Avaliação da solubilidade proteína das micropartículas em simulação das condições

As micropartículas, contendo a mais alta quantidade de proteína adsorvida (10% de proteína em solução), foram submetidas a condições simuladas gástrica e intestinal (pH 2 e 7 contendo enzimas proteolíticas e temperatura controlada), para a avaliação da solubilidade proteica das proteínas adsorvidas sobre as micropartículas.

Os resultados mostraram que após 2 horas de incubação nas condições gástricas, pH 2 (Tabela 6), as partículas revestidas com gelatina e hidrolisado Collagel solubilizaram uma menor porcentagem de proteína em relação ao hidrolisado Fortigel, atingindo valores de 39,08%, 41,79% e 49,00%, respectivamente de solubilização proteica em relação às quantidades proteicas inicialmente aderidas as partículas, porém sem diferenças significativas entre si. Esses resultados parecem indicar que as condições gástricas (pepsina, pH acido) afetaram de forma semelhante a gelatina, o Collagel e o Fortigel, independente da forma como os hidrolisados foram obtidos (hidrolise acida ou enzimática, tipo de enzima, intensidade durante o processo de hidrolise).

Tabela 6. Avaliação da solubilidade de proteínas e dos hidrolisados proteicos das micropartículas quando 10% de proteína ou dos hidrolisados em solução foram utilizados. Produtos Tempo de digestão Gástrico pH 2 (%) Entérico pH 7 (%) 2h 7h 24h Gelatina 39,08 ± 5,34Ac 81,28 ± 2,46Bb 96,50 ± 3,50Aa Collagel 41,79 ± 4,47Ac 61,54 ± 6,47Cb 82,33 ± 6,56Ba Fortigel 49,00 ± 1,91Ab 95,18 ± 3,92Aa 96,08 ± 3,92Aa

* Médias seguidas das mesmas letras (Maiúsculas na coluna e minúsculas na linha) não diferiram de acordo com o teste de Tukey (p>0,05).

Após o tratamento gástrico as suspensões de micropartículas foram submetidas às condições intestinais e após 7 horas houve um aumento na porcentagem de solubilidade variando de 61,54 a 95,18 % de acordo com o material de revestimento utilizado. Após 24 horas a solubilidade proteica aumentou, variando de 82,33 a 96,50 % de proteína liberada em

relação à proteína inicialmente adsorvida sobre as partículas. O Anexo 4 ilustra esta liberação de acordo com o tempo. Para partículas contendo gelatina e o hidrolisado Fortigel, a liberação observada foi quase total em relação à proteína inicialmente adsorvida. Menor solubilização foi observada quando o hidrolisado Collagel foi avaliado, significativamente menor que as a solubilização observada para gelatina e Fortigel adsorvidos, após 7 e 24 horas de hidrolise. Os hidrolisados utilizados, Collagel e Fortigel, são produtos registrados pelo fabricante e, portanto, o acesso a forma como foram produzidos não foi possível, além de não se encontrar na literatura informações sobre a produção dos mesmos e sobre sua digestibilidade por enzimas proteolíticas presentes no trato gastrointestinal. Este resultado não era esperado e as avaliações sobre os fatores determinantes para esta menor solubilização no caso do Collagel necessitam ser investigadas com outras ferramentas não utilizadas no escopo desta dissertação. Entre novas ferramentas, avaliações sobre a estrutura espacial dos hidrolisados e da gelatina necessitam ser incluídos, além de estudos mais específicos da digestibilidade destes hidrolisados.

Em outro estudo, microcápsulas de gelatina foram produzidas para encapsular e proteger o licopeno, que é altamente susceptível a reações de oxidação e de isomerização. Neste estudo além da proteção, avaliou-se também a resistência gastroentérica destas partículas observando-se uma rápida liberação a pH 5,5 e 7,0, enquanto que nenhum licopeno foi libertado a pH 2,0 e 3,5, o que para os autores indicou resistência gástrica das partículas de gelatina e que o licopeno poderia ser liberado no trato intestinal (GÓMEZ – GUILLEN et al., 2011).

Além da medida quantitativa da proteína e dos hidrolisados solubilizados, a resistência das partículas úmidas foi também avaliada qualitativamente utilizando-se microscopia ótica para observar a integridade das partículas após o tratamento gástrico e o intestinal. A Figura 25 apresenta as microscopias das micropartículas após 1h, 2h, 3h, 7h e 24h em condições gastrointestinais simuladas para avaliar a sua resistência física.

Analisando-se a solubilidade proteica (Tabela 6) e a resistência física da partícula após 2 h de tratamento, aparentemente a simulação gástrica (pH 2) e a perda ponderal de proteína não refletiram na mudança da morfologia das micropartículas. Nenhuma alteração significativa na morfologia das partículas após 1h e 2 horas de simulação em condições

gástricas foi observada, as partículas ainda se encontravam íntegras, esféricas e densas, como observado na Figura 25.

Quando as suspensões de micropartículas foram submetidas às condições intestinais; após 7 e 24 horas observou-se grande aumento da solubilidade proteica, efeito também observado nas microscopias óticas onde as partículas tornam-se mais transparentes refletindo a perda da camada proteica. No entanto, as partículas ainda se mantiveram esféricas indicando que somente a fração proteica foi solubilizada enquanto a partícula de gelificação iônica permaneceu aparentemente íntegra e esférica, conforme esperado, considerando que a hidrólise desta partícula de gelificação iônica contendo alginato não ocorre na parte superior do intestino (LIU, FISHMAN, HICKS, 2007). Efeito semelhante foi observado anteriormente por Tello et al (2014), utilizando alginato de alto conteúdo de ácido gulurônico para produzir as partículas de gelificação iônica. Este efeito, entretanto, não foi observado quando pectina de alto teor de metoxilação amidada foi utilizada para a produção de partículas por gelificação iônica, que foram totalmente solubilizadas, sem, entretanto, serem hidrolisadas, após o ensaio intestinal (SOUZA et al., 2012), refletindo diferenças na resistência física de géis de alginato e de pectina.

Como pode ser observado na Figura 25 as partículas de alginato permaneceram aparentemente íntegras quando submetidas a pH 2, na presença de enzimas proteolíticas. O efeito do pH sobre a estabilidade das microcápsulas de alginato e gelatina foi avaliado em estudo no pH 2,4; 3,8; 5,2; 6,4; 7,8 e 8,0. O estudo mostrou que o comportamento das micropartículas variou conforme o pH foi alterado. Quando os grânulos eram imersos em pH baixo (2,4), as partículas apresentaram inchamento atingindo o equilíbrio quanto ao tamanho, após 1 h. Com o aumento de pH (5,2 - 8,0), as microcápsulas exibiram o mesmo comportamento, porém primeiramente elas incharam e em seguida, começaram a se desintegrar. Segundo os autores, o efeito foi devido aos grupos carboxílicos do alginato que não foram reticulados por Ca2+, onde esses grupos foram ionizados e absorveram água, o que resultou na desintegração dos grânulos. Os resultados mostraram que as microcápsulas se tornaram instáveis quando o ambiente foi alterado de pH ácido para condições neutras (LI et

pH Gelatina Hidrolisado Collagel Hidrolisado Fortigel 1h 2 2h 2 3h 7 7h 7 24 h 7

Figura 25. Microscopia ótica das partículas que foram submetidas ao tratamento gastrointestinal em diferentes pHs e tempo de digestão.

5. Conclusão

Partículas de alginato de sódio produzidas por gelificação iônica interagiram com a gelatina e também com os hidrolisados Collagel e Fortigel por associações eletrostáticas possibilitando a adsorção de altas quantidades de proteína na superfície das partículas de gelificação iônica, em valores de pH abaixo do ponto isoelétrico da proteína, tornando as partículas mais resistentes contra condições adversas do meio. O ponto crítico para a adsorção da gelatina e dos hidrolisados proteicos utilizados é seu ponto de fusão requerendo que temperaturas superiores a 40 oC sejam utilizadas.

O estudo de diferentes estequiometrias entre soluções ou emulsões do polissacarídeo: solução de proteína nos sistemas diluídos, não foi suficiente para definir uma condição ótima para a melhor condição estequiométrica de interação micropartícula de alginato e a proteína. A observação visual dos coacervados partículas: proteína foi insuficiente para identificar a melhor condição de coacervação, requerendo que alternativas para a medida do potencial zeta partícula: proteína sejam utilizadas uma vez que a medida eletroforética é inviável para partículas maiores que 10 µm.

No estudo dos sistemas concentrados maiores adsorções proteicas sobre as partículas foram obtidas quando a maior concentração de proteína em solução (10%) foi utilizada obtendo-se adsorção de proteína de ~47,3; 41,4 e 29,3% (em base seca) quando gelatina, Collagel e Fortigel foram utilizados, respectivamente. Quanto maior foi à adsorção de proteína na partícula, menor foi a sua umidade apresentando na mesma quantidade de proteína em solução (10%) valores de umidade de ~76,6, ~81,1 e 88,2 % para as partículas recobertas com a gelatina, Collagel e o Fortigel respectivamente.

Embora tenham sido feitas determinações da quantidade de proteína não adsorvida nas partículas nas diferentes estequiometrias partículas: solução de proteína, em sistemas diluídos, o que poderia determinar um ponto estequiométrico ótimo de máxima adsorção, quando sistemas concentrados foram utilizados, somente o balanço de cargas parece insuficiente para explicar o aumento das adsorções proteicas, onde aumento de concentração produziu aumento de adsorção. Além da interação eletrostática, outros tipos de interações/efeitos necessitam ser estudados, entre eles a porosidade das partículas permitindo que a proteína difunda para o

interior dos poros por efeito físico e a possível interação proteína-proteína durante a formação da cobertura, o que possibilitaria a formação de camadas proteicas superpostas.

Partículas apresentando maiores adsorções proteicas foram submetidas a ensaios in

vitro gastrointestinais. Através da quantificação da proteína solubilizada em relação à

quantidade inicialmente adsorvida, observou-se que as partículas revestidas foram parcialmente resistentes (~39 a 49% de proteína solubilizada em pH 2). Após a mudança para condições intestinais, pH 7 subsequente as condições gástricas, após 7 h, os valores de solubilidade aumentaram para ~81; ~61 e ~95% e para ~96; ~82 e ~96% após 24 h, para gelatina, Collagel e Fortigel respectivamente. Partículas revestidas com Collagel mostraram- se mais resistentes à ação proteolítica gastrointestinal comparada a partículas revestidas com gelatina ou o Fortigel.

Embora praticamente toda a proteína adsorvida tenha sido solubilizada após o ensaio gastrointestinal quando gelatina ou Fortigel foram utilizados, o acompanhamento da morfologia das partículas feito por microscopia ótica mostrou que as partículas de gelificação iônica ainda se apresentavam esféricas e visualmente íntegras, mesmo após 24 h no experimento gastrointestinal.

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7. Anexos

Anexo 1

Produção de coacervados

Figura 1. Proporção de Alginato (Sol= solução e ou Emul= Emulsão) para diferentes proteínas (G= gelatina, C= Collagel, F= Fortigel

-40 -30 -20 -10 0 10 20 30 Alginato 1;1 1;1,5 1;1,75 1; 2 1; 3 1; 4 1;6 1; 8 1;10 Proteína P ot en cial Z et a (m V) Sol A: G Emul A: G Sol A: C Emul A: C Sol A: F Emul A: F

Tabela 1. Valores dos potenciais zeta dos sistemas, com os respectivos desvios padrão. Alg. 1;1 1;1,5 1;1,75 1; 2 1; 3 1; 4 1;6 1; 8 1;10 Prot. Sol A: G -32,07 -23,8 -2,85 0,05 5,09 15,51 19,85 19,05 20,44 21,65 20,13 DP 0,74 0,74 1,21 1,13 1,3 1,24 1,18 1,69 1,45 0,9 1,25 Emul A: G -33,34 -25,22 -1,82 6,27 9,26 16,95 19,67 21 22 22,63 18,32 DP 1,2 1,21 1,27 0,9 0,93 0,89 0,81 0,66 0,7 0,8 1,27 Sol A: C -29,97 -16,72 -2,84 -0,13 2,05 5,25 6,99 9,33 11,42 12,63 13,33 DP 2,26 4,43 3,66 2,68 2,74 1,86 2,68 3,56 3,22 3,23 3,08 Emul A: C -30,81 -22,44 -12,45 7,89 3,86 2,43 5,9 9,17 9,39 11,25 14,24 DP 1,86 1,29 2,78 1,36 0,65 0,17 0,53 0,75 0,85 1,14 1,41 Sol A: F -26,58 -17,48 -13,68 -12,49 -11,14 -6 -4,16 -2,33 -1,17 -0,49 3,28 DP 0,7 0,85 0,49 0,64 0,73 0,3 0,18 0,44 0,26 0,27 0,69 Emul A: F -31,52 -19,45 -14,98 -13,5 -11,12 -6,03 -4,19 -2,21 -1,2 -0,63 3,03 DP 1,19 0,7 0,65 0,95 1,41 0,48 0,37 0,33 0,34 0,4 0,55

Anexo 2

Tamanho dos Coacervados

Tabela 1. Tamanho dos coacervados produzidos utilizando como material solução, emulsão de alginato e suspensão de partículas: Gelatina 0,1%.

Coacervados – Sol : Sol (µm)

Coacervados – Emul:Sol (µm)

Partículas: Gel (µm)

Coluna 1 Coluna 2 Coluna 3 Coluna 4

Emulsão/ Partícula GI 6,2 ± 0,3 Eb 172,8 ± 8,5Ca 1:1 186,2 ± 19,9 ABa 168,7 ± 30,4BCa 219,7 ± 12,2ABCa 1:1,5 203,6 ± 30,6 ABa 167,1 ± 40,8BCa 225,7 ± 18,2ABCa 1:1,75 243,0 ± 47,3 Aa 189,7 ± 27,1ABCa 271,5 ± 40,8Aa