Avaliação do rendimento médio e caracterização química dos constituintes dos óleos essenciais das folhas de Lippia alba N.E.Brown, quimiotipo I, II e III.

Alguns trabalhos comprovam a existência da variabilidade na composição química do óleo essencial da espécie L. alba, chamados de quimiotipos, o que deve ser levado como um fator importante para se determinar que influência esta variabilidade exerce sobre as diferentes atividades farmacológicas. Esses quimiotipos são separados de acordo com as variações quantitativas e qualitativas da composição de seus óleos essenciais (JULIÃO et al, 2003; CASTRO et al, 2001; MATOS, 1996; GOMES et al, 1993).

No presente trabalho, a quantidade de óleo essencial de folhas, extraída pela técnica de destilação com arraste de vapor d’água (MATOS, 1996) e medido em mL/g de peso da planta fresca, variou de acordo com os quimiotipos I, II e III de Lippia alba. Como mostrado na Tabela 02 o menor rendimento foi observado no quimiotipo I (0,08%), seguido dos quimiotipos III (0,25%) e II (0,40%).

Alguns trabalhos mostram que a quantidade de óleo essencial varia de acordo com a época do ano na qual foi extraído. TAVARES et al (2005), analisando o óleo essencial de folhas de três quimiotipos de L. alba, cultivadas em condições semelhantes, a fim de verificar se as diferenças na composição do óleo essencial devem-se a fatores ambientais ou a variação genética, observou que o menor rendimento do óleo essencial foi na época em que as plantas encontravam-se em floração. Na época da floração, de agosto a novembro, o rendimento foi

de 0,15%, 0,40% e 0,40%, respectivamente para os quimiotipos I, II e III. Já durante o crescimento vegetativo, dezembro a março, o rendimento foi de 0,30% para o quimiotipo I, 0,50% para o quimiotipo II e 0,60% para o quimiotipo III. Da mesma forma, ATTI et al (2002) concluíram que para a espécie L. alba, a maior produção de óleo essencial ocorre na fase de crescimento (dezembro a março).

Embora no nosso trabalho não tenha sido feito um estudo comparativo entre épocas do ano, pois as plantas foram cultivadas no Horto de Plantas Medicinais Prof. Francisco José de Abreu Matos do Laboratório de Plantas Medicinais da UFC, em condições semelhantes, e coletadas, para a extração de óleo essencial, no período de agosto a dezembro, sempre no mesmo horário (entre 8:00 às 9:00h), observa-se que quando comparada com outros estudos, o rendimento dos óleos essenciais de L. alba, pode ser considerado baixo, principalmente para o quimiotipo I (0,08%), seguido do quimiotipo III (0,25%) e do II (0,40%). De acordo com TAVARES et al (2005) e ATTI et al (2002) isso pode ser explicado, pela época do ano na qual foram coletadas as plantas e extraído os óleos essenciais.

Já em relação à composição do óleo essencial analisado por cromatografia gasosa com detecção por espectrometria de massa (CG-MS), foi confirmado que realmente existem diferenças nos constituintes químicos dos óleos essenciais das folhas de L. alba. Para o quimiotipo I, os componentes majoritários foram o geranial, neral e o mirceno, o que correspondem, respectivamente, a 31,69%, 21,61% e 12,15% do total de teor do óleo essencial (Figura 07). Já para o quimiotipo II, os principais componentes foram o geranial (46,31%) e neral (32,67%) (Figura 08) e para o quimiotipo III com teores elevados de carvona (64,5%) e limoneno (16,67%) e ausência de citral (Figura 09).

Outros constituintes também foram encontrado nos óleos essenciais das folhas de L. alba, quimiotipo I, II e III, porém em menores porcentagens (Tabela 03). Verifica que alguns compostos foram produzidos exclusivamente no quimiotipo I como o Mirceno, - Ocimeno, Citronelol, Nerol, α-Cubebeno, -Elemeno, -Cariofileno, α-Humuleno, Allo- aromadendreno, δ-Cadineno e Oxido de cariofileno; no quimiotipo II como o -Citronelol, trans Geraniol e E-Nerolidol; e no quimiotipo III como o Sabineno, -Mirceno, trans e cis Hidratato de sabineno, Carvona e Timol.

TAVARES et al (2005), analisando a composição dos óleos essenciais de L. alba, observou que para o quimiotipo I foram identificados 29 componentes, dos quais o geranial e o neral foram os constituintes majoritários. Já o quimiotipo II, dos 26 componentes

identificados, os principais foram o limoneno, a carvona e o germacreno D, e para o quimiotipo III, o linalol foi o majoritário dos 42 constituintes identificados.

Esses autores, concluíram que a diversidade na composição do óleo essencial dos quimiotipos da L. alba não se deve a fatores ambientais, já que as plantas analisadas cultivadas lado a lado, em um mesmo canteiro, por mais de um ano, mantiveram a composição original. Observaram também que não ocorreu variação qualitativa dos componentes majoritários nos dois períodos de vida da espécie L. alba, no crescimento vegetativo e no período da floração. Por outro lado, a análise quantitativa desses elementos, mostrou que a porcentagem de citral, carvona e linalol sofreu uma ligeira diminuição durante a época de floração ao passo que houve aumento na porcentagem do limoneno.

NOGUEIRA et al (2007), relacionando a caracterização química e atividade biológica do óleo essencial de L. alba cultivada no Paraná, considerando as diferentes estações do ano (primavera, verão, outono e inverno), observaram que os melhores rendimentos de óleo essencial foram das folhas coletadas na primavera (novembro) e verão (fevereiro), apresentando teores de 0,54% e 0,38%, respectivamente, e que também, nessa época, foi maior a produção do constituinte químico majoritário, o composto trans- dihidrocarvona. Dos 15 compostos identificados, o trans-dihidrocarvona, não foi produzido nas outras épocas do ano (inverno e outono).

SILVA et al (2006) relatam que quanto à caracterização química do óleo essencial da L. alba cultivada em Ilhéus-Ba, considerando as diferentes estações do ano, durante a primavera (outubro), outono (abril) e verão (janeiro) foram obtidos rendimentos similares de óleos essenciais, variando de 0,19% a 0,17%, sendo observado o menor rendimento no inverno (julho), 0,12%. Neste estudo, foram identificados 24 compostos, sendo o componente majoritário o citral, que variou de 70 a 79%.

Esses dois autores, SILVA (2006) e NOGUEIRA (2007), concluíram que tanto a constituição química como as porcentagens relativas das diferentes amostras do óleo essencial foram alteradas nas diferentes estações do ano (primavera, outono, verão e inverno).

Em 2001, LORENZO analisando a composição do óleo essencial da L. alba, identificaram 27 componentes e referiram o linalol como o constituinte majoritário (55%). RAO et al (2000) identificaram 50 componentes e os principais constituintes foram o geranial (15,57%), seguido por uma mistura de mirteno e mirtenal (9,89%), neral (9,44%), e geraniol (7,36%). ZOGHBI et al (1998), estudando os óleos essenciais dessa mesma espécie, propuseram a divisão em três grupos segundo seus componentes: grupo A, caracterizado por

1,8 cineol (34,9%), limoneno (18,4%), carvona (31,8%) e sabineno (8,2%); grupo B, caracterizado por limoneno (32,1%), carvona (31,8%) e mirceno (11%); e grupo C, caracterizado por neral (13,7%), geranial (22,5%), germacreno-D (25,4%) e α-cariofileno (10,2%).

Aqui no Ceará, alguns estudos mostram a variação na composição dos óleos essenciais das folhas de L. alba. VALE (1999), fez estudos comparativos dos óleos essenciais de três quimiotipos de L. alba, os quais foram definidos segundo a predominância de monoterpenos em seus óleos essenciais: tipo I – com citral e mirceno; tipo II – com citral e limoneno e tipo III – com carvona e limoneno. Já MATTOS (1996) caracterizou em grupos a espécie L. alba de acordo com os teores elevados dos óleos essenciais em: tipo I, com teores elevados de mirceno e citral; tipo II com teores elevados de limoneno e citral; tipo III com limoneno e carvona e ausência de citral.

A classificação proposta por estes dois autores VALE (1999) e MATTOS (1996), está semelhante aos dados encontrados no presente estudo, no qual os óleos essenciais das folhas de L. alba podem ser classificados quanto aos seus componente majoritários em quimiotipo I – com geranial, neral e mirceno (Figura 07); quimiotipo II – com geranial e neral (Figura 08); e quimiotipo III – com carvona e limoneno e ausência de citral (mistura de geranial e neral) (Figura 09).

Assim, os dados obtidos neste trabalho juntamente com os encontrados na literatura, reforçam a idéia de que as plantas de diferentes regiões podem apresentar variações na composição química dos óleos essenciais, mesmo sendo de plantas da mesma espécie, como no caso da L. alba; que a variação nos componentes dos óleos essenciais de L. alba leva a separação em quimiotipos; que essa variação é um fator importante em estudos de atividades biológicas do óleo essencial da L. alba N. E. Brwon; e que no geral, os constituintes carvona, mirceno, neral, geranial, limoneno, germacreno estão presentes no óleo essencial das folhas de L. alba. Apesar de não ter sido feito neste trabalho, também vale ressaltar que fatores ambientais, genético e de técnicas de cultivo devem ser fatores que

influenciam e que refletem na composição química do óleo essencial da L. alba.

5.2 Avaliação do potencial antimicrobiano, determinação da Concentração Inibitória Mínima (CIM) e da Concentração Letal Mínima (CLM) dos óleos essenciais das folhas de Lippia alba, quimiotipos I, II e III.

É consenso a necessidade de introdução de novos compostos bioativos no arsenal terapêutico com efeito antimicrobiano, devido principalmente ao aparecimento de cepas microbianas resistentes, decorrente, sobretudo, do uso indiscriminado de antimicrobianos.

Óleos essenciais e extratos de plantas há muito tempo tem sido usado em diversas aplicações na medicina popular, entre elas, podemos citar o uso de anti-sépticos tópicos. Tal realidade serve de base para várias investigações científicas com a finalidade de confirmar a atividade antimicrobiana desses óleos essenciais (FERESIN et al, 2001).

Alguns estudos realizados com as espécies do gênero Lippia fornecem importantes evidencias de seus potenciais efeitos farmacológicos, incentivando a realização de pesquisas que esclareçam novos aspectos. Alguns estudos confirmam o potencial farmacológico dos óleos essenciais da Lippia alba: atividade analgésica (VIANA et al, 1998); atividade antiinflamatória (SLOWING BARRILAS, 1992; DO VALE et al, 2002); atividade anticonvulsivante (VIANA et al, 2000); atividade antiviral (ABAD et al, 1997); e atividade calmante (VALE et al, 2002). No entanto, embora muitas pesquisas anteriores demonstrem diversas atividades biológicas, trabalhos que relacionem a composição dos diferentes quimiotipos da espécie L. alba com suas atividades biológicas ainda são muito escassos ou quase inexistentes.

Atualmente existem diversas técnicas usadas em pesquisas para definir se uma determinada substância possui atividade antimicrobiana. No entanto um dos grandes problemas encontrado nestas pesquisas é justamente a falta de uniformidade nos critérios selecionados para estudar tal atividade (TORTORA et al, 2000). RIOS et al, na tentativa de solucionar a falta de uniformidade nos critérios de seleção para o estudo da atividade antimicrobiana, propuseram os métodos de difusão em ágar e de diluição em caldo de cultura como métodos padrões para o estudo de extratos de plantas e de óleos essenciais, bem como de seus compostos. Na realidade, para se obter resultados mais confiáveis, a realização de pesquisas que utilizam mais de um método para se avaliar a atividade antimicrobiana, é uma excelente alternativa.

Os óleos essenciais são misturas complexas de compostos com possíveis atividades biológicas. Sua atividade antimicrobiana pode ser determinada pela atividade de seus constituintes individuais, que podem interagir resultando em efeitos sinérgicos vantajosos (ABOUL et al, 1996; PATTNAIK et al, 1995), mas também em efeitos antagonistas desvantajosos, enfraquecendo a ação do óleo quando comparada com seus constituintes (CARSON et al, 1995).

A maioria dos óleos essenciais é constituído de derivados fenilpropanoídes ou de terpenos, sendo os compostos terpênicos predominantes (SIMÕES et al, 2002) e um dos principais responsáveis pela atividade antimicrobiana dos óleos.

Comparando a composição dos óleos essenciais de folhas dos três quimiotipos de L. alba (Tabela 03) podemos observar relevantes diferenças quantitativa e qualitativa entre eles. Os constituintes majoritários dos quimiotipos I, II e III, aos quais podemos atribuir o potencial antimicrobiano de cada óleo foram: citral-mirceno (53,30-12,15%), citral-limoneno (78,98-4,35%) e carvona-limoneno (64,25-16,67%) respectivamente. Foram observadas também variações quantitativas e qualitativas para os constituintes minoritários presentes nos três óleos essenciais.

Como mostrado nas Tabelas 04 e 05, os óleos essenciais dos três quimiotipos de L. alba apresentam um amplo espectro de ação antimicrobiana, sendo capazes de inibir o crescimento de bactérias Gram-positivas, bactérias Gram-negativas e C. albicans, o que pode ser atribuído a alta concentração de terpenos em sua composição. Estudos anteriores têm demonstrado a ampla atividade antimicrobiana dos terpenos, por um mecanismo de ação não totalmente elucidado, que parece estar associado ao seu caráter lipofílico, determinando um acúmulo em membranas e perda de energia pelas células (CONNER, 1993; SIKKEMA et al, 1995). Acredita-se que esse acúmulo ative e/ou inative compostos, rompendo e/ou desestruturando as membranas, agindo sobre compostos lipofílicos e causando a perda de enzimas e nutrientes presentes na membrana celular (COWAN, 1999; DORMAN E DEANS, 2000; WILKENS, 2002).

As diferenças nos potenciais antimicrobianos constatados para os óleos essenciais dos três quimiotipos (Tabelas 04 e 05) podem estar associadas às suas diferentes composições químicas (Tabela 03), especialmente em relação aos constituintes majoritários presentes em cada um dos óleos. O óleo essencial do quimiotipo III, o único entre os três óleos estudados a não apresentar citral (uma mistura de neral e geranial) em sua composição, constituintes majoritários dos óleos dos quimiotipos I e II, também demonstrou a menor atividade antimicrobiana sobre todas as cepas testadas.

O menor potencial antimicrobiano constatado para o óleo essencial de folhas do quimiotipo III, sobre todas as cepas testadas, pode estar relacionado à sua composição e especialmente à ausência de citral (neral e geranial). Os constituintes majoritários desse óleo essencial são carvona (64,25%) e limoneno (16,67%). Embora CARVALHO & FONSECA (2006) considerem a carvona um importante agente antimicrobiano, estudos realizados por

SCHUCK et al (2001) demonstraram uma reduzida atividade antimicrobiana para limoneno sobre S. aureus ATCC 6358, E. coli ATCC 25922 e C. albicans ATCC 10231 quando comparado ao citral. ONAWUNMI et al (1984) fizeram constatações semelhantes, ao verificarem que a atividade antibacteriana do óleo essencial de Cymbopogon citratus (DC.) Stapf é devida, principalmente, à presença de citral, seu componente majoritário e que outros componentes como limoneno e a heptanona não demonstraram atividade frente aos microrganismos ensaiados.

Essas diferenças ressaltam o efeito da estrutura do terpeno sobre sua atividade antimicrobiana, mas devemos também considerar a influencia da possível ação sinérgica dos vários componente do óleo essencial, mesmo que em baixas concentrações, e da presença de substâncias inibidoras da atividade antimicrobiana.

O elevado potencial antimicrobiano do citral, relatados nos trabalhos de ONAWUNMI et al (1944) e SCHUCK et al (2001), também foi constatado em nosso estudo, em que os óleos essenciais de folhas dos quimiotipos I e II de L. alba, ricos em citral (53,30 e 78,98%, respectivamente), determinaram grande inibição no crescimento de bactérias Gram- positivas e de C. albicans. O óleo essencial de folhas do quimiotipo II, com teor de citral 25,68% superior ao encontrado no quimiotipo I, apresentou os mais elevados potenciais antimicrobianos e o maior espectro de ação, sendo capaz de inibir o crescimento de bactérias Gram-positivas e Gram-negativas, provenientes da ATCC e de origem hospitalar, e de C. albicans, em um total de 63,63% das cepas microbianas testadas.

A maior atividade antimicrobiana dos óleos essenciais de L. alba sobre a cepa Gram-positiva S. aureus e a levedura C. albicans, do que sobre bactérias Gram-negativas, estão de acordo com os resultados de ALEA et al (1997), ao testarem seu potencial inibitório sobre B. subitilis e E. faecalis e RAO et al (2000) que comprovaram sua ação antifúngica.

Em nosso estudo foi testado um total de sete cepas de bactérias Gram-negativas, das quais, menos da metade (42,86%), tiveram seu crescimento inibido quando expostas aos óleos essenciais de L. alba. As maiores atividades antimicrobiana sobre bactérias Gram- negativas foram observadas para os óleos essenciais do quimiotipo II, com CIM e CLM de 0,625 mg/mL para E. coli e A. lwoffi e do quimiotipo I para A. lwoffi (Tabela 06).

O mecanismo de ação de alguns óleos essenciais, como exemplo, o óleo de Melaleuca alternifolia, usado contra E. coli, causa a desnaturação de proteínas de membrana, o que resulta no rompimento de sua membrana externa e subsequente perda de potássio, inibição da respiração e lise celular (COX et al, 1998).

A ação de óleos essenciais sobre bactérias Gram-positivas e fungos parece ocorrer através do mesmo mecanismo. Os compostos do óleo destroem a parede celular e a membrana citoplasmática dos microrganismos resultando assim na liberação e coagulação dos compostos do citoplasma (MANN et al, 2000)

Nossos resultados, em concordância com os de muitos pesquisadores, constatam a menor suscetibilidade das bactérias Gram-negativas, aos óleos essenciais testados, o que pode ser atribuído à presença de uma camada externa de natureza lipopolissacarídeo. As drogas que conseguem penetrar facilmente em bactérias Gram-negativas, utilizam as porinas, devendo ser relativamente pequenas e preferencialmente hidrofílicas. Compostos terpênicos, constituintes majoritários dos óleos essenciais de L. alba, são especialmente grandes e incapazes de penetrar prontamente em bactérias Gram-negativas (TORTORA et al., 2000; KONEMAN et al., 2001; TAVARES, 2001).

A atividade antimicrobiana dos óleos de L. alba mostrou-se do tipo dose- dependente, para todas as cepas testadas. Os maiores halos de inibição foram determinados pela ação do óleo essencial do quimiotipo II sobre C. albicans (43 mm), que também apresentou a menor concentração capaz de determinar a formação de halo de inibição de crescimento pelo método de difusão em ágar (6,25mg/mL). Quando testados pelo método da microdiluição em microplacas, a CIM desse óleo sobre C. albicans foi de 3,12mg/mL, o que pode ser atribuído à baixa capacidade de difusão dos óleos essenciais em meio sólido. Resultados semelhantes foram obtidos para a maioria das cepas testadas. Esses achados reforçam a importância de que compostos com potencial antimicrobiano, determinado previamente pelo método de difusão em ágar, devem ser testados pelos métodos da diluição em caldo de cultura, o qual fornece resultados mais precisos e possibilitam a determinação da CLM.

Alguns fatores podem interferir nos resultados obtidos pelo método de difusão em ágar como a densidade do crescimento microbiano e a solubilidade da substância testada (LAMBERT et al, 2001; HOOD et al, 2003). Além disso, uma importante desvantagem desta técnica é que não possibilita determinar se uma droga é bactericida ou se é simplesmente bacteriostática (TORTORA et al, 2000), como no caso dos métodos de diluição.

Embora a técnica de difusão em ágar apresente limitações e nem sempre forneça resultados compatíveis com as técnicas da diluição, nossos resultados indicam ser essa técnica de grande utilidade, quando realizada em uma etapa preliminar e em associação com outras,

na determinação do potencial antimicrobiano, para a seleção de drogas com possível eficácia, pois permite obter informações gerais sobre esse efeito.

O método da diluição em caldo de cultura pode ser realizado em tubos de ensaio ou em placas de microdiluição e a CIM é determinada pela inspeção visual do crescimento microbiano após 24h de incubação. A CIM pode também ser obtida através da determinação da densidade ótica em leitor de ELISA, que alem de fornecer a CIM, possibilita entender a cinética de inibição do crescimento microbiano.

Os métodos de diluição em caldo de cultura para determinação da CIM possibilitam a obtenção da CLM, o que é de grande importância clínica, pois torna possível evitar ou diminuir o uso excessivo ou errôneo de um determinado antibiótico, minimizando a ocorrência de reações adversas (NASCIMENTO et al, 2000) e a seleção de cepas microbianas resistentes.

Nesse trabalho foram determinadas as CIM e CLM, pelos métodos da microdiluição e do plaqueamento em meio sólido, respectivamente, para todas as cepas testadas pela técnica de difusão em ágar, mesmo para aquelas que se mostraram resistentes.

As mais baixas CIM e CLM obtidas para os óleos essenciais dos quimiotipos I, II e III, foram de 0,312 e 0,625mg/mL, 0,312 e 0,312mg/mL e 0,625 e 0,625mg/mL, respectivamente. Para as bactérias Gram-negativas que não apresentaram qualquer suscetibilidade aos óleos testados quando submetidas ao ensaio de difusão, também não foi possível encontrar as CIM e CLM, assim, consideramos essas concentrações superiores a 20mg/mL.

Segundo TAVARES (2001), no tratamento de infecção bacteriana ou fúngica deve-se utilizar preferencialmente droga com ação letal sobre o agente etiológico, droga bactericida ou fungicida, respectivamente, pois a droga por si só é capaz de provocar a morte do germe, não havendo grande dependência das defesas orgânicas, principalmente em pacientes com deficiências em sua imunidade, incluindo os recém-nascidos, paciente idoso, gestante, pacientes com doença que alteram a imunidade ou que estão em uso de drogas imunossupressoras. Essa situação foi constatada para cinco das 11 (45,45%) cepas testadas: o óleo do quimiotipo I sobre A. lwoffi e S. aureus 1, do quimiotipo II sobre E. coli ATCCC 10536, C. albicans ATCC 10231 e A. lwoffi e A. baumannii e, do quimiotipo III sobre A. lwoffi, A. baumannii e S. aureus 1. As cepas A. lwoffi, S. aureus 1 e A. baumannii são de origem hospitalar e apresentam perfil de multirresistência.

A excelente atividade antimicrobiana constatada para os óleos essenciais dos três quimiotipos de L. alba sobre cepas bacteriana Gram-positivas e Gram-negativas e C. albicans, inclusive sobre cepas multirresistentes de origem hospitalar, alem de reforçar a grande importância dos estudos das atividades biológicas de L. alba, especialmente da determinação do potencial antimicrobiano de seus óleos essenciais e explicar seu uso popular, sugere serem esses óleos possíveis candidatos ao desenvolvimento de fármacos úteis no tratamento de doenças infecciosas.

Para determinação do potencial antimicrobiano dos óleos essenciais de L. alba sobre cepas microbianas com perfil de multirresistência (Tabela 01), foram utilizadas seis cepas pertencentes a quatro gêneros bacterianos: três Gram-negativos (Acinetobacter, Klebisiella e Escherichia) e um Gram-positivo (Staphylococcus). Todas as cepas foram isoladas de espécimes clínicos (líquidos corporais) de origem hospitalar e submetidas aos testes de sensibilidade a antimicrobianos. Com exceção da espécie E. coli, resistente a 41,18% dos antibióticos testados, as demais cepas foram resistentes mais de 72% dos antibióticos. Duas dessas cepas (33,33%), E. coli e K. pneumoniae, foram resistentes aos três óleos essenciais, nas concentrações testadas; A lwoffi e S. aureus 1 foram sensíveis aos três óleos; A. baumannii foi sensível aos óleos dos quimiotipos II e III; e S. aureus 2 aos quimiotipos I e II. Sendo o quimiotipo II o de maior atividade sobre a maioria dessas cepas, apresentando geralmente as menores CIM e CLM, quando comparadas às determinadas pelos quimiotipos I