dos ensaios e análises realizadas com o extrato de I. asarifolia. ... 38 Figura 9. Modelo experimental de inflamação intestinal utilizado. ... 42 Figura 10. Reação coloriméttrica da dianisidina oxidada a partir atividade da
mieloperoxidase. ... 45
Figura 11. Reação coloriméttrica da redução enzimática da GSSG e determinação do
conteúdo total de glutationa. ... 46
Figura 12. Reação coloriméttrica a partir da formação do produto final: carbocianina, na
presença de malondialdeído e duas moléculas de 1-metil-2-fenilindol. ... 47
Figura 13. Efeito da dose de 2000 mg/kg do extrato aquoso de I. asarifolia (IA) na
variação do peso corporal em camungongos fêmeas no ensaio de toxicidade aguda. ... 52
Figura 14. Efeito das doses de 50, 100, e 200 mg/kg do extrato aquoso de I. asarifolia
(IA) na variação do peso corporal em camungongos fêmeas (A) e machos (B) no ensaio de toxicidade subcrônica. ... 52
Figura 15. Efeito da dose de 2000 mg/kg do extrato aquoso de I. asarifolia (IA) na
atividade motora pelo campo aberto na avaliação da frequência de levantaments e no número de pulos em camundongos fêmeas na toxicida guda. ... 58
Figura 16. Efeito das doses de 50, 100, e 200 mg/kg do extrato aquoso de I. asarifolia
(IA) na atividade motora pelo campo aberto na avaliação da frequência de levantaments e no número de pulos em camundongos fêmeas e machos na toxicidade subcrônica. ... 59
Figura 17. Efeito da dose de 2000 mg/kg do extrato aquoso de I. asarifolia (IA) na
atividade motora forçada pelo Rotarod em camundongos fêmeas na toxicidade aguda. ... 60
Figura 18. Efeito das doses de 50, 100, e 200 mg/kg do extrato aquoso de I. asarifolia
(IA) na atividade motora forçada pelo Rotarod em camundongos fêmeas e machos na toxicidade subcrônica.. ... 60
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Teor de compostos fenólicos e flavonoides totais no extrato aquoso de Ipomoea asarifolia ... 51
Tabela 2. Efeito do extrato aquoso de Ipomoea asarifolia (IA) na dose de 2000 mg/kg no
peso relativo dos órgãos: rins, fígado, baço coração, pulmão, cérebro e cerebelo no ensaio de toxicidade aguda em camundongos ... 53
Tabela 3. Efeito do extrato aquoso de Ipomoea asarifolia (IA) nas doses de 50, 100 e 200
mg/kg no peso relativo dos órgãos; rins, fígado, baço coração, pulmão, cérebro e cerebelo no ensaio de toxicidade subcrônica em camundongos ... 53
Tabela 4. Efeito do extrato aquoso de Ipomoea asarifolia (IA) na dose de 2000 mg/kg nos
parâmetros hematológicos no ensaio de toxicidade aguda em camundongos ... 54
Tabela 5. Efeito do extrato aquoso de Ipomoea asarifolia (IA) nas doses de 50, 100 e 200
mg/kg nos parâmetros hematológicos no ensaio de toxicidade subcrônica em camundongos ... 55
Tabela 6. Efeito do extrato aquoso de Ipomoea asarifolia (IA) na dose de 2000 mg/kg nos
parâmetros bioquímicos no ensaio de toxicidade aguda em camundongos ... 56
Tabela 7. Efeito do extrato aquoso de Ipomoea asarifolia (IA) nas doses de 50, 100 e 200
LISTA DE QUADROS
Quadro 1. Principais estudos que avaliaram atividade biológica e toxicidade
experiemental de I. asarifolia ... 23
Quadro 2. Índice de Atividade da Doença (IAD) ... 43 Quadro 3. Critérios de avaliação da gravidade do Dano Macroscópico Intestinal ... 44 Quadro 4. Sequências de primers utilizados na análise de expressão gênica pelo método
de PCR em tempo real quantitativo (RT-qPCR) ... 48
Quadro 5. Critérios de avaliação do escore macroscópico intestinal ... 49 Quadro 6. Critérios de avaliação do escore de marcação celular na imuno-histoquímica ... 50
LISTA DE ABREVIATURAS
ALT Alanina aminotrasferase AST Aspartato aminotrasferase CDs Células dendríticas
DII Doença inflamatória intestinal DMSO Dimetilsulfóxido
DNBS Ácido 2,4-dinitrobenzeno sulfônico DSS Dextran sulfato de sódio
EDTA Ácido etilenodiamino
ERO Espécies reativas do oxigênio GR Glutationa redutase
GSH Gluationa reduzida GSSH Gluationa oxidada
IA Extrato aquoso de Ipomoea asarifolia IAD Índice de atividade da doença
IDM Índice do dano macroscópico IL-10 Interleucina 10
IL-17 Interleucina 17 IL-1β Interleucina 1 beta
iNOS Óxido nítrico sintase induzível i.p. Intraperitoneal
JNK1 Quinases c-jun N-terminal LPS lipopolissacarídeo
MDA Malondialdeído MPO Mieloperoxidase
MUC2 Mucina 2
NF-κB Fator nuclear kappa B NLRs NOD-like receptors
NOD2 Domínio de oligomerização vinculado a nucleotídeos 2 OECD Organização para Cooperação e Desenvolvimento Econômico PAMPs Padrões relacionados aos patógenos
SOCS1 Supressor de sinalização de citocinas SSZ Sulfassalazina
STAT3 Ativador de transcrição 3 TLRs Toll-like receptors
TNF-α Fator de necrose tumoral alfa Tregs Células T reguladoras
v.o. Via oral v.r. Via retal
LISTA DE SÍMBOLOS % percentagem fL fentolitro G força gravitacional g grama g/dL grama/decilitro h horas kg kilograma m/v massa/volume mg miligrama min minutos mL mililitro mM micromolar mm milímetros ng/g nanograma/grama ng/mL nanograma/mililitro nm nanometro nmol/g nanomol/grama ºC grau Celsius OD densidade óptica pg picograma pH potencial hidrogeniônico rpm rotação por minuto U/g unidade/grama
v/v volume/volume
μL microlitro
SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO ... 18 2 OBJETIVOS ... 20 2.1OBJETIVOGERAL ... 20 2.2 OBJETIVOSESPECÍFICOS ... 20 3 REFERENCIAL TEÓRICO ... 21 3.1IPOMOEA ASARIFOLIA ... 21
3.2 ENSAIOSDETOXICIDADEAGUDAESUBCRÔNICA ... 24
3.3 DOENÇAINFLAMATÓRIAINTESTINAL ... 25
3.3.1 Anatomia e Histologia Normal do Cólon ... 25
3.4 PREVALÊNCIADADII ... 26
3.5 PATOGÊNESEDADOENÇAINFLAMATÓRIAINTESTINAL ... 27
3.5.1 Epitélio Intestinal e Ativação Celular ... 27
3.5.2 Fatores Genéticos ... 28
3.5.3 Principais Fatores Ambientais ... 28
3.5.4 Respostas Imunes da Mucosa ... 29
3.5.5 O Papel dos Receptores de Reconhecimento de Padrões na Inflamação Intestinal ... 30 3.5.5.1 Ativação da via do NF-κB ... 31 3.6 TRATAMENTOFARMACOLÓGICO ... 32 3.6.1 Aminossalicilatos ... 33 3.6.2 Corticosteróides ... 34 3.6.3 Imunomoduladores ... 34 3.6.4 Agentes Biológicos ... 34
3.7 MODELOSANIMAISDEINFLAMAÇÃOINTESTINAL ... 35
3.7.1 Colite Induzida Quimicamente por Via Retal ... 35
2.2.1 Colite Induzida Quimicamente por Via Oral ... 36
2.2.2 Outras Formas de Indução de Colite ... 37
4 MATERIAL E MÉTODOS ... 38
4.2 DETERMINAÇÃODOTEORDEFENÓLICOSEFLAVONOIDES
TOTAISDOEXTRATOAQUOSODASFOLHASDEIPOMOEA ASARIFOLIA .. 39
4.3 ANIMAIS:TOXICIDADEAGUDAESUBCRÔNICA ... 39
4.4 AVALIAÇÃODETOXICIDADEORALAGUDAESUBCRÔNICAEM CAMUNDONGOS ... 40
4.5 AVALIAÇÃODAATIVIDADEMOTORAPELOTESTEDECAMPO ABERTO ... 40
4.6 AVALIAÇÃODAATIVIDADEMOTORAPELOROTAROD ... 40
4.7 ANÁLISEHEMATOLÓGICAEBIOQUÍMICA ... 41
4.8 ANIMAIS:INFLAMAÇÃOINTESTINAL ... 41
4.9 MODELOEXPERIMENTAL:COLITEINDUZIDAPORDNBS ... 41
4.10 COLITEINDUZIDAPORDNBS ... 42
4.11 AVALIAÇÃODAINFLAMAÇÃOINTESTINAL ... 42
4.11.1 Avaliação do Índice de Atividade da Doença ... 42
4.11.2 Avaliação da Relação Peso/Comprimento Colônicos ... 43
4.11.3 Avaliação do Índice do Dano Macroscópico ... 43
4.11.4 Determinação da Atividade da Enzima Mieloperoxidase ... 44
4.11.5 Determinação do Conteúdo Total de Glutationa ... 45
4.11.6 Determinação dos Níveis de Malondialdeído ... 46
4.11.7 Dosagem de Citocinas ... 47
4.12 ANÁLISEDAEXPRESSÃOGÊNICA ... 47
4.13 ANÁLISEHISTOPATOLÓGICA ... 48
4.14 ANÁLISEIMUNO-HISTOQUÍMICA ... 49
4.15 ANÁLISEESTATÍSTICA ... 50
5 RESULTADOS ... 51
5.1ANÁLISEQUANTITATIVADECOMPOSTOSFENÓLICOSE FLAVONOIDES ... 51
5.2ENSAIOSDETOXICIDADE ... 51
5.2.1 Efeito do extrato aquoso de Ipomoea asarifolia na relação peso corporal e peso relativo dos órgãos nos ensaios de toxicidade aguda e subcrônica ... 51
5.2.2 Efeitos do extrato aquoso de Ipomoea asarifolia na análise hematológica nos ensaios de toxicidade aguda e subcrônica ... 54
5.2.3 Efeitos do extrato aquoso de Ipomoea asarifolia na análise bioquímica
nos ensaios de toxicidade aguda e subcrônica ... 56
5.2.4 Efeitos do extrato aquoso de Ipomoea asarifolia na atividade motora medida pelo campo aberto e Rotarod durante os ensaios de toxicidade aguda e subcrônica ... 58
5.3EFEITOSDOEXTRATOAQUOSODEIANOMODELODE INFLAMAÇÃOINTESTINAL ... 61
6 DISCUSSÃO ... 62
7 CONCLUSÃO ... 70
REFERÊNCIAS ... 71
APÊNDICE A- PROVÁVEL MECANISMO DE AÇÃO ANTI-INFLATÓRIO INTESTINAL DE IPOMOEA ASARIFOLIA. ... 85
APÊNDICE B- CERTIFICADO DE PUBLICAÇÃO E ARTIGO ... 86
ANEXO 1- CERTIFICADO CEUA/UFRN (ENSAIOS DE TOXICIDADE) ... 106
1 INTRODUÇÃO
Na atualidade, o uso de produtos vegetais no tratamento de doenças crônicas, especialmente na doença inflamatória intestinal (DII) tem sido de grande interesse, visto que pacientes com a DII estão dentre os pacientes com doenças crônicas que mais utilizam medicamentos complementares e alternativos (LANGHORST et al., 2015). Ainda segundo Langhorst et al. (2015), cerca de 21-60% destes pacientes já fez ou faz uso de terapias complementares ou alternativas, decorrente de efeitos colaterais ou uma reposta inadequada destes pacientes as terapias farmacológicas disponíveis (LICHTENSTEIN et al., 2018).
Neste sentido, um interessante ensaio clínico com produtos à base de
Commiphora mirra (resina de Commiphora molmol), extrato seco das flores de camomila e
carvão de café, registrado como medicamento tracicional (MYRRHINIL-INTEST; Repha GmbH, Hannover, Alemanha), mostra-se bem tolerado, com bom perfil de segurança e evidências de eficácia comparável à mesalazina (considerada padrão ouro no tratamento da colite ulceratica humana). Este medicamento conseguiu manter a remissão da colite ulcerativa inativa durante doze meses (LANGHORST et al., 2013). Outros estudos clínicos conduzidos com as substâncias curcumina e resveratrol também demonstraram o potencial de fenólicos na melhora do quadro clínico de pacientes com colite ulcerativa (LANGHORST et al., 2015; SAMSAMIKOR et al., 2016). Desse modo, o uso de fitoterápicos pode ser promissor na terapia adjuvante da DII.
As DIIs são transtornos inflamatórios crônicos que compreendem dois fenótipos principais, a Doença de Crohn (DC) e a Colite Ulcerativa (CU) (WIRTZ et al., 2007; ZHERNAKOVA et al., 2008), que apresentam uma resposta inflamatória inapropriada e contínua em um indivíduo geneticamente suscetível e de forma recidivante (STROBER; FUSS; MANNON, 2007). A distinção entre a CU e a DC é baseada em grade parte, na distribuição dos locais afetados e na expressão morfológica da doença nesses locais (KUMMAR et al., 2013). A CU é caracterizada por inflamação limitada ao cólon que compromete o reto e se espalha proximalmente de forma contínua, afetando eventualmente a região periapendiceal. Já a DC envolve qualquer parte do trato gastrointestinal, sendo mais comum na região íleo terminal ou na região perianal de forma não contínua, a qual é comumente associada a complicações como estenoses, abscessos e fístulas (KHOR; GARDET; XAVIER, 2011; WIRTZ et al., 2007). Histologicamente, a CU se apresenta com inflamação superficial que se limita a mucosa e submucosa, com criptite e abscessos de
criptas. Na DC, a inflamação é transmural com espessamento da submucosa, apresentando ulcerações fissurantes e granulomas não caseosos (KHOR; GARDET; XAVIER, 2011).
A farmacoterapia da DII baseia-se em medicamentos derivados dos aminossalicilatos, corticorteroides, imunomoduladores e agentes biológicos, os quais apresentam sérios efeitos adversos (BIANCONE et al., 2017). Dessa forma, há uma procura constante por novos medicamentosos com eficácia e com menos efeitos adversos, apresentados pelos tratamentos convencionais.
Na medicina popular, a decocção das folhas de I. asarifolia é utilizada em diversas enfermidades como dermatites, escabiose, sífilis, úlceras de pele e feridas externas (DE ALBUQUERQUE et al., 2007). Lawal et al. (2010) demostraram que o extrato aquoso das folhas da planta reduziu o edema produzido pela carragenina, administrada em patas de roedores. Atividade antiedamotogênica e anti-inflamatória também foram observadas em estudos posteriores com o extrato aquoso das folhas de I. asarifolia.
Lima et al. (2014) demostraram que tanto o extrato aquoso quanto a rutina, um dos compostos majoritários da planta, reduziram a infiltração de leucócitos e níveis de citocinas inflamatórias em modelo de peritonite induzida por veneno de Tityus serrulatus. De forma semelhante, Furtado et al. (2016) mostraram que o tratamento com o extrato e seus compostos majoritários (rutina, ácido clorogênico e ácido cafeico) conseguiram mitigar a inflamação nos modelos de peritonite e bolsa de ar, por redução da migração leucocitária e dos níveis de citocinas inflamatórias. Além disso, conseguiram inibir o edema de pata induzido por xilana em até 86%.
Dessa forma, este estudo teve por objetivo avaliar a segurança do extrato aquoso das folhas de I. asarifolia (IA), por meio da análise de possíveis efeitos tóxico em ensaios de toxicidade aguda, subcrônica e atividade motora pelos testes de campo aberto e Rotarod. Além disso, avaliar do efeito preventivo do extrato em modelo de inflamação intestinal aguda induzida pelo ácido 2,4-dinitrobenzeno sulfônico (DNBS), tendo vista o potencial anti-inflamatório de I. asarifolia.
2 OBJETIVOS
2.1 OBJETIVO GERAL
Avaliar toxicidade e atividade anti-inflamatória intestinal do extrato aquoso das folhas de Ipomoea asarifolia em modelo de colite aguda induzida pelo DNBS.
2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
a) Avaliar possível efeito tóxico do extrato;
b) Verificar marcadores do processo inflamatório intestinal; c) Avaliar o estresse oxidativo;
d) Analisar a expressão de proteínas da integridade da barreira intestinal; e) Analisar o dano histológico intestinal ocasionado pelo DNBS.
3 REFERENCIAL TEÓRICO
3.1 Ipomoea asarifolia
Ipomoea asarifolia (Desc.) Roem. & Schult. (Figura 1), família das
Convolvulaceaes, planta rasteira e de fácil coleta, é conhecida popularmente por “salva ou salsa brava" no nordeste brasileiro. Cerca de 600-700 espécies da planta são encontradas em regiões tropicais e subtropicais (MEIRA et al., 2012). No Brasil, I. asarifolia tem ocorrência confirmada nas regiões geográficas do norte, nordeste, centro-oeste e sudeste (Figura 2), com predominância nos domínios fitogeográficos da Amazônia, Mata Atlântica e Caatinga (“Lista do Brasil - Ipomoea asarifolia (Desr.) Roem. & amp; Schult.”, [s.d.]). Espécies dessa planta apresentam como componentes biologicamente ativos, os alcalóides, compostos fenólicos e glicolipídeos (MEIRA et al., 2012).
Figura 1. Ipomoea asarifolia e descrição de grupo, família, gênero e espécie.
Fonte: LISTA DO BRASIL [s.d.].
• Angiosperma
Grupo
• ConvolvulaceaeFamília
• Ipomoea L.Gênero
• Ipomoea asarifolia (Desr.) Roem. & Schult.Espécie
Figura 2. Distribuição geográfica da espécie Ipomoea asarifolia no Brasil
Ocorrências confirmadas: Norte (verde): Acre, Amazonas,
Amapá, Pará, Rondônia, Roraima, Tocantins;
Nordeste (laraja): Alagoas, Bahia,
Ceará, Maranhão, Paraíba, Pernambuco, Piauí, Rio Grande do Norte, Sergipe;
Centro-Oeste (amarelo): Mato Grosso. Sudeste (Rosa): Rio de Janeiro.
SILVA et al. (2018).
A análise fitoquímica do extrato aquoso das folhas de I. asarifolia foi realizada por cromatografia em camada delgada (CCD), na qual foi detectada a presença de fenóis, taninos, alcaloides, saponinas e flavonoides (LIMA et al., 2014). Posteriormente, o mesmo extrato foi analisado por cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC-DAD), na qual foram observados 10 picos principais em UV 340 nm. Destes 10 picos, três picos foram identificados, pico 2 (tR=8.3 min), pico 4 (tR=13 min) e pico 5 (tR=24 min), como ácido clorogênico, ácido cafeico e rutina, respectivamente, e confirmados por meio de comparação do tempo de retenção com os padrões, espectros de UV e co-injeção (padrão + extrato)- Figura 3. Nesse mesmo estudo, o extrato foi analisado por cromatografia líquida de alta eficiência acoplada a espectrômetro de massas (LC-DAD-MS), na qual foi possível confirmar a presença desses compostos pelos valores de m/z de 353 (354 u), 179 (180 u) e 609 (610 u), para o ácido clorogênico, ácido cafeico e rutina, respectivamente (FURTADO et al., 2016).
Dessa forma, é de suma importância uma avaliação acerca da atividade farmacológica do extrato aquoso de I. asarifolia na doença inflamatória intestinal, especialmente pelo relato na literatura de sua propriedade anti-inflamatória e antiedematogênica em modelos de peritonite, bolsa de ar e edema de pata, assim como de seus
Fonte: FURTADO et al. (2016).
Figura 3. Cromatograma representativo dos compostos majoritários do extrato aquoso das
folhas de Ipomoea asarifolia por HPLC-DAD (A); ácido clorogênico (B); ácido cafeico (C); rutina (D).
compostos majoritários, ácido clorogênico, ácido cafeico e rutina (FURTADO et al., 2016; LIMA et al., 2014).
Diante do exposto, a avaliação de toxicidade deste extrato também se faz necessária, especialmente pelo relato de toxicidade envolvendo alimentação de animais com I.
asarifolia de crescimento selvagem, como: ovinos e bovinos (TORTELLI et al., 2008),
bubalinos (BARBOSA et al., 2005, 2012) e caprinos (ARAÚJO et al., 2008; MEDEIROS et al., 2003). É conhecida por causar uma síndrome tremogênica, caracterizada por sonolência, tremores, marcha incoordenada, hipermetria e salivação (MEDEIROS et al., 2003). Recentemente essa toxicidade está sendo associada à presença de compostos diterpênicos indólicos derivados de endófitos (LEE; GARDNER; COOK, 2017; WELCH et al., 2018).
Gardner et al. (2018) avaliaram o efeito de diterpênicos indólicos isolodos de I.
asarifolia em camundongos swiss, quanto à síndrome tremogênica. Neste estudo, os
diterpênicos terpendole K, 6,7-desidroterpendole A, 11-hidroxi-12,13-epoxterpendole K, terpendole C, paxillina e 6,7-dehydro-11-hydroxy-12,13-epoxyterpendole A, dissolvidos em DMSO-água (9:1) foram administrados a uma dose de 8 mg/kg (i.p.), sendo observado que apenas os compostos 11-hidroxi-12,13-epoxterpendole K e 6,7-dehydro-11-hydroxy-12,13-epoxyterpendole A não mostraram atividade tremogênica significativa.
O quadro 1 a seguir, mostra os principais estudos que avaliaram a atividade biológica e toxicidade experiemental de I. asarifolia.
Quadro 1.Principais estudos que avaliaram atividade biológica e toxicidade experiemental de
I. asarifolia
Parte da Planta Preparação Concetração/dose Avaliação Referências
Folhas Extrato aquoso e frações
10, 20 e 30 mg/kg Anti-inflamatória (LIMA et al., 2014) Folhas Extrato aquoso
10, 20, 30 e 40 mg/kg Anti-inflamatória e Antiedematogênica (FURTADO et al., 2016) Folhas Extrato metanólico 100 e 400 mg/kg Analgésica e Antiedematogênica (JEGEDE et al., 2009) Folhas Extrato aquoso
35,5, 75 e 150 mg/kg Analgésica e Antiedematogênica (LAWAL et al., 2010) Folhas Extrato metanólico 100, 200 e 400 mg/kg.
Proteção hepática (FARIDA et al., 2012)
Folhas Extrato aquoso 25, 50 e 100 mg/kg Anti-inflamatória intestinal
(DA SILVA et al., 2018) Folhas secas - 5-37 g/kg Síndrome tremogênica em cabras (MEDEIROS et al., 2003) Folhas frescas - - Toxicidade em bubalinos (BARBOSA et al., 2005, 2012) Planta inteira fresca ou seca - 1- 20 g/kg Toxicidade em caprinos e ovinos (ARAÚJO et al., 2008) Planta inteira fresca seca - 10-20% na ração consumida Eliminação de toxinas no leite de cabras (CARVALHO DE LUCENA et al., 2014) Folhas Extrato hiroetanólico 40- 1000 mg/kg Toxicidade aguda e subcrônica em roedores (AKINDELE; UNACHUKWU; OSIAGWU, 2015) Fonte: AUTOR (2020).
3.2 ENSAIOS DE TOXICIDADE AGUDA E SUBCRÔNICA
O ensaio de toxicidade oral aguda e subcrônica, geralmente são realizados de acordo com protocolos da Organização para Cooperação e Desenvolvimento Econômico-OECD, os quais são adotados pela Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA) para ensaios pré-clínicos.
No ensaio de toxicidade aguda, a substância teste é administrada em dose única por via oral (v.o.), sendo a dose de 2000 mg/kg, a máxima permitida. A administração é precedida de um jejum de 1-2 h. Após a administração, os animais são observados individualmente nos intervalos de 10, 30, 60 min e com 4 h para avaliação de sinais de toxicidade como contorções, enrijecimento, dificuldade para andar, alterações comportamentais e qualquer efeito tardio agudo e periodicamente durante 14 dias (OECD, 2008a).
No ensaio de toxicidade subcrônica, a substância teste é administrada diariamente (v.o.) em doses seriadas, abaixo da dose máxima não tóxica do ensaio de toxicidade aguda, durante 28 dias. Nesse período de administração, os animais são observados todos os dias para avaliação de sinais de toxicidade, morbidade e mortalidade (OECD, 2008b).
3.3 DOENÇA INFLAMATÓRIA INTESTINAL
As DII são doenças gastrointestinais caracterizadas por inflamação intestinal e dano à mucosa epitelial, decorrente de uma resposta imunológica alterada, associada a fatores genéticos e ambientais, as quais apresentam manifestações intra e extraintestinais (KHOR; GARDET; XAVIER, 2011; WIRTZ et al., 2007). A patogênese da DII está intimamente relacionada ao aumento na sensibilidade da mucosa aos antígenos do lúmen intestinal, os quais são apresentados às células T imaturas para que ocorra a diferenciação em células Th-específicas. A reposta inflamatória é exacerbada e envolve células Th1 e Th17 na DC, e células Th2 na CU, por meio de uma reposta inadequada de células T reguladoras (Tregs)
(KHOR; GARDET; XAVIER, 2011; RAMOS; PAPADAKIS, 2019). No entanto, é sabido que as células Th17 estão relacionadas em ambas as condições, as quais produzem grande quantidade de IL-17(GÁLVEZ, 2014). Para melhor compreensão, daremos início a uma explicação da anatomia e histologia normal do cólon.
3.3.1 Anatomia e Histologia Normal do Cólon
O cólon é o segmento distal do trato gastrointestinal. Ele começa na válvula ileocecal e termina no ânus, sendo dividido em regiões anatômicas como ceco, apêndice, cólon ascendente, o qual é uma continuação da região cecal, passando a ser cólon transverso na flexura hepática e cólon descendente na flexura esplênica. Na sua face distal fica o cólon sigmoide que se transforma em reto. A parede colônica é constituída por mucosa, submucosa, muscular própria e serosa, sendo sua principal função, a absorção de água e eletrólitos (REISNER, 2016).
A partir da superfície da mucosa, numerosas glândulas (criptas de Lieberkuhn) se estendem de forma regularmente espaçada em direção a sua porção mais profunda. O epitélio é constituído por células colunares altas com células caliciformes intercaladas, células absortivas, células enteroendócrinas e células-tronco que ficam restritas as bases das glândulas (criptas) estendendo-se em média, um terço da altura das criptas, sendo responsáveis pelo crescimento e regeneração epitelial. Entre as glândulas fica a lâmina própria, constituída por tecido conjuntivo frouxo e muscular da mucosa, podendo conter quantidade considerável de linfócitos e de outras células do sistema imune. Já a submucosa, consiste em um tecido conjuntivo denso e irregular, contendo vasos sanguíneos e áreas de tecido adiposo, seguido da camada muscular circular interna e longitudinal externa, e serosa
que é o revestimento externo, formado por tecido conjuntivo frouxo e uma camada de células pavimentosas (REISNER, 2016; ROSS; PAWLINA, 2012).
3.4 PREVALÊNCIA DA DII
A DII está associada a altos custos de tratamento e seu ônus aumenta globalmente (RAMOS; PAPADAKIS, 2019; ALATAB et al., 2020). A história familiar é um fator de risco para o seu desenvolvimento, apresentando uma incidência máxima na fase adulta inicial. No entanto, indivíduos de qualquer idade podem ser afetados (STROBER; FUSS; MANNON, 2007). A doença pode se manifestar também na infância antes dos dois anos de idade e este início precoce é caracterizado por uma rápida progressão da doença, levando a graves repercussões (BRUMATTI et al., 2014).
Desde o seu conhecimento na área médica, aproximadamente por volta de 1875 até os anos 2000, sua prevalência só aumenta; sendo maior no Canadá, EUA, norte da Europa e Austrália; intermediária em regiões da Europa e América do Sul; menor em nações em desenvolvimento da África, Ásia e América do Sul e desconhecida em algumas nações em desenvolvimento da África, Ásia e América do Sul (Figura 4) (KAPLAN, 2015; NG et al., 2017). Esse aumento da prevalência e da incidência da DII em populações específicas pode estar relacionado à variabilidade genética, associada a fatores ambientais, os quais desempenham um papel importante no desenvolvimento da doença, assim como na expressão dos diferentes fenótipos da doença (SHOUVAL; RUFO, 2017).
Figura 4. Prevalência da Doença Inflamatória Intestinal.
3.5 PATOGÊNESE DA DOENÇA INFLAMATÓRIA INTESTINAL
3.5.1 Epitélio Intestinal e Ativação Celular
A camada do epitelio intestinal é composta por vários tipos celulares especializados como enterócitos, células caliciformes, células de Paneth, células enteroendócrinas, linfócitos intraepiteliais e células dendríticas (CDs), cuja integridade está relacionada às junções apicias, como: junções impermeáveis e junções aderentes. As proteínas das junções impermeáveis, ocludina (OCL), molécula de adesão juncional 1 (JAM1), zona de oclusão1 (ZO1), claudina 1 e das junções aderentes, E-caderina e Beta-catenina que são essenciais na manutenção da barreira intestinal. Quando deficientes, elas podem levar a respostas inflamatórias na mucosa intestinal (MICHIELAN; D’INCÀ, 2015), pois a maioria das células imunes no corpo está localizada no intestino, onde são separados dos microrganismos por uma camada de muco e uma camada de células epiteliais. Dessa forma, a perda da integridade dessa barreira resulta na invasão de patógenos ou a uma resposta irrestrita a antígenos da microbiota comensal, de antígenos alimentares ou a autoantígenos (KANNEGANTI, 2017).
A variedade de células imunes inatas presente na mucosa intestinal promovem a diferenciação e ativação de células T, tanto em reposta a microbiota comensal quanto a alterada (OKUMURA; TAKEDA, 2017). No entanto, para que essa ativação celular ocorra, a integridade da barreira intestinal que separa o lúmen e a mucosa deve estar comprometida (NISHIDA et al., 2018), como mensionado. Sendo assim, a interação da microbiota intestinal alterada ou não, associada a uma barreira intestinal enfraquecida poderá levar a ativação celular inapropriada que são responsáveis pela variedade de fenótipos apresentados clinicamente pelos pacientes com a DII (RAMOS; PAPADAKIS, 2019).
Estudos em humanos e murinos sugerem que a porção íleo-terminal do intestino, onde são encontradas as células de Paneth, células epiteliais diferenciadas da mucosa intestinal que secretam fatores de crescimento e enzimas digestivas como lisozimas e os peptídeos antimicrobianos, α-defensinas e β-defensinas, possuem papel chave na tolerância imunológica e colonização bacteriana do intestino, sendo um sítio provável de indução inicial da resposta imunológica na DC (IVANOV; NUSRAT; PARKOS, 2004).
3.5.2 Fatores Genéticos
O gene para o receptor NOD2 (domínio de oligomerização vinculado a nucleotídeos 2), assim como alguns de seus polimorfismos, é descrito como sendo o gene da suscetibilidade para o desenvolvimento da DII. O NOD2 reconhece o dipeptídeo muranil, derivado dos peptoglicanos de bactérias gram positivas quanto de gram negativas e está envolvido na produção de peptídios antimicrobianos, sendo relatados níveis reduzidos dos peptídeos α-defensinas (HD5 e HD6) ε-defensinas (HBD2, HBD3 e HBD4) para pacientes que apresentam polimorfismos para NOD2 (PARK et al., 2017).
Outros dois genes de interesse particular para o desenvolvimento da DII é o gene ATG16L1 e o gene da guanosina trifosfatase (IRGM) relacionados à autofagia e eliminação de bactérias intracelulares (ABBAS; LICHTMAN; PILLAI, 2015; RAMOS; PAPADAKIS, 2019). As células epiteliais e as CDs que contêm variantes ATG16L1 apresentam defeitos na autofagação antibacteriana por defeitos nos grânulos lisossomais, os quais se apresentam de forma alterada, tanto na sua localização como em tamanho e número (COONEY et al., 2010). Um mecanismo proposto para o papel da autofagia está relacionado à remoção das mitocôndrias danificadas, impedindo a liberação de espécies reativas de oxigênio (ERO) do ácido desoxirribonucleico (DNA) mitocondrial para o citoplasma, limitando a formação do inflamassoma NLRP3 (ZHOU et al., 2011).
3.5.3 Principais Fatores Ambientais
A dieta é um dos fatores de estilo de vida que está relacionado diretamente ao aumento da incidência de doenças inflamatórias e autoimunes em países desenvolvidos e em desenvolvimento. Uma dieta rica em calorias, fibras e carboidratos de baixa qualidade, favorecem uma alteração da microbiota intestinal. Em um estudo recente, foi demonstrado que ratos gnotobióticos humanizados com uma dieta ocidentalizada (sem carboidratos fermentáveis), incidiu em diminuição da diversidade da microbiota intestinal, a qual está relaciona a integridade da mucosa. Desse modo, terapias que utilizam de probióticos, prebióticos e transplante de fezes vem sendo estudadas, na tentativa de recuperar a diversidade microbiana intestinal benéfica na proteção da integridade da barreira epitelial (RICHARDS et al., 2016).
Hou et al. (2011) em uma revisão sistemática relataram que uma dieta rica em gorduras totais, ácidos graxos poliinsaturados, ômega-6 e carne estão associados a um aumento do risco de DC e CU, já o consumo elevado de fibras, frutas e vegetais foram
associados a um risco diminuído a DC e CU, respectivamente. Já os ácidos graxos de cadeias curtas estão associados a propriedades anti-inflamatórias, pois são capazes de regular várias funções leucocitárias como a produção de citocinas (TNF-α, IL-2, IL-6 e IL-10), eicosanóides e quimiocinas, além de influenciar na capacidade de migração leucocitária para os local da inflamação (VINOLO et al., 2011).
O ato de fumar é outro exemplo de fator ambiental modificador de funções celulares que leva a um defeito na autofagia ou função lisossômica em macrófagos, evidenciado pela falta de depuração de proteínas agregadas, ubiquitinizadas e acumulação de mitocôndrias anormais. A autofagia é um dos processos que estão envolvidos na DC, dessa forma, uma autofagia defeituosa pode estar envolvida no agravamento da doença. Com efeito, a exposição a um modificador de doença em um indivíduo geneticamente predisposto pode levar consequentemente ao desenvolvimento da DII (MONICK et al., 2010).
3.5.4 Respostas Imunes da Mucosa
A resposta inflamatória inicial resulta no recrutamento de leucócitos polimorfonucleares (PMNs), que uma vez presente no tecido colônico pode levar a uma mudança metabólica da mucosa. Os PMNs consomem o oxigênio, dependente da enzima fosfato de nucleotídeo adenina dicotinamida (NADPH) levando a uma hipóxia tecidual, a qual proporciona um microambiente favorável à estabilização do fator de transcrição indutível por hipóxia (HIF) pelas células epiteliais, responsável pela manutenção da expressão basal de peptídeos antimicrobianos e de proteínas responsáveis pela integridade da barreira da mucosa, no entanto, as micropartículas liberadas pelas vesículas dos PMNs ativados podem promover a inflamação e lesão tecidual pela liberação da mieloperoxidase (MPO) e metaloproteinase 9 (MMP9) (HALL; CAMPBELL; COLGAN, 2017). Dessa forma, a ativação adequada de uma reposta imune a antígenos microbianos comensais ou patogênicos é fundamental para a manutenção da homeostase intestinal (OKUMURA; TAKEDA, 2017).
Posteriormente, a manutenção da resposta inflamatória é promovida através da estimulação da resposta imune adaptativa, principalmente mediada por células T auxiliares (CD4 +) ativadas. A diferenciação em um dos perfis de células Th está relacionada à heterogeneidade funcional associada a um padrão de produção de diferentes citocinas, que se correlaciona com a natureza do microrganismo ofensor. A diferenciação em tipos específicos de células T depende das interações de citocinas específicas, com fatores de transdução de sinal ou ativadores de transcrição (KMIEĆ; CYMAN; ŚLEBIODA, 2017).
3.5.5 O Papel dos Receptores de Reconhecimento de Padrões na Inflamação Intestinal
A maioria das células expressam receptores de reconhecimento de padrão, o que lhes confere a capacidade de desencadear respostas imunes inatas. Um dos receptores de reconhecimento de padrão extracelular, presente em muitos tipos celulares que reconhece produtos de uma grande variedade de microrganismos, assim como moléculas expressas ou liberadas por células em estresse ou em processo de apoptose, são os receptores TLRs. Os TLRs são glicoproteínas integrais de membrana que contêm repetições ricas em leucina flanqueadas por locais ricos em cisteína nas suas regiões extracelulares, e um domínio de homologia do receptor Toll/IL1 (TIR) em suas caudas citoplasmáticas. Os domínios TIR também são encontrados nas caudas citoplasmáticas dos receptores das interleucinas 1 beta (IL-1β) e interleucina-18 (IL-18), assim como em receptores disparados pelos TRLs. Os principais fatores de transcrição ativados por vias de sinalização ativadas por TLRs são fator nuclear kappa B (NF-κB), Proteína 1 (AP-1), fator III e fator VII de reposta a interferon (IFN) (ABBAS, A. K.; LICHTMAN, A. H.; PILLAI, 2015).
Outro grupo importante é o de receptores NLRs (receptores intracelulares) ou receptores semelhantes à NOD. Fazem parte desse grande grupo, os receptores NOD, receptores RIG-I-Like e os receptores de lectina tipo C (CHEN; NÚÑEZ, 2011), sendo um grupo de receptores intracelulares especializados que desempenham um papel chave no sistema imune inato (CHEN et al., 2009). Em humanos há mais de vinte proteínas relacionadas à família de receptores NRLs, sendo expressas em células imunes como os linfócitos, macrófagos e CDs, além de células mesoteliais e endoteliais. Estas proteínas são compostas por domínios da variação N-terminal: domínio de recrutamento das caspases (CARD), domínio de Pirina (PYD) e um domínio de transativação ácida ou repetição de inibição do baculavírus (BIR) que são os domínios efetores e cruciais para a sinalização nos processos de apoptose e inflamação; uma ligação de nucleotídeo central: domínio de oligomerização (NOD); e um domínio C-terminal rico em leucinas (LRR) que detecta padrões relacionados aos patógenos (PAMPs) (CHEN et al., 2009).
O reconhecimento PAMPs pelos TLRs e NRLs, em geral, recrutam proteínas adaptadoras, como o fator de diferenciação mielóide 88 (MYD88), adaptador contendo domínio TIR (TRIF) e proteína com domínio de recrutamento de caspase (ASC)- esta última, uma proteína que promove a oligomerização, recrutamento e aproximação de proteínas efetoras na ativação de caspase 1. Dessa forma, o sinergismo de atuação pelo TLRs e NLRs
no reconhecimento de PAMPs e de endossomos, medeia um fino controle na reposta imune inata que desencadeia em respostas inflamatórias (Figura 5).
Figura 5.Sinergismo da ação de receptores TLRs e NLRs, mostrando o reconhecimento e resposta a PAMPs e endossomos.
Fonte: CHEN et al. (2009), adaptada. Legenda: A figura ilustra a via de sinalização do receptor Toll-like receptors (TLR) no reconhecimento de padrões moleculares associados a patógenos (PAMPs) na membrana plasmática e sinalização para ativação do fator nuclear kappa B, com consequente ativação de genes inflamatórios (como da IL-1-β). Em associação, os receptores do tipo Nod (NLR) são ativados por endossomos, que ativam caspase 1, a qual atua no precurssor pró-IL1β para liberação da citocina IL-1β madura.
3.5.5.1 Ativação da via do NF-κB
Os TRLs, BCRs (receptores de células B), TCRs (receptores de células T) e muitos receptores de citocinas ativam o NF-κB, permitindo-o o direcionamento ao núcleo celular para transcrição de genes envolvidos na inflamação. Com efeito, essa sinalização desempenha assim, um papel central na inflamação, na ativação de linfócitos e na sobrevida celular (ABBAS; LICHTMAN; PILLAI, 2015). As principais vias de ativação do NF-κB são as vias canônica e não-canônicas (ou alternativa). A via canônica atua na regulação da resposta imune, na ativação de inflamassomas, além ativar a expressão de genes envolvidos no desenvolvimento e progressão da inflamação. Sendo assim, as novas estratégias terapêuticas para doenças inflamatórias visam bloquear o NF-κB (Figura 6), seja pela inibição
de quinases (IKK), inibição de proteossomas, da translocação de subunidades da via ao núcleo ou de suas ligações ao DNA (LIU, et al., 2017).
Liu et al. (2017) relatam que alterações genéticas nas subunidades do NF-κB estão envolvidas na patogênese da DII e podem induzir a inflamação intestinal espontaneamente em modelos animais, com características semelhantes a DII em humanos. Ademais, mutações genéticas em NOD2, interleucina-12 (IL-12) e interleucina-13 (IL-23), que são imunoestimuladores do NF-κB estão associadas à DII humana (ABRAHAM; CHO, 2009).
Figura 6.Sinalização do NF-κB na inflamação e pontos de controle.
Fonte: LIU, et al. (2017), adaptada. Legenda: A figura ilustra as estratégias terapêuticas que visam o bloqueio da sinalização pelo NF-κB que podem atuar por: 1, na inibição da atividade das quinases IKK, impedindo assim, a fosforilação de IκBα e posterior liberação das subunidades p65 e P50 ao núcleo celular. 2, outro mecanismo seria a inibição da atividade de proteases do complexo de proteossomas, responsáveis degradação de IκBα ou até mesmo a inibição da ligação das subunidades p65 e p50 aos seus receptores e translocação ao núcleo. 3, finalmente, uma das estratégias seria a inibição da ligação das subunidades do NF-κB ao DNA.
3.6 TRATAMENTO FARMACOLÓGICO
A farmacoterapia da DII baseia-se em fármacos derivados de aminossalicilatos (mesalamina, sulfassalazina, olsalazina e balsalazida), de corticosteroides (prednisolona, metilprednisolona, hidrocortisona e budesonida) e imunomoduladores (6-mercaptopurina,
azatioprina, metotrexato, ciclosporina, e tacrolimus), visto que é uma doença com etiologia multifatorial. Sendo assim, o principal objetivo da farmacoterapia da DII é minimizar a resposta inflamatória exarcebada, induzir a remissão e aliviar os sintomas (BRUNTON; HILAL-DANDAN; KNOLLMAN, 2018).
Além daqueles comumente utilizados, os medicamentos biológicos como anticorpos monoclonais contra o TNF-α (infliximabe, adalimumabe, certolizumabe e golimumabe), integrinas (vedolizumabe e natalizumabe) e antagonistas de interleucina IL-12 e IL-23 (ustekinumabe) estão clinicamente disponíveis (RAWLA; SUNKARA; RAJ, 2018), no entanto, apresentam sérios efeitos adversos como distúrbios imunológicos e nefrotoxicidade (BIANCONE et al., 2017). A seguir serão apresentados os principais fármacos utilizados na DII.
3.6.1 Aminossalicilatos
A sulfassalazina (SSZ) durante um bom tempo foi o pilar na terapia da CU. Entretanto, a ocorrência frequente de eventos adversos como náuseas, vômitos, azia, diarreia e dor de cabeça limitaram seu uso (BIANCONE et al., 2017; BRUMATTI et al., 2014). A SSZ é quebrada em seus subcomponentes pelas azorredutases bacterianas na região ileal do cólon para a sua fração terapêutica, o ácido 5-ASA, e em sulfapiridina, que atua como transportador. À medida que os efeitos adversos pareciam estar relacionados à sulfapiridina, novas formas de fornecer 5-ASA foram desenvolvidas, como a mesalazina (BIANCONE et al., 2017).
A atividade da SSZ e mesalazina possuem eficácias parecidas e dependendo da dose, atuam na remissão da DC. A mesalazina inibe a via da ciclooxigenase e da 5-lipooxigenase do metabolismo do ácido araquidônico, levando a redução nos níveis do leucotrieno B4 e do ácido hidroxieicosatetraenóico. Também é observada ação na remoção de metabólitos reativos de oxigênio, redução da quimiotaxia e fagocitose dos neutrófilos e macrófagos, assim como inibição da produção de citocinas e da secreção de imunoglobulinas pelas células mononucleares do sangue periférico e do intestino (BRUNTON; HILAL-DANDAN; KNOLLMAN., 2018).
A mesalazina oral está disponível em várias formulações (alsalazida, pentasa, olsalazina e microplaquetas de 5-ASA) com diferentes mecanismos de liberação. Todas, porém, mostram uma absorção sistêmica muito baixa e também causam anormalidades bioquímicas e hepáticas em 2% dos casos, bem como prurido em 1% dos pacientes em tratamento (BIANCONE et al., 2017).
3.6.2 Corticosteróides
O uso de corticosteroides hidrocortisona e prednisolona é um dos principais tratamentos de suporte na DII depois dos aminossalicilatos. A maioria dos pacientes melhora significativamente cinco dias após o inicio do tratamento; outros sofrem remissão nas seis semanas seguintes. Para os casos mais graves, os corticosteróides também são eficazes na indução da remissão de 60-90% dos pacientes com DC em atividade (BRUNTON; HILAL-DANDAN; KNOLLMAN, 2018). Contudo, esses medicamentos de atuação sistêmica causam vários efeitos colaterais que limitam seu uso recorrente ou de longo prazo; levam a risco de hemorragias, hipertensão, desordens metabólicas, osteopenia e osteoporose e manifestações oculares (BIANCONE et al., 2017). Outra opção no mercado é a budesonida, um corticosteróide de segunda geração que apresenta pouca atividade sistêmica devido ao metabolismo hepático de primeira passagem, apresentando assim, um perfil de segurança em pacientes com CU leve a moderada. Não obstante, ainda não se tem dados do uso em longo prazo do fármaco (WEISSHOF et al., 2018).
3.6.3 Imunomoduladores
Inicialmente, os imunossupressores foram desenvolvidos com o objetivo de tratamento quimioterápico no câncer e após transplantes de órgãos, os quais foram adaptados para o tratamento de DII. Seu uso é uma alternativa complementar ao tratamento de pacientes com DII. Embora desenvolvam efeitos colaterais significativos, eles são mais seguros e melhor tolerados do que a terapia com corticosteroides em longo prazo. O uso desses agentes deve ser monitorado periodicamente e nem devem ser usados em pacientes que se submeterão a procedimentos cirúrgicos (PITHADIA; JAIN, 2011).
3.6.4 Agentes Biológicos
Os agentes biológicos são proteínas altamente complexas ou substâncias derivadas de uma fonte biológica (WEISSHOF et al., 2018). As terapias biológicas recentes que visam o fator de necrose tumoral alfa (TNF-α) como os anticorpos sintéticos anti-TNF-α, demonstraram mitigar o processo inflamatório em condições inflamatórias crônicas, incluindo DII, tendo eficácia comprovada em pacientes com a DC. Vários ensaios controlados com placebo demonstraram que infliximab, adalimumab e certolizumabpegol são eficazes no tratamento da DC moderada a grave. Utilizados como tratamento de primeira linha ou como
de segunda linha em pacientes com respostas inadequadas ao tratamento padrão, a manutenção da remissão da doença é observada (PEDERSEN et al., 2014).
Já os fármacos antiadesão celular irão minimizar a migração celular pela inibição das interações entre moléculas específicas nos linfócitos (integrinas) e seus ligantes nas células do intestino (molécula de adesão celular) (WEISSHOF et al., 2018).
Outra classe de agentes biológicos são as moléculas anti-interleucinas 12/23, que são anticorpos IgG1 humano. Eles irão ligar-se contra a subunidade p40 dessas citocinas e com isso, inibir a proliferação de linfócitos Th1 e Th17. Todavia, o uso de agentes biológicos podem levar a reativação de infecções latentes, complicações sistêmicas e eventos alérgicos (RAWLA; SUNKARA; RAJ, 2018).
3.7 MODELOS ANIMAIS DE INFLAMAÇÃO INTESTINAL
Um dos desafios da pesquisa pré-clínica está relacionada à qualidade dos resultados, os quais devem preditivos para o que acontece em humanos. Por isso, a escolha de um modelo animal de inflamação intestinal, deve ser semelhante ao que acontece na mucosa intestinal humana. Quando escolhido corretamente, o modelo pode ser usado para uma investigação do mecanismo fisiopatológico da doença, assim como para aplicação de novas terapias emergentes (WIRTZ et al., 2017).
Os principais modelos de colite em roedores são os que induzem a colite quimicamente, embora haja também modelos de colite espontânea (congênita ou geneticamente modificada), de transferência celular e induzida por bactérias.
3.7.1 Colite Induzida Quimicamente por Via Retal
O modelo que induz a colite por via retal (v.r.), geralmente é por um agente hapteno dissolvido em etanol. O etanol permite que o agente atravesse a barreira da mucosa para que possa interagir com proteínas autólogas ou antígenos microbianos da mucosa intestinal, tornando-se imunogênico ao sistema imune (WIRTZ et al., 2007). Os agentes haptenos mais utilizados são o ácido trinitrobenzeno sulfônico (TNBS), o ácido dinitrobenzeno sulfônico (DNBS) e a oxazolona (MARTÍN et al., 2017). O TNBS e o DNBS induzem uma resposta imune de células especializadas Th1, enquanto que a oxazolona provoca uma resposta por células Th2 (RANDHAWA et al., 2014).
Para o uso TNBS ou DNBS, é necessário uma otimização das concentrações a serem administradas, especialmente quando se propõe um modelo crônico da doença (WIRTZ et al., 2017). Ambos promovem uma infiltração proeminente de neutrófilos (RANDHAWA et al., 2014), linfócitos e macrófagos na mucosa, assim como o espessamento da parede do cólon, edema e ulcerações (MARTÍN et al., 2017; RANDHAWA et al., 2014).
Já a administração (v.r.) do reagente hapteno oxazolona dissolvida em etanol, induz uma colite grave, caracterizada por uma elevada produção de citocinas Th2, interleucina 4 (IL-4), interleucina 5 (IL-5) e interleucina 13 (IL-13). A administação de oxazalona produz diarreia com perda marcante de células caliciformes e grande redução de peso, levando a altas taxas de mortalidade (WIRTZ et al., 2007). Portanto, esse modelo tem sido usado para estudar papel da resposta imune dependente de Th2 na inflamação intestinal. Estes modelos de indução da colite baseados em haptenos, estão representadas na (Figura 7).
Outro modelo de indução química é pelo ácido acético, que é de fácil indução, sendo administrada uma solução diluída de ácido acético para promoção de uma inflamação não transmural, caracterizada por elevada infiltração de neutrófilos, necrose maciça da mucosa e submucosa, dilatação vascular, edema e ulceração da submucosa. A colite induzida pelo ácido acético leva a um desequilíbrio entre substâncias oxidantes e antioxidantes pela grande quantidade de infiltrado neutrofílico, que também liberam proteases e mediadores lipídicos, levando a intensificação das lesões intestinais (RANDHAWA et al., 2014).
3.7.2 Colite Induzida Quimicamente por Via Oral
Dextran sulfato de sódio (DSS) é um agente químico indutor da colite por via oral, que é dissolvido em água e administrado aos roedores (WIRTZ et al., 2007). O DSS é tóxico para as células basais das criptas, promovendo uma perda da barreira epitelial intestinal. O DSS provoca principalmente, um processo inflamatório intestinal agudo que é morfologicamente caracterizado por hiperemia, ulcerações, edema, além de infiltração de granulócitos, cujos sintomas são manifestados sob a forma de diarreia sanguinolenta (WIRTZ et al., 2007). Também podem ser analisados vários parâmetros como TNF-α (característica marcante da colite induzida por DSS), interleucina-10 (IL-10), IL-1β, fator de crescimento de fibroblasto β, mucina, expressão do gene TLR2, atividade da MPO, número de células das criptas, assim como o índice de atividade da doença- IAD.
3.7.3 Outras Formas de Indução de Colite
O uso de animais com deficiência em algum dos fatores envolvidos no processo da inflamação intestinal também vem sendo utilizados, sendo a deficiência no gene da IL-10 uma linhagem importante, visto que roedores com defeito no gene da IL-10 desenvolvem semelhanças fisiológicas com a DII humana, incluindo lesões inflamatórias, infiltração celular na lâmina própria e submucosa, depleção de mucina, úlceras, espessamento do tecido intestinal e hiperplasia epitelial (KEUBLER et al., 2015). É um modelo interessante para o estudo de algum dos componentes envolvidos na cascata da inflamação intestinal.
Já os modelos de transferência celular são úteis para estudar os papéis específicos desempenhados pelas células imunes, incluindo células Tregs, CDs e monócitos, na supressão,
limitação e duração da inflamação (MARTÍN et al., 2017).
Fonte: MARTÍN et al. (2017), adaptada. Legenda: A figura ilustra o efeito de agentes haptenos carreados com etanol na mucosa intestinal. O etanol permite que o hapteno consiga atravessar o epitélio intestinal e assim ativar respostas imunes inatas (ativação de macrógafos) e repostas adaptativas (ativação e diferenciação de células Th específicas). Comitantemente, com a pertubação do microambiente intestinal e danificação da barreira intestinal (eptélio e mucosa intestinal) há um aumento da permeabilidade intestinal, por meio de alterações nas junções intercelulares, destruição de células caliciformes e diminuição na produção de muco, o que leva a uma predisposição a disbiose intestinal, aumentando ainda mais a ativação celular e destruição tecidual.
Figura 7. Efeito de agentes haptenos na ativação imune, estresse
4 MATERIAL E MÉTODOS
4.1 MATERIAL VEGETAL E PREPARAÇÃO DO EXTRATO
A coleta das folhas de I. asarifolia ocorreu no mês de dezembro (2015) na cidade de Mossoró/RN, Brasil (latitude: -5,1875; longitude: -37,344167), coleta: Sá, W., identificada por Oliveira, O. F. As exsicatas foram depositadas no herbário “Dárdamo Andrade Lima” da Universidade Federal Rural do Semi-árido/UFERSA, Brasil, sob número: MOSS 7096. A coleta do material vegetal foi autorizada pelo Sistema de Autorização e Informação em Biodiversidade (SISBIO), processo de número 35017, e autorização do Sistema Nacional de Gestão do Patrimônio Genético e Conhecimento Tradicional Associado, número A4E8DE0.
As folhas foram lavadas, secas em estufa e moídas em liquidificador industrial. Em seguida, submetidas à extração por decocção durante 15 min, na proporção droga vegetal: solvente 1:10 (w/v). Após esse período, o extrato foi filtrado e congelado por 72 h a -80 °C e liofilizada (Christ, modelo Alpha 1-2 LD), obtendo-se o extrato aquoso liofilizado para realização dos ensaios de toxicidade e inflamação intestinal (Figura 8).
Figura 8. Representação dos ensaios e análises realizadas com o extrato de I. asarifolia.
4.2 DETERMINAÇÃO DO TEOR DE FENÓLICOS E FLAVONOIDES TOTAIS DO EXTRATO AQUOSO DAS FOLHAS DE Ipomoea asarifolia
A determinação do teor de fenólicos totais no extrato IA foi realizada pelo teste de Folin-Ciocalteu. Uma curva do padrão de ácido gálico em DMSO foi construída em diferentes concentrações (25 µg/mL a 100 µg/mL). Os ensaios foram realizados em placas de 96 poços e em cada poço foram colocados 25 µL da amostra (extrato ou ácido gálico), mais 125 µL de reagente de Folin-Ciocaleu (10% v/v em H2O) e 100 µL de bicarbonato de sódio a 7,5% (p/v).
Os brancos eram contituídos de 25 µL de DMSO na ausência das amostras. As placas foram incubadas por 30 min, protegidas da luz e em temperatura ambiente. A leitura foi realizada pelo leitor de ELISA a 765 nm. O método se mostrou linear, apresentando um r2 de 0,9925. O conteúdo total de compostos fenólicos no extratos foi expresso em miligramas equivalente do padrão ácido gálico (EAG) por grama de extrato (mg de EAG/g de extrato).
A determinação do teor de flavonóides totais do extrato IA foi realizado através do método do cloreto de alumínio (SOUSA et al., 2015). Uma curva do padrão de quercetina em DMSO foi construída em diferentes concentrações (1,25 µg/mL a 100 µg/mL). Os ensaios foram realizados em placas de 96 poços e em cada poço foram adicionados 50 µL de amostra (extrato ou quercetina), mais 160 µL de etanol, 20 µL de cloreto de alumínio a 1,8% (p/v) e 20 µL de acetato de sódio (820,3 mg em 100 mL de H2O). Os brancos eram constituídos de
50 µL de DMSO. As placas foram incubadas por 40 min em temperatura ambiente. A leitura foi realizada pelo leitor de ELISA a 415 nm. O método se mostrou linear, apresentando um r2 de 0,9903. O conteúdo total de flavonoides no extratos foi expresso em miligramas equivalente do padrão quercetina (EQ) por grama de extrato (mg de EAG/g de extrato).
4.3 ANIMAIS: TOXICIDADE AGUDA E SUBCRÔNICA
Mus musculus, linhagem Swiss, fêmeas (n= 30) e machos (n= 20) utilizados neste
protocolo, possuíam 6 a 8 semanas de idade, peso médio de 35 ± 5 g, alojados em caixa de polipropileno e mantidos sob condições claro/escuro de 12 h, temperatura ambiente (média de 22 ± 3 ºC) e umidade relativa (50 a 55%) controlada; alimentados com ração extrusada e água potável (ad libitum). O projeto foi aprovado pelo Comitê de Ética no Uso de Animais (CEUA) do Centro de Biociências da Universidade Federal do Rio Grande do Norte, sob o protocolo nº 051/2018 (ANEXO 1).
