Os resultados estão publicados no artigo de Referência: DA SILVA, V. C. et al. Intestinal Anti-Inflammatory Activity of the Aqueous Extract from Ipomoea asarifolia in DNBS-Induced Colitis in Rats. International Journal of Molecular Sciences, v. 19, n. 12, dec, 2018 (link: https://www.mdpi.com/1422-0067/19/12/4016/htm), como parte deste trabalho de dissertação (APÊNDICE B).
6 DISCUSSÃO
É sabido que compostos fenólicos exibem um amplo espectro de atividades biológicas (LEWANDOWSKA et al., 2016) como atividade antioxidante, anti-inflamatória, de modulação da microbiota intestinal e de proteção do epitélio intestinal (KAULMANN; BOHN, 2016). Caracterizam-se quimicamente por um anel benzênico, um grupamento carboxílico e um ou mais grupamentos de hidroxila e/ou metoxila em sua molécula, conferindo grande propriedade antioxidante (INSTITUTO ADOLFO LUTZ (SÃO PAULO); JORGE, 2007). Além disso, é descrito que estes grupamentos químicos estão relacionados com a inibição da síntese e atividade de mediadores pró-inflamatórios como eicosanóides, citocinas, moléculas de adesão, proteína C-reativa e óxido nítrico (NO), assim como na inibição de vias de sinalização do NF-κB e da cicloxigenase-2 (AMBRIZ-PEREZ et al., 2016; MIDDLETON; KANDASWAMI; THEOHARIDES, 2000).
Com base nisso e na análise quantititativa de fenólicos e flavonoides totais de I.
asarifolia, que mostrou um rico conteúdo destes compostos, que é comparável a outras duas
plantas do gênero, Ipomoea aquatica e de Ipomoea batatas (ARYAL et al., 2019; HUE; BOYCE; SOMASUNDRAM, 2012)- que apresentaram uma boa atividade antioxidante. Esse processo aliado aos resultados preliminares com o extrato IA, a avalição de possíveis efeitos tóxicos do extrato, assim como efeito protetor frente à inflamação intestinal induzida pelo DNBS foram avaliados.
Os ensaios de toxicidade são recomendados na avaliação pré-clínica de novos candidatos para o uso terapêutico, sejam de origem natural ou sintética. Neste sentido, a OECD recomenda que durante estes ensaios sejam realizadas medidas que avaliem possíveis efeitos decorrentes da exposição em alta dose ou de uso prolongado da substância teste. Adicionalmente, no âmbito da avaliação de toxicidade no sistema nervoso central é possível avaliar a atividade motora por meio de testes comportamentais, dos quais se destacam o teste de campo aberto e Rotarod (BROOKS; DUNNETT, 2009).
Nessa perspectiva, destacamos que na avaliação da atividade motora no teste de campo aberto foram observadas diferenças significativas apenas na atividade de levantamento no primeiro dia de avaliação, no ensaio de toxicidade aguda, e no número de pulos para camundongos machos na toxicidade subcrônica. Esse aumento na frequência de levantamento e pulos em comparação ao controle pode ser justificado por alguma variação intragrupo, pois de modo geral, o extrato não alterou o comportamento exploratório destes animais. Esse é
indicativo de que a exposição repetida à caixa de monitoração induz uma habituação dos animais e a locomoção tende a diminuir (ZIMCIKOVA et al., 2017), fato obervado durante os ensaios.
A barra rotatória ou Rotarod é um dos testes mais comumente utilizados na avaliação de efeitos de drogas na coordenação motora em estudos pré-clínicos, devido sua facilidade de uso e sensibilidade para disfunções cerebelares, extrapiramidais e neuromusculares (BROOKS; DUNNETT, 2009). Nesta avaliação, foram observadas diferenças significativas apenas nos animais machos (8º dia) na toxicidade subcrônica. Não obstante, tal alteração não se manteve nas análises posteriores. Shiotsuki et al. (2010) relatam que o teste também é sensível na avaliação do aprendizado da habilidade motora e essa tendência de habituação ou aprendizado foi observada, tendo em vista que as quedas foram diminuindo com o aumento na frequência do teste aplicada aos animais.
Na análise hematológica houve uma redução significativa nos níveis plaquetários em todas as doses testadas no ensaio de toxicidade subcrônica, em animais machos. Essa trombocitopenia pode ser decorrente da diminuição da produção de trombopoietina por alguma modificação funcional nas células hepáticas (KUROKAWA; OHKOHCHI, 2018; PECK-RADOSAVLJEVIC, 2017). Estudos mostram, contudo, que os polifenois apresentam em particular, indução da inibiçãoda função plaquetária (LUTZ et al., 2019; MATTIELLO et al., 2009). Outro resultado importante foi o aumento no número de linfócitos e monócitos no ensaio de toxicidade aguda, o que pode indicar um efeito imunoestimulador da planta em altas doses (UGWAH-OGUEJIOFOR et al., 2019).
Quanto ao peso relativo dos órgãos, parâmetro utilizado como indicativo de alteração tecidual, não foram observadas diferenças significativas entre os grupos, nem nos parâmetros bioquímicos avaliativos de suas funções. Destacamos as análises dos marcadores hepáticos (ALT e AST) que não sofreram alterações siginificativas, visto que o fígado que é o principal órgão metabolizador na formação de metabólitos ativos ou tóxicos, depuração e interações farmacológicas (PEREIRA, 2007).
O presente estudo também mostrou efeito preventivo do extrato de I. asarifolia na inflamação intestinal in vivo. Os dados demonstraram que os tratamentos com IA reduziram à severidade da colite, o dano tecidual, a infiltração de células inflamatórias e redução na produção e expressão de mediadores pró-inflamatórios. Esta apresentação de atividade anti- inflamatória do extrato de I. asarifolia está de acordo com outros estudos realizados com plantas do mesmo gênero. Sugata et al. (2015) mostraram supressão na expressão do NF-κB e
TNF-α em células RAW 264.7, estimuladas por LPS e tratadas com diferentes concentrações do extrato de tubérculos das raízes de Ipomoea batatas. De forma semelhante, células RAW 264.7 pré-incubadas com diferentes concentrações do extrato de Ipomoea stolonifera, conseguiram reduzir a produção de citocinas inflamatórias, TNF-α e IL-1β, após serem estimuladas por LPS (CAI et al., 2014).
No contexto da DII experimental, o DNBS penetra na parede intestinal, atua como um hapteno, causando ulcerações e necrose no tecido do cólon. Estas últimas estão associadas à perda das junções entre as células epiteliais e ao aumento do infiltrado celular na lâmina própria, causando lesão das criptas intestinais (MICHIELAN; D’INCÀ, 2015; MARTÍN et al., 2017). Dessa forma, investigar novas estratégias de tratamento e prevenção da inflamação em diferentes modelos experimentais de colite, no intuito de buscar cada vez mais, similaridade com a DII humana é de suma importância (MARTÍN et al., 2017).
Quanto à patogênese da DII, a qual envolve o epitélio intestinal, células do sistema imune inato e adaptativo e seus mediadores secretados como citocinas e quimiocinas, destacamos o modo de ativação celular, o qual irá determinar o direcionamento para formação de uma resposta Th-específica, determinando assim, os fenótipos da doença. Nesse contexto, o iníco do processo inflamatório induzido pelo DNBS envolve um intenso infiltrado leucocitário, sendo seu controle, extremamente importante na atenuação dos sinais inflamatórios.
Neste sentindo, destacamos que o controle DNBS apresentou uma alta atividade da MPO, indicando aumento na infiltração de neutrófilos na mucosa intestinal. No entanto, o pré-tratamento com IA nas doses de 50 e 100 mg/kg e SSZ conseguiram reduzir a atividade da MPO. Biologicamente, a MPO tem como função catalisar a formação de um poderoso ácido oxidante, o ácido hipocloroso (HCLO) a partir do peróxido de hidrogênio (H2O2),
levando a danos ao DNA, proteínas e lipídeos celulares. Além disso, age no endotélio vascular, promove à liberação de mediadores pró-inflamatórios, expressão de moléculas de adesão, aumento da permeabilidade vascular e da adesão de neutrófilos (FAURSCHOU; BORREGAARD, 2003; SLATER et al., 2017). Dessa forma, a redução na atividade da MPO, mostra o efeito preventivo do extrato frente o processo inflamatório induzido pelo DNBS.
A intensa ativação celular de neutrófilos e de macrófagos durante o processo inflamatório também produz grandes quantidades de ERO (FINK, 2002) e um aumento na expressão de várias enzimas nos fagolisossomos, incluindo a oxidase dos fagócitos e da oxido nítrico sintase induzível (iNOS) (ABBAS; LICHTMAN; PILLAI; 2015), cuja expressão foi
reduzida de forma significativa com o pré-tratamento com IA na dose de 100 mg/kg e SSZ em comparação ao controle DNBS. A iNOS, responsável pela geração íons nitrito (NO2-) e nitrato (NO3-), que são íons estáveis e que tendem a se acumular nas células durante processos inflamatórios pela intensa ativação de iNOS, levam à formação de intermediários altamente reativos como ·NO2, ·N2O3 e ·NO, com isso, pode haver a nitração e nitrosação de
macromoléculas importantes como o DNA, RNA, lipídeos e proteínas, alterando assim, suas funções celulares (BHATTACHARYYA et al., 2014).
As ERO também potencializam as reações imunes por leucócitos, aumentando ainda mais o prejuízo tecidual (BHATTACHARYYA et al., 2014). O acúmulo de ERO resulta na peroxidação de lipídeos, conhecidos como hidroperóxidos lipídicos ou peróxidos lipídicos (LOOH), pelo ataque das ERO sobre os ácidos graxos poli-insaturados das membranas fosfolipídicas, com formação de radicais altamente reativos como os radicias alcoxila (LO) e peroxilas (LOO) (VALKO et al., 2016). Ainda, há formação de produtos secundários como o MDA, um dialdeído muito utilizado na avaliação do estresse oxidativo (GASCHLER; STOCKWELL, 2017; HUSSAIN; HOFSETH; HARRIS, 2003) que é associado ao desenvolvimento de doenças degenerativas e câncer (VALKO et al., 2016), o qual teve redução significativa em todas as doses testadas pelo tratamento preventivo com IA e SSZ. Assim, a associação de EROS com DII é evidente a partir da observação de que ERO diminuem os níveis de antioxidantes, contribuindo assim, para mecanismos patogênicos na DII (COLGAN; TAYLOR, 2010; IBORRA et al., 2011).
Em contrapartida a este ambiente propício à lesão tecidual, verificou-se o aumento da glutationa total nos grupos tratados com IA 100 mg/kg e com a SSZ. A glutationa, geralmente está presente na sua forma reduzida, GSH, sendo expressa de forma ubíqua juntamente com três enzimas, glutationa redutase (GR), gluationa oxidase (GPX) e glutationaS-transferubinas (GST) para formação do sistema de glutationa (PATLEVIČ et al., 2016), as quais são importantes no controle de danos à mucosa intestinal. A GPX converte a GSH em GSSG, reduzindo assim, o H2O2 à água, assim como LOOH a álcoois estáveis
(BHATTACHARYYA et al., 2014; BOMPART; PRÉVOT; BASCANDS, 1990). Já a GR é uma enzima antioxidante igualmente importante, reduz o dissulfureto de glutationa ou glutationa oxidada (GSSG) à forma de sulfidrilo, GSH, pelo mecanismo dependente de NADPH, sendo sua função manter a concentração celular de GSH alta e a sua forma oxidada, GSSG, baixa (JOZEFCZAK et al., 2012). Destarte, os níveis de defesas antioxidantes
disponíveis dentro das células e extracelularmente deve ser suficiente para contrapor-se aos seus efeitos tóxicos das ERO e para manutenção da fisiologia normal do organismo.
Durante todo esse processo inflamatório, as células inflamatórias secretam citocinas importantes já mencionadas, como TNF-α e IL-1β, as quais possuem muitas vezes, papéis sobrepostos, atuando na ativação e progressão da inflamação, por meio de mecanismos de liberação de quimiocinas, responsáveis pela afinidade das integrinas de leucócitos por seus ligantes (ICAM-1 e VCAM-1) (ABBAS, A. K.; LICHTMAN; PILLAI, 2015). Adicionalmente, TNF-α e IL-1β atuam na modulação de respostas imunes pró-inflamatórias, atuando na diferenciação de células Th17, inibição de Tregs e ativação do fator de transcrição
3, STAT3 (HNATYSZYN et al., 2019), as quais tiveram seus níveis reduzidos no pré- tratamento com IA nas doses de 50 e 100 mg/kg e SSZ em comparação ao controle DNBS.
Importante destacar que a IL-17, produzida pelas células Th17 possui potente ação no combate de patógenos extracelulares. Todavia, está associda a patogenicidade da DII e progressão da inflamação intestinal ao desenvolvimento do câncer colorretal (CCR), assim como em respostas imunes de estágios avançados de CCR (KEMPSKI et al., 2017; MAO et al., 2016; SHARP et al., 2017), a qual não foi detectada pela análise imuno-histoquímica no pré-tratamento com a SSZ e dose de 100 mg/kg de IA.
Quanto à sinalização para ativação de STAT3, que é ativado principalmente por citocinas inflamatórias ligadas aos receptores Janus Quinase-JAK (PANDURANGAN; ESA, 2014), possui papel importante na progressão da inflamação intestinal, atuando tanto como oncogene quanto supressor tumoral, dependendo de sua modulação. Em células epiteliais intestinais, STAT3 reduz a formação precoce de lesões pré-neoplásicas. Não obstante, a ablação de STAT3 durante a progressão tumoral aumentou significativamente a invasividade de tumores, demostrando um papel de duplicidade (MARCHIORI et al., (2019). Assim, a inibição do fator STAT3 durante processos inflamatórios intestinais pode estar associada a efeitos benefícios na DII, fato observado durante este experimento. Adicionalmente, a inibição da ativação de STAT3 pelas citocinas inflamatórias pode explicar a redução da progressão da inflamação intestinal (LIANG et al., 2013).
Ademais, a ativação de MAPKs como a JNK1, também desempenha um papel crítico na ativação da via de sinalização do NF-κB. O NF-κB medeia à transdução de sinal intracelular que envolve a expressão de citocinas pró-inflamatórias como IL-1β, IL-6, TNF-α e IL-17 (SAKTHIVEL; GURUVAYOORAPPAN, 2013; YOU et al., 2017) e possui papel importante na inflamação intestinal e carcinogênese associada à colite, visto que é
constitutivamente ativado no tecido de CCR humano (MASAYUKI KOJIMA et al., 2004). Dessa forma, a diminuição na expressão de JNK1 e do NF-κB e a modulação de citocinas inflamatórias, em especial TNF-α e IL-17, que possuem papel importante no processo mitótico e ativação do NF-κB (DE SIMONE et al. 2015), mostram que o pré-tratamento com IA na dose de 100 mg/kg e SSZ conseguiram reduzir o processo inflamatório intestinal causado pelo DNBS, ao que tudo indica pela inibição da via de sinalização da JNK1 e do NF- κB. Liu et al. (2019) mostraram que a inibição de JNK reduziu significativamente a carcinogênese associada à colite em camundongos, inibindo a proliferação de células do epitélio intestinal, demonstrando assim, papel crucial na carcinogênese do câncer colorretal e controle da progressão do dano tecidual na inflamação intestinal (FANG; RICHARDSON, 2005).
Outro marcador importante no controle da inflamação intestinal são os níveis de IL-10 expressas nas células da mucosa intestinal. Está documentado que pacientes com DII apresentam uma correlação da atividade da doença com os de níveis séricos de citocinas inflamatórias e anti-inflamatórias, como a IL-10 (LJUCA et al., 2010). Sendo que a IL-10 parece apresentar-se elevada no momento da resolução da doença, voltando a níveis basais logo após, podendo ser usada para acompanhamento da evolução da doença (LJUCA et al., 2010; MITSUYAMA et al., 2006). Dessa forma, um aumento nos níveis de IL-10, importante citocina no controle e regulação da reposta imune intestinal (MANZANILLO; EIDENSCHENK; OUYANG, 2015), e redução significativa na concentração e expressão de citocinas inflamatórias com o pré-tratamento com IA e SSZ em comparação ao controle DNBS, mostra uma modulação dessas citocinas. Adicionalmente, um aumento na expressão de MUC2 e SOCS1, mostra que esses componentes atuaram conjuntamente na manutenção da citoarquitetura tecidual, evidenciado pela análise do IDM e histologia dos cólons.
MUC2, glicoproteína secretada pelas células caliciformes, forma uma camada em gel na mucosa colônica que juntamente com as defensinas (peptídeos antimicrobianos) agem no impedimento da colonização por patógenos, ao mesmo tempo em que protegem a microbiota endógena (COBO et al., 2015). Sendo assim, MUC2 atua como mecanismo de barreira do eptélio intestinal (TAWIAH et al., 2018) e sua disfunção contibui com a patogênese da DII (COBO et al., 2015; TADESSE et al., 2017; TAWIAH et al., 2018) e pode levar até mesmo, ao desenvolvimento de tumores espontâneos no trato gastrointestinal (YANG et al., 2008).
Enquanto SOCS1, que atua como um supressor de IFNs do tipo I e III, envolvido na diferenciação e regulação do fenótipo de macrófagos (LIU et al., 2015; MCCORMICK; HELLER, 2015), além de regulação da sinalização celular em resposta à estimulação por citocinas (ZHANG et al., 2016), faz parte de um circuito de feedback negativo, modulando a sinalização por mecanismos que envolvem a inativação das JAKs e bloqueio da ativação dos transdutores de sinal ou ativadores da transcrição (KREBS; HILTON, 2001). Além disso, SOCS1 possui papel importante durante processos inflamatórios, já que previne a produção de citocinas inflamatórias, pela inibição da conversão de Tregs em células do tipo Th1 ou Th17
(YOSHIMURA et al., 2012).
Neste contexto, destacamos os polifenóis como substâncias bioativas mais utilizadas na fitoterapia (DING; JIANG; FANG, 2018), que compreendem flavonóides, fenóis, ácidos fenólicos, ligninas e taninos (BHATTACHARYYA et al., 2014). Os polifenois possuem mecaniamos de ação envolvidos na modulação da reposta inume, decorrente de suas ligações a determinados receptores celulares (DING; JIANG; FANG, 2018). Evidências sugerem que os polifenois apresentam respostas benéficas na colite, especialmente pela modulação da via do NF-κB (DE ASSIS et al., 2019; KAULMANN; BOHN, 2016; LEWANDOWSKA et al., 2016; SALARITABAR et al., 2017), o que está de acordo com os resultados apresentados, demostrando que IA pode ter exercido atividade anti-inflamatória pela via de sinalização do NF-κB.
Vezza et al. (2016) relatam atividade positiva dos flavonoides na inflamação intestinal em modelos de colite experimental em roedores. Rutina, favonol glicosídico presente no extrato IA, demonstrou exercer efeitos anti-inflamatórios intestinal em modelo de colite experimental de transferência de células T CD4+ CD62L+ (MASCARAQUE et al., 2014), além de ter apresentado boa atividade anti-inflamatória intestinal pela modulação da microbiota intestinal em animais induzidos à colite por DSS (POWER et al., 2016).
Vale ressaltar que o ácido clorogênico, presente no extrato, minimizou a inflamação intestinal induzida por cádmio em ratos, pela redução dos danos às vilosidades intestinais (XUE et al., 2019); reduziu o dano na mucosa intestinal, o estresse oxidativo e a apoptose de células do cólon, mecanismos associados à via de sinalização MAPK / ERK / JNK (GAO et al., 2019); ainda, em animais C57BL, o ácido clorogênico (1 mM) coadministrado com DSS, mostrou redução dos sinais clínicos da DII e da infiltração colônica por macrófagos e neutrófilos e dowregulation para expressão de IFN-γ, TNF, IL-6 e NF-κB (ZHANG et al., 2017).
Ao ácido cafeico, também presente no extrato de IA, neutralizou efeitos do LPS em células RAW 264.7, o que levou ao dowregulation de iNOS, TNF-α e IL-6 (SCHRÖTER et al., 2019); inibição da fosforilação de STAT3, Akt e IkB também em células RAW 264.7, induzidas por LPS (KWON et al., 2019).
Em suma, os resultados apresentados mostram que o extrato de Ipomoea
asarifolia promoveu efeito preventivo frente ao processo inflamatório intestinal provocado
pelo DNBS e pode ser considerado seguro nas condições avaliadas, pois não foram observados sinais de toxicidade por meio das análises realizadas durante os ensaios de toxicidade aguda e subcrônica.
7 CONCLUSÃO
Os resultados obtidos indicam que o extrato aquoso das folhas de I. asarifolia é seguro nas condições pré-estabelecidas, cuja Dose Letal 50 (DL50) estimada foi acima de
2000 mg/kg, enquadradando-se na classe 5 do Sistema Globalmente Harmonizado, que corresponde a compostos com pouca ou sem nehuma toxicidade. O extrato de I. asarifolia também exerceu efeito protetor frente à inflamação intestinal induzida pelo DNBS, por modulação da reposta inflamatória intestinal, mostrando potencial no manejo da DII humana e com perpectivas de vir a ser utilizado como um medicamento fitoterápico adjuvante na DII, mediante mais estudos com o extrato.
REFERÊNCIAS
ABBAS, A. K.; LICHTMAN, A. H.; PILLAI, S. Imunologia Celular e Molecular. 8a Edição, ed. Rio de Janeiro: Elsevier, 2015.
ABRAHAM, C.; CHO, J. H. Inflammatory Bowel Disease. New England Journal of
Medicine, v. 361, n. 21, p. 2066–2078, nov, 2009.
AKINDELE, A. J.; UNACHUKWU, E. G.; OSIAGWU, D. D. 90 Days toxicological assessment of hydroethanolic leaf extract of Ipomoea asarifolia (Desr.) Roem. and Schult. (Convolvulaceae) in rats. Journal of Ethnopharmacology, v. 174, p. 582-594, nov, 2015. ALATAB, S. et al. The global, regional, and national burden of inflammatory bowel disease in 195 countries and territories, 1990–2017: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2017. The Lancet Gastroenterology and Hepatology, v. 5, n. 1, p. 17–30, oct, 2019.
AMBRIZ-PEREZ, D. L. et al. Phenolic compounds: Natural alternative in inflammation treatment. A Review. Cogent Food & Agriculture, v. 2, n. 1, jan, 2016.
ANDERSON, M. E. Determination of Glutathione and Glutathione Disulfide in Biological Samples. Methods Enzymol, v. 113, p. 548–555, 1985.
ARAÚJO, D. F. DE S. et al. Goat whey ameliorates intestinal inflammation on acetic acid- induced colitis in rats. Journal of Dairy Science, v. 99, p. 1–12, dec, 2016.
ARAÚJO, D. F. S. et al. Intestinal anti-inflammatory effects of goat whey on DNBS-induced colitis in mice. PLOS ONE, v. 12, n. 9, p. e0185382, sept, 2017.
ARAÚJO, J. A. S. et al. Intoxicação experimental por Ipomoea asarifolia (Convolvulaceae) em caprinos e ovinos. Pesquisa Veterinária Brasileira, v. 28, n. 10, p. 488–494, oct, 2008. ARYAL, S. et al. Total Phenolic content, Flavonoid content and antioxidant potential of wild vegetables from western Nepal. Plants, v. 8, n. 4, apr, 2019.
BARBOSA, J. D. et al. Intoxicações experimental e natural por Ipomoea asarifolia
(Convolvulaceae) em búfalos e outros ruminantes. Pesquisa Veterinaria Brasileira, v. 25, n. 4, p. 231−234, dec, 2005.
búfalos na Ilha de Marajó, Pará. Pesquisa Veterinaria Brasileira, n. 22, v. 3, p. 682−713, sept, 2012.
BELL, C. J.; GALL, D. G.; WALLACE, J. L. Disruption of colonic electrolyte transport in experimental colitis. American Journal of Gastroenterology, v. 268 p. Pt
1, G622–G630, may, 1995.
BHATTACHARYYA, A. et al. Oxidative stress: an essential factor in the pathogenesis of gastrointestinal mucosal diseases. Physiological reviews, v. 94, n. 2, p. 329–54, apr, 2014. BIANCONE, L. et al. Safety of treatments for inflammatory bowel disease: Clinical practice guidelines of the Italian Group for the Study of Inflammatory Bowel Disease (IG-IBD).
Digestive and liver disease : official journal of the Italian Society of Gastroenterology and the Italian Association for the Study of the Liver, v. 49, n. 4, p. 338–358, apr, 2017.
BOMPART, G. J.; PRÉVOT, D. S.; BASCANDS, J. L. Rapid automated analysis of
glutathione reductase, peroxidase, and S-transferase activity: application to cisplatin-induced toxicity. Clinical biochemistry, v. 23, n. 6, p. 501–4, dec, 1990.
BRASIL. DIRETRIZES DA PRÁTICA DE EUTANÁSIA DO CONCEA. Resolução
Normativa N 13, 20 de novembro de 2013, 2013.
BROOKS, S. P.; DUNNETT, S. B. Tests to assess motor phenotype in mice: A user’s guide.
Nature Reviews Neuroscience, v. 10, n. 7, p. 519–529, jun, 2009.
BRUMATTI, L. et al. Curcumin and Inflammatory Bowel Disease: Potential and Limits of Innovative Treatments. Molecules, v. 19, n. 12, p. 21127–21153, dec, 2014.