UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS
FACULDADE DE ENGENHARIA DE ALIMENTOS
JOELMA CORREIA BERALDO
“PRODUÇÃO DE MICROPARTÍCULAS DE ALGINATO
TENDO COMO COBERTURA GELATINA E COLÁGENO
COM DIFERENTES GRAUS DE HIDRÓLISE”
CAMPINAS
JOELMA CORREIA BERALDO
“PRODUÇÃO DE MICROPARTÍCULAS DE ALGINATO
TENDO COMO COBERTURA GELATINA E COLÁGENO
COM DIFERENTES GRAUS DE HIDRÓLISE”
Dissertação apresentada à Faculdade de Engenharia de Alimentos da Universidade Estadual de Campinas como parte dos requisitos exigidos para a obtenção do título de Mestra em Alimentos e Nutrição na Área de Nutrição Experimental Aplicada a Tecnologia de Alimentos.
Orientador: Prof. Dr. Carlos Raimundo Ferreira Grosso
ESTE EXEMPLAR CORRESPONDE À VERSÃO FINAL DA TESE DEFENDIDA PELA ALUNA JOELMA CORREIA BERALDO E ORIENTADA PELO PROF. DR. CARLOS RAIMUNDO FERREIRA GROSSO.
CAMPINAS
Prof. Dr. Carlos Raimundo Ferreira Grosso Orientador
Faculdade de Engenharia de Alimentos – UNICAMP
Dra. Renata Mukai Correa Membro Titular
Pesquisadora
Prof(a). Dra. Louise Kurozawa Membro Titular
Faculdade de Engenharia de Alimentos – UNICAMP
Prof. Dr. Rodney Alexandre Ferreira Rodrigues Suplente
CPQBA / UNICAMP
Prof(a). Dra. Carmen Sílvia Favaro-Trindade Suplente
Faculdade de Zootecnia e Engenharia de Alimentos – USP
A Ata de defesa com as respectivas assinaturas dos membros encontra-se no processo de vida acadêmica da aluna.
DEDICO:
À minha família em especial a minha mãe Zete, que nunca mediu esforços para que eu realizasse meus sonhos. À minha tia Tereza, ao Renato e a pequena Maria Fernanda. Deus lhes pague por tudo que fazem por mim. Amo vocês!
“Há um tempo em que é preciso abandonar as roupas
usadas, que já tem a forma do nosso corpo, e
esquecer os nossos caminhos, que nos levam sempre
aos mesmos lugares. É o tempo da travessia: e, se
não ousarmos fazê-la, teremos ficado, para
sempre, à margem de nós mesmos.”
Fernando Pessoa
"Esperar não é perder tempo, é ter a certeza que
há um tempo certo para tudo.
Porque Deus não demora... Ele capricha!"
Primeiramente a Deus, por tudo! Dizem que: “Há duas maneiras para se ver a vida, ou você não acredita em milagres ou passa a acreditar que tudo que acontece em sua vida é milagre”. Acredito na segunda e por isso agradeço demais a Deus, por ter planos para mim muito maiores e melhores que os meus.
Ao meu orientador Professor Carlos, por ser um professor dedicado e presente. Obrigado, pela confiança depositada em mim e em meu trabalho, pela orientação, ajuda, dedicação, cuidado e principalmente por ter me dado uma oportunidade para crescer, jamais irei esquecê-lo.
A banca examinadora obrigada, membros titulares e suplentes: Rodney, Renata, Louise, Carmen e Judite obrigada pelas correções e sugestões que contribuíram para o melhoramento e aperfeiçoamento do trabalho.
A Faculdade de Engenharia de Alimentos, seus professores e funcionários pela oportunidade e apoio em cada momento durante a realização deste trabalho, sempre encontrei as portas abertas e muito apoio em qualquer laboratório que precisei ou dúvidas que tive.
Ao conselho Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento (CNPq) pela bolsa de estudos concedida.
A FCM e a Gelita do Brasil, pela doação do material de trabalho.
A minha mãe, por me mostrar que o conhecimento e a sabedoria são os melhores bens que uma pessoa pode ter. Mãe, obrigada pela criação, amor, apoio, oração, por me ensinar a fazer as coisas de coração e da melhor maneira possível sem esperar nada em troca e principalmente, obrigada por me ensinar a ser forte diante das dificuldades e das tristezas, a não desistir e sim persistir sempre, e digo de coração, estas coisas não me ensinou falando me ensinou pelo exemplo, pela garra e por me mostrar e falar sempre que mesmo sendo duas tudo ia dar certo porque éramos uma equipe.
Ao Renato, “Quem pensa que a distância faz esquecer, esquece que a saudade faz lembrar”. Obrigada, por tudo que fez para mim e por mim, por me motivar mesmo sem acreditar no objetivo, por me dar forças para seguir, sem desistir ou “baixar a cabeça”, por ser muito mais razão que emoção, você é muito importante em minha vida e me faz muito bem!
A Tia Te, pessoa muito especial que torna a minha vida muito mais bela, fácil e feliz. Aquela que por 4 anos me esperou chegar da faculdade à noite fazendo seu crochê, que cuidou das minhas coisas enquanto morei em outra cidade, que foi e é minha segunda mãe em todos os aspectos, obrigada!
A Maria Fernanda, aquela que nem existia no começo de tudo, mas que hoje é o verdadeiro sentido para minha vida.
A Gi, incansável em me socorrer nas piores horas, pelos conselhos, carinho, amizade e vários momentos divertidíssimos, mesmo se tudo estivesse dando errado. Uma amiga que ganhei pra a vida inteira.
A Karla, Talita, Juliana Burger, Flávia, Grazi, Bia, Bianca, Juliana Carusi e Fernando pela ajuda no laboratório, pelas informações trocadas e principalmente pelo companheirismo. Aos funcionários do DEPAN, que sempre mostraram presteza em me ajudar no que fosse necessário. Em especial a Yara, por ser simplesmente a Yara: dedicada, comprometida, extremamente organizada e principalmente por ser uma incansável sonhadora como eu, por tentar inúmeras vezes até conseguir.
Aos amigos Lu, Déia, Samir e Tiago que foram minha família durante este tempo em Campinas, obrigada por me acolherem, pelos momentos vividos e compartilhados.
Ao Fubá, Rangel, Paulinho e Luiz, obrigado pela amizade, preocupação e cuidado. “Ferpas”, Deus lhes pague por tudo isso!
Esta parte da história “Graças a Deus” está chegando ao fim. E junto com ela chegará o início de uma nova etapa. Levo comigo muitas recordações e muito conhecimento e principalmente levo comigo esta conquista, mas sei que não é só minha por isso à todos que de alguma forma contribuíram para a elaboração deste trabalho e não foram mencionados.
O objetivo deste trabalho foi produzir micropartículas contendo alto teor de proteínas, capazes de serem estáveis ao ambiente gástrico, liberando o material encapsulado (óleo de girassol) em ambiente intestinal. Foram produzidas micropartículas por gelificação iônica utilizando alginato de sódio como material de parede e posteriormente estas partículas foram recobertas com gelatina e dois hidrolisados de gelatina/ colágeno com diferentes graus de hidrólise, sendo um menos hidrolisado e outro intensamente hidrolisado. Inicialmente os biopolímeros (alginato, gelatina, Collagel® e Fortigel®) foram avaliados com relação a sua carga elétrica para se obter as condições de pH e a relação de concentração de polissacarídeo: proteína em solução em que a interação eletrostática entre os biopolímeros estudados fosse possível e que permitisse a máxima adsorção proteica, resultando em sistemas com cargas próximas a neutralidade (potencial zeta próximo a zero), e na máxima adsorção possível para os demais sistemas estudados mesmo não atingindo a neutralidade das cargas. A partir destas avaliações em sistemas diluídos, foram testadas altas quantidades de proteína em solução para verificar a adsorção das proteínas sobre as micropartículas, porém não mais utilizando sistemas diluídos, mas em sistemas concentrados, com teores de proteína de 1, 2, 4, 6, 8, 10 % de proteína (Gelatina, Collagel, Fortigel) em solução, para fazer a interação eletrostática com as partículas de gelificação iônica. As partículas obtidas foram caracterizadas com relação à morfologia, tamanho médio, teor de proteína e conteúdo de umidade. As partículas que apresentaram maior adsorção proteica foram selecionadas e avaliadas com relação à resistência ao ambiente gástrico e possível degradação em ambiente intestinal, simulados in
vitro, quantificando-se o teor de proteínas solubilizado e acompanhando a morfologia das
partículas durante esses ensaios. Maiores adsorções proteicas foram observadas na maior concentração proteica em solução avaliada (10%), produzindo adsorções de 47,3; 41,4 e 29,3% quando gelatina, Collagel e Fortigel foram utilizados, respectivamente. As partículas permaneceram íntegras em ambiente gástrico e liberaram praticamente todo o seu revestimento proteico no ambiente intestinal; no entanto mantiveram forma esférica e integridade, indicando que as partículas de gelificação iônica produzidas com o alginato não foram susceptíveis ao ataque proteolítico gástrico ou intestinal e nem a mudança de pH. Palavras-chave: microencapsulação, gelificação iônica, interação eletrostática, alginato, gelatina, hidrolisados proteicos.
The objective of this work was to produce microparticles containing high protein rate, capable of being stable to the gastric environment, releasing the encapsulated material (sunflower oil) in the intestinal portion. Microparticles were produced by ionic gelation using sodium alginate as wall material and then these particles were coated with gelatin and two hydrolysed gelatin / collagen with different degrees of hydrolysis, being hydrolyzed and another less intensely hydrolyzate. Initially the biopolymers (alginate, gelatin, Collagel® and FORTIGEL®) were evaluated related to their electrical charge in order to obtain the pH conditions and polysaccharide concentration: protein ratio in solution in which the electrostatic interaction between the studied biopolymers possible and to allow maximum protein adsorption, resulting in systems near neutral charge (zeta potential close to zero) and the maximum possible adsorption for other systems studied not even reaching neutrality of charges. From these reviews in dilute systems, high amounts of protein were assayed in solution to verify the proteins adsorption on microparticle, using concentrated systems, with protein levels,1, 2, 4, 6 8, 10% concentration (gelatin, Collagel, FORTIGEL) in solution, to make the electrostatic interaction with the ionic gelling particles. The obtained particles were characterized related to the morphology, average size, protein content and moisture content. The particles showing higher protein adsorption were selected and evaluated for resistance to gastric environment and possible degradation in intestinal environment, simulating in vitro, quantifying the content of solubilized proteins and following the particles morphology during these tests. Further protein adsorption were observed at higher protein concentration measured in solution (10%), yielding adsorptions of 47.3; 41.4 and 29.3% when gelatin, and Collagel, FORTIGEL were used, respectively. The particles remained intact in the gastric environment and released almost all its protein coating in the intestinal environment; however they remained spherical shape and integrity, indicating that the gelling ionic particles produced with the alginate were not susceptible to gastric or intestinal proteolytic attack and also has not showed changes related to the pH.
Keywords: microencapsulation, ionic gelation, electrostatic interaction, alginate, gelatin, protein hydrolysates.
Figura 1. Morfologia de diferentes partículas obtidas por microencapsulação. (Adaptada de Thies, 1995). ... 25
Figura 2 .Estrutura química do alginato, composto pelos ácidos D- manurônico e L- gulurônico (WANDREY et al., 2010). ... 29
Figura 3. Representação esquemática da associação entre o ácido gulurônico e o íon cálcio (WANDREY et al., 2010). ... 29
Figura 4. Representação esquemática da estrutura em forma de caixa de ovo entre o alginato e o Ca 2+ (GEORGE; ABRAHAM, 2006). ... 30
Figura 5. Produção de micropartículas através do método de gelificação iônica. ... 45
Figura 6. Perfil eletroforético das proteínas estudadas, 1) gel de poliacrilamida-SDS-Glicina, 2) gel de poliacrilamida-SDS-Tricina a. Proteína Padrão b. Gelatina, c. Hidrolisado Collagel, d. Hidrolisado Fortigel. ... 55
Figura 7. Potencial Zeta dos biopolímeros. ... 56
Figura 8. Teste de diferentes pHs para a produção de coacervados utilizando solução de alginato e gelatina a 0,1% (p/p). Sendo A. pH 3, B. pH 3,5 e C.pH 4. ... 59
Figura 9. Imagens dos coacervados através da mistura de solução de alginato: solução gelatina a 0,1%, pH 3 e respectivos valores do potencial zeta (mV). ... 61
Figura 10. Imagem dos coacervados através da mistura de solução de alginato e solução do hidrolisado Collagel a 0,1%, pH 3 e respectivos valores do potencial zeta (mV), iniciando pela solução pura de alginato até a solução pura do hidrolisado Collagel. ... 63
solução pura de alginato até a solução pura do hidrolisado Fortigel. ... 64
Figura 12. Imagens de coacervados obtidos da mistura de emulsão de alginato e óleo de girassol e solução de gelatina a 0,1%, pH 3 e respectivos valores do potencial zeta (mV), iniciando pela emulsão pura até a solução pura de gelatina. ... 66
Figura 13. Imagens de coacervados obtidos da mistura de emulsão de alginato e óleo de girassol e solução de hidrolisado Collagel a 0,1%, pH 3 e respectivos valores do potencial zeta (mV), começando pela emulsão pura até a solução pura do hidrolisado Collagel. ... 67
Figura 14. Imagens de coacervados obtidos da mistura de emulsão de alginato e óleo de girassol e solução de hidrolisado Fortigel a 0,1%, pH 3 e respectivos valores do potencial zeta (mV), iniciando pela emulsão pura até a solução pura do hidrolisado Fortigel. ... 67
Figura 15. Proporção de Alginato (Sol= solução e ou Emul= Emulsão) para diferentes proteínas (G= gelatina, C= Collagel, F= Fortigel ... 68
Figura 16. Imagens de coacervados obtidos da mistura de suspensão de micropartículas e solução de gelatina a 0,1%, pH 3. Iniciando pela suspensão pura de micropartículas até a solução pura de gelatina. ... 69
Figura 17. Imagens de coacervados obtidos da mistura de suspensão de micropartículas e solução do hidrolisado Collagel a 0,1%, pH 3. Iniciando pela suspensão de micropartículas até a solução do hidrolisado Collagel. ... 70
Figura 18. Imagens de coacervados obtidos da mistura de suspensão de micropartículas e solução do hidrolisado Fortigel a 0,1%, pH 3. Iniciando pela suspensão de micropartículas até a solução do hidrolisado Fortigel... 71
... 79
Figura 21. Morfologia por MEV de micropartículas produzidas por gelificação iônica e interação eletrostática em solução com proteína e hidrolisados proteicos, liofilizadas. ... 81
Figura 22. Microscopia ótica das micropartículas seccionadas e coradas com Comassie Blue e PAS. Sendo 1. Partículas de GI coradas com o Comassie Blue, 2. Partículas de GI coradas com o PAS, 3. Partículas revestidas com gelatina e coradas com o Comassie Blue. ... 82
Figura 23. Microscopia ótica das micropartículas seccionadas e coradas com Comassie Blue e PAS. ... 83
Figura 24. Microscopia confocal de partículas produzidas por gelificação iônica recobertas com diferentes proteínas coradas com FIT C. Sendo 1. Gelatina (10%), 2. Hidrolisado Collagel (10%), 3. Hidrolisado Fortigel (10%). ... 85
Figura 25. Microscopia ótica das partículas que foram submetidas ao tratamento gastrointestinal em diferentes pHs e tempo de digestão. ... 89
Tabela 1. Relação entre a proporção escolhida e o teor de proteína em solução %...46
Tabela 2. Composição centesimal (%) em base seca dos produtos utilizados para elaboração dos coacervados e das micropartículas por gelificação iônica associada à interação eletrostática...53
Tabela 3. Teor de umidade (%) nas micropartículas em função da concentração de proteína em solução...75
Tabela 4. Teor de proteína adsorvido nas micropartículas em função da concentração de proteína em solução (%)...75
Tabela 5. Tamanho médio (D 0,5) das micropartículas de gelificação iônica recobertas com diferentes teores de proteína em solução...77
Tabela 6. Avaliação da solubilidade de proteínas e dos hidrolisados proteicos das micropartículas quando 10% de proteína ou dos hidrolisados em solução foram utilizados...86
ABSTRACT ... 10 LISTA DE ILUSTRAÇÕES ... 11 LISTA DE TABELAS... 14 INTRODUÇÃO ... 18 1. INTRODUÇÃO ... 19 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ... 23 2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ... 24 2.1 Microencapsulação ... 24 2.2 Gelificação Iônica ... 27 2.3 Alginato ... 28 2.4 Interação eletrostática ... 31 2.5 Gelatina ... 32 2.6 Colágeno Hidrolisado ... 34 MATERIAL E MÉTODOS ... 36 3. MATERIAL E MÉTODOS ... 37 3.1 Materiais ... 37
3.2 Caracterização dos biopolímeros ... 37
3.2.1 Determinação de proteína, umidade e cinzas ... 37
3.2.2 Distribuição de massa molar ... 38
3.2.3 Determinação da carga superficial dos polímeros ... 39
3.3 Produção dos coacervados utilizando sistemas diluídos ... 39
3.3.1 Produção de coacervados através da mistura entre soluções polissacarídeo: proteína/hidrolisados ... 40
3.3.2 Produção de coacervados através da mistura entre emulsão contendo polissacarídeo: óleo de girassol e uma solução de proteína/hidrolisados ... 41
3.3.3 Produção de coacervados através da mistura de micropartículas de alginato/óleo de girassol e solução de proteína/hidrolisados ... 41
3.3.4. Determinação da carga superficial ... 42 3.3.5 Determinação da proteína remanescente no sobrenadante após a coacervação43
3.4.1 Produção de micropartículas por gelificação iônica ... 44
3.4.2 Interação eletrostática ... 45
3.5 Caracterização das micropartículas ... 47
3.5.1 Determinação de proteína, umidade e cinzas ... 47
3.5.2 Tamanho médio e distribuição de tamanho das micropartículas ... 47
3.5.3 Morfologia ... 47
3.5.4 Microscopia ótica das micropartículas seccionadas ... 48
3.5.5 Microscopia confocal de varredura a laser (MCVL) ... 49
3.6 Avaliação da solubilidade das proteínas das micropartículas em simulação das condições gastrointestinais ... 50
3.7 Análise Estatística ... 51
RESULTADOS E DISCUSSÃO... 52
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO... 53
4.1 Caracterização dos biopolímeros ... 53
4.1.1 Determinação de proteína, umidade e cinzas ... 53
4.1.2 Distribuição de massa molar ... 54
4.1.3 Análise da Carga superficial dos polímeros ... 56
4.2 Produção dos coacervados (Sistemas diluídos) ... 58
4.2.1 Produção de Coacervados através da mistura de Solução de proteína: Solução do polissacarídeo e potencial zeta ... 61
4.2.2 Produção de Coacervados através da mistura da Emulsão Alginato-óleo: Solução de proteína e potencial zeta ... 65
4.2.3 Produção de Coacervados através da mistura de Micropartículas de alginato / óleo de girassol: Solução de proteína / hidrolisados ... 68
4.2.4 Determinação de proteína no sobrenadante ... 71
4.3 Sistemas concentrados ... 74
4.3.1 Caracterização das micropartículas ... 74
4.3.5 Microscopia confocal de varredura a laser (MCVL) ... 84
4.4 Avaliação da solubilidade proteína das micropartículas em simulação das condições gastrointestinais ... 86 CONCLUSÃO ... 90 5. Conclusão ... 91 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ... 93 6. Referências Bibliográficas ... 94 ANEXOS ... 104 7. Anexos ... 105 Anexo 1 ... 105 Produção de coacervados ... 105 Anexo 2 ... 107
Tamanho dos Coacervados ... 107
Anexo 3 ... 110
Proteína Adsorvida ... 110
Anexo 4 ... 111
Solubilidade de proteínas durante a simulação gastroentérica. ... 111
Anexo 5 ... 112
1. INTRODUÇÃO
A microencapsulação é a tecnologia de empacotamento com finas coberturas poliméricas aplicáveis a sólidos, líquidos ou material gasoso, no qual o conteúdo pode ser liberado a taxas ou condições específicas (TODD, 1970).
No setor de alimentos, a utilização da técnica de microencapsulação já tem mais de 60 anos, sendo uma das principais razões a capacidade da microencapsulação de transformar estes materiais em diferentes estados físicos em micropartículas sólidas além de proteger o material encapsulado contra condições adversas do meio e liberar seu conteúdo no momento desejado e em diferentes condições. A microencapsulação tem como principais objetivos: proteção, liberação controlada, permitir fácil manuseio, mascarar sabores e odores indesejados (DESAI, PARK, 2005).
O emprego da microencapsulação tem sido ampliado, devido às novas necessidades que a indústria de alimentos apresenta, tendo prioridades cada vez mais complexas, que muitas vezes só podem ser conferidas ao alimento através da microencapsulação (GOUIN, 2004).
As técnicas de microencapsulação são amplas e podem ser aplicadas em diferentes áreas, como a indústria de alimentos, a farmacêutica e a de cosméticos entre outras tantas. Para a produção de microcápsulas, são utilizados diversos métodos, que podem ser divididos em: químicos, físicos e físico-químicos (FAVARO-TRINDADE et al., 2008). Para o trabalho escolheu-se a gelificação iônica e posterior interação eletrostática para a adsorção de uma capa proteica sobre a partícula gelificada.
O método de produção de micropartículas por gelificação iônica é simples, rápido e de baixo custo, não requer solventes orgânicos ou altas temperaturas, ocorrendo quando uma solução polimérica é gotejada sobre uma solução iônica em concentrações adequadas (WILLAERT, BARON, 1996).
Para a gelificação iônica, dentre os biopolímeros utiliza-se o alginato, que é um biopolímero aniônico, extraído de três espécies de algas marrons. Estas incluem Laminaria
hiperbórea, Ascophyllum nodoso, e Macrocystis pyrifera; onde o alginato é composto por
com cátions diversos encontrados na água do mar, tais como Mg 2 + , Sr 2 + , Ba 2 + e Na + (GEORGE, ABRAHAM, 2006). O alginato sendo aniônico na presença de cátions bivalentes tais como cálcio, forma através da gelificação iônica, microesferas de gel de alginato, pode-se utilizar também emulsões com o alginato, permitindo a encapsulação de um material de caráter hidrofóbico.
As partículas produzidas por gelificação iônica geralmente são muito porosas, o que acarreta problemas de liberação indesejada de compostos hidrofílicos em especial de baixa massa molar, podendo-se diminuir este problema através do recobrimento com um composto catiônico por meio da interação eletrostática.
A interação eletrostática entre biopolímeros de cargas opostas oferece melhor estabilidade a microcápsula, uma maior adsorção de proteína onde estas microcápsulas apresentam um desempenho melhorado em comparação com redes produzidas com polímeros individuais (FARRIS et al., 2009).
A complexação entre gelatina e polímeros aniônicos como o alginato para a formação de microcápsulas são de especial interesse, pois podem prender componentes funcionais em um veículo e proporcionar proteção contra oxidação ou degradação durante a armazenagem. Além disso, o encapsulamento pode ser utilizado para modular a liberação de componentes funcionais, como um produto alimentar bioativo ou ainda um fármaco, tendo sua liberação controlada quando ingerido. Pode ser também utilizada para mascarar o gosto e odor, uma vez que extratos vegetais bioativos têm, frequentemente, sabor e odor muito forte (GÓMEZ – GUILLEN et al., 2011).
A gelatina é uma proteína derivada de colágeno desnaturado que contém elevados níveis de hidroxiprolina, prolina e glicina e é utilizada como um agente encapsulante. Ela possui uma excelente capacidade de formação de membrana, biocompatibilidade e não toxicidade. A aplicabilidade da gelatina como uma matriz de hidrogel é limitada devido à sua rede de baixa rigidez. No entanto, as suas propriedades físicas podem ser melhoradas através da adição de agentes de reticulação, por causa de sua natureza anfotérica, que também é excelente para interação com polissacarídeos aniônicos, tais como o alginato entre outros (LI
Além da gelatina como material proteico, nesse trabalho, utilizaram-se também dois tipos de colágenos hidrolisados: Collagel® e Fortigel®. Os hidrolisados de colágeno são preparados através da hidrólise enzimática controlada, onde o produto gerado não apresenta sabor característico, podendo assim ser utilizado em uma ampla variedade de produtos (GELITA, 2016).
As partículas têm por finalidade liberar o seu conteúdo em taxas controladas ao longo de períodos prolongados de tempo, como por exemplo, partículas que apresentam resistência ao ambiente ácido no estômago e liberam seu conteúdo no ambiente intestinal. Isso faz com que estas partículas possam ser adicionadas em alimentos e bebidas ou até mesmo como veículo para medicações (OO et al., 2008).
Diante do exposto, o presente trabalho teve como objetivo produzir micropartículas de alginato através da técnica de gelificação iônica e recobri-las com colágeno com diferentes graus de hidrólise (Gelatina, Collagel e Fortigel) por interação eletrostática, caracterizar as partículas e avaliar sua resistência quando submetidas às condições gastrointestinais.
Teve ainda como objetivos específicos:
Avaliar o comportamento de carga, frente ao pH do alginato, gelatina e dos hidrolisados em diferentes proporções e faixas de pH através do potencial zeta.
Determinar faixas de pH onde ocorram possíveis interações eletrostáticas entre o alginato, gelatina e os hidrolisados (proporções polissacarídeos: proteína, ponto isoelétrico).
Determinar a quantidade de proteína solúvel e a adsorvida, quando realizada a mistura em diferentes proporções de polissacarídeo e proteína.
Avaliar e escolher uma proporção entre a quantidade de alginato e proteína necessárias para a produção dos coacervados em sistemas diluídos para aplicar em sistemas concentrados.
Produzir e caracterizar micropartículas obtidas através dos métodos combinados de gelificação iônica e interação eletrostática, sendo a gelificação iônica feita com alginato de sódio de alto conteúdo de ácidos gulurônicos e óleo de girassol e posteriormente recobrir as partículas com uma capa proteica a partir de gelatina, hidrolisado Collagel e hidrolisado Fortigel.
Avaliar/comparar as proteínas com diferentes graus de hidrólise na adsorção de proteínas.
Avaliar a relação entre quantidade de proteína em solução e adsorção de proteína na superfície da micropartícula obtida por gelificação iônica.
Analisar a composição das micropartículas¸ assim como a sua morfologia e tamanho médio.
Avaliar a resistência das micropartículas obtidas pela combinação das técnicas de gelificação iônica e interação eletrostática, frente condições gastrointestinais in vitro.
O trabalho a seguir está organizado da seguinte maneira:
Revisão Bibliográfica: apresenta os principais conceitos e fundamentos teóricos abordados no presente trabalho;
Material e Métodos: neste item foi descrita toda metodologia de trabalho e também os materiais utilizados.
Resultados e Discussões: neste item foram descritos os resultados obtidos e suas pertinentes discussões, iniciando com os sistemas diluídos, partindo para os sistemas concentrados e finalizando com a resistência gastroentérica.
Conclusão: neste item foi feita uma síntese considerando as partes principais do trabalho e os seus principais resultados.
Referências Bibliográficas: neste item estão os autores utilizados como referência para a elaboração do trabalho. Os autores estão listados em ordem alfabética.
Anexos: neste item foram incluídos dados para enriquecimento do trabalho, porém que não foram utilizados nos resultados.
2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
2.1 Microencapsulação
A microencapsulação é uma tecnologia de empacotamento que consiste em recobrir uma substância desejada com uma fina película de outro composto, podendo-se recobrir substâncias líquidas, sólidas ou gasosas (SHAHIDI, HAN, 1993).
As primeiras pesquisas no campo da microencapsulação foram realizadas na década de 30, pela empresa norte-americana National Cash Register Co., de Dayton, OH, pelo pesquisador Barret K. Green, utilizando o método de coacervação complexa para a encapsulação de um material sensível a mudanças de pH, produzindo mudança de cor, a empresa desenvolveu o produto conhecido como papel carbono sem cor (FOOD INGREDIENTS BRASIL, 2013).
A primeira utilização deste produto foi em 1954 nos EUA, em um papel que continha microcápsulas de tinta adsorvidas sobre o mesmo, que quando pressionadas pela ação exercida pela caneta ou pela máquina datilográfica liberavam seu conteúdo, tornando possível a substituição da folha de papel carbono convencional (RÉ, 2000, JONES, McCLEMENTS, 2010).
A técnica de microencapsulação foi concebida na tentativa de mimetizar o modelo celular, onde uma membrana reveste o núcleo fazendo com que haja uma entrada e saída controlada de substâncias, isto é, uma permeabilidade seletiva (JIZOMOTO et al.,1993). O material usado para recobrir a cápsula é chamado de membrana, material de parede, fase externa ou matriz. Já o material encapsulado é chamado de núcleo, agente ativo, material de preenchimento, fase interna, ou carga útil. A microencapsulação forma partículas geralmente muito pequenas tendo diâmetros de micrômetros (μm) ou nanômetros (nm) (ZUIDAM, SHIMONI, 2009).
As microcápsulas formadas pela técnica de microencapsulação apresentam diferentes morfologias. Essa diferença é decorrente do material de núcleo e de parede e também do processo ou técnica de revestimento (deposição do material da parede) utilizados. Em geral as
microcápsulas formadas podem ser mononucleares (microcápsulas), onde o material de parede reveste um único núcleo, este tipo também pode ser chamado de reservatório, ou polinucleares, definidas como partículas que tem muitos núcleos revestidos com o material de parede, (micropartículas); ou também do tipo matriz, que é polinucleada e tem o agente ativo disperso no material de parede (THIES, 1995; ZUIDAM, SHIMONI, 2009).
A Figura 1 representa as morfologias das microcápsulas:
Figura 1. Morfologia de diferentes partículas obtidas por microencapsulação. (Adaptada de Thies, 1995).
A microencapsulação é utilizada principalmente para proteção do composto desejado e para a modulação de sua liberação. Também pode aumentar a estabilidade do produto, mascarar propriedades indesejáveis como, por exemplo, um sabor muito forte/desagradável em caso de medicações, entre outros. Devido a sua grande versatilidade, tem aplicações em diversos setores como: indústria alimentícia, química, de impressão, fertilizantes, inseminação artificial, de energia e farmacêutica (SHAHIDI, HAN, 1993; GIBBS et al., 1999; DESAI, PARK, 2005).
Na indústria de alimentos é utilizada para recobrir ou revestir componentes e ingredientes como: acidulantes, gorduras, vitaminas, corantes, aromas e sabores, como também é utilizada para encapsular compostos bioativos, enzimas e bactérias probióticas. Na utilização em alimentos, a função da cápsula é preservar uma substância protegendo-a das condições adversas do meio e proporcionar sua liberação na ocasião desejada, sendo essas
condições: luz, umidade, oxigênio, interações com outros compostos e evaporação do material ativo encapsulado (DESAI, PARK, 2005).
Para a produção das microcápsulas deve-se ter um conhecimento prévio dos polímeros utilizados como material de parede, assim como dos métodos físicos, químicos ou físico-químicos usados para microencapsular, para evitar ou favorecer possíveis interações em solução, ou conformação estrutural indesejada, favorecendo assim a obtenção de um produto com excelentes características funcionais (JONES, McCLEMENTS, 2010).
O revestimento da microcápsula pode ser feito utilizando compostos naturais ou sintéticos, porém para esta escolha, deve-se levar em consideração uma série de fatores como o material a ser encapsulado, o método de microencapsulação e o mecanismo ideal de liberação (FAVARO-TRINDADE et al., 2008). Usualmente os compostos sintéticos são utilizados para encapsulação de fármacos e outros componentes; para o setor alimentício são utilizados os materiais naturais, ou seja, as biomoléculas. Estas biomoléculas incluem carboidratos/ polissacarídeos, proteínas e lipídeos (WANDREY et al., 2010).
Além do material utilizado e da técnica, para uma eficiente encapsulação deve-se considerar que um conteúdo hidrossolúvel preferencialmente deverá ser microencapsulado com um polímero lipossolúvel e vice-versa, permitindo a liberação controlada da substância desejada e propiciando maior estabilidade a microcápsula (SHAHIDI, HAN, 1993).
Como a composição da microcápsula pode ser muito diversificada (vários componentes) é importante atentar a fatores como morfologia, concentração, interações entre os materiais, localização dos diferentes componentes presentes, pois estes fatores podem alterar as propriedades físico-químicas, incluindo densidade, índice de refração, reologia, sensibilidade ambiental, estabilidade, digestibilidade e características funcionais pretendidas para a micropartícula a ser produzida (JONES, McCLEMENTS, 2010).
Além dos fatores citados, para uma eficiente microencapsulação e para que esta atenda o propósito para a qual foi desenvolvida, deve-se escolher cuidadosamente o método ou a combinação de métodos a serem utilizados. Existem diversos métodos de microencapsulação que utilizam diferentes princípios e que geram cápsulas com finalidades/propriedades diferentes (THIES, 1995; WANDREY et al., 2010).
2.2 Gelificação Iônica
A gelificação iônica é um método de produção de partículas, onde uma solução polimérica aniônica contendo os nutrientes isolados ou em emulsão é gotejada sobre uma solução iônica, quando a gelificação iônica externa é utilizada. A gelificação ocorre quando os polímeros entram em contato com os íons, que através da interação das diferentes cargas formam um complexo que pode ser produzido na forma de uma micropartícula (THIES, 1995).
A solução catiônica de reticulação mais utilizada é a contendo cátions divalentes como o Ca²+ (BEAULIEU et al., 2002). Já para solução polimérica, são utilizados os polissacarídeos como pectina de baixo teor de esterificação amidada ou sem amidação e o alginato de sódio de alto conteúdo de ácido gulurônico (MESTDAGH, AXELOS, 1998).
A gelificação iônica requer condições brandas (ocorre em meio aquoso), é simples, fácil, rápida e de baixo custo. Alguns fatores podem influenciar a gelificação, determinando a cinética da formação do gel, o volume e a estabilidade das cápsulas, incluindo a concentração do cátion, a força iônica e o pH (MESTDAGH, AXELOS, 1998).
A microencapsulação por gelificação iônica é valorizada também por ter a capacidade para modular as propriedades de liberação do material ou agente microencapsulado, isso levando em consideração o tamanho das partículas, forma e características do material das partículas microencapsuladas (BUREY et al., 2008).
Estas microcápsulas formadas através da gelificação iônica protegem o material recoberto de condições adversas, como por exemplo: pH, luz, oxigênio, etc. Este fator é importante principalmente quando se está encapsulando compostos ativos ou compostos que devem ser liberados somente no local desejado em resposta a mudanças no ambiente como temperatura, pH, força iônica e enzimas. A encapsulação por gelificação iônica pode reduzir a perda da atividade dos compostos ativos, vitaminas e microorganismos probióticos. Alguns estudos têm relatado o emprego da técnica, para microencapsular, diferentes compostos (BEAULIEU et al., 2002; MUKAI-CORREA et al., 2004; KIM et al.,2008; GBASSI et al., 2009; YOKSAN et al., 2010).
Outra característica, nem sempre desejada, das microcápsulas formadas através da gelificação iônica é que as mesmas apresentam poros, pelos quais, o material encapsulado pode ser perdido, através da lixiviação ou da difusão do mesmo. Um posterior revestimento das microcápsulas pode diminuir/evitar os poros na rede do gel, dando a esta, uma maior estabilidade e proteção. Para isto, pode-se utilizar métodos combinados para melhorar a estabilidade da microcápsula, sendo a interação eletrostática muito utilizada para recobrir a cápsula com um outro polieletrólito de carga oposta, em geral uma proteína, ou de forma inversa, produzindo uma partícula com a proteína e posterior recobrimento com um polissacarídeo de carga oposta (LI, McCLEMENTS, 2011).
2.3 Alginato
Alginato é um nome coletivo dado aos sais do ácido algínico. Devido a sua característica de formar hidro géis na presença de cátions bivalentes, como o cálcio ou o bário, o alginato é amplamente utilizado na microencapsulação como material de parede. Sua obtenção é feita a partir de algas marrons (pardas) como Laminaria digitata e Macrocystis
pyrifera. (BOBBIO, BOBBIO et al., 2001; ARIFUL et al., 2010).
O alginato é um heteropolissacarídeo, aniônico, linear, com ligações glicosídica (α 1 → 4), entre dois diferentes ácidos, L- ácido gulurônico e D- ácido manurônico, que estão representados na Figura 2. Na formação do alginato pode ocorrer uma variação entre as unidades estruturais e a proporção/arranjo sequencial, decorrentes do extrato das algas marinhas e do processo de isolamento ou biotecnológico de obtenção (WANDREY et al., 2010), podendo assim apresentar blocos homogêneos (MM e GG) e blocos heterogêneos (GM) ao longo da cadeia do polímero; a maior parte dos alginatos disponíveis comercialmente está na forma de um sal, como por exemplo, os alginatos de cálcio e de sódio (GEORGE, ABRAHAM, 2006; WANG et al., 2006).
Figura 2 .Estrutura química do alginato, composto pelos ácidos D- manurônico e L- gulurônico (WANDREY et al., 2010).
As vantagens da sua utilização como material de parede incluem: a não toxicidade, isso faz com que não se tenha uma quantidade limite estipulada para consumo, simplicidade, biocompatibilidade, custo relativamente baixo, propensão à formação de gel com cloreto de cálcio para encapsular materiais sensíveis (KRASAEKOOPT et al., 2003).
Suas propriedades funcionais são definidas pela sua composição, estrutura, e massa molar, sendo que sua solubilidade em água está relacionada com a taxa de dissociação. O pKa
do alginato é de aproximadamente 3,5, sendo que em pH muito baixo, ambos os componentes estruturais, ácido manurônico e gulurônico precipitam na forma de ácido algínico. A composição e sequência das cadeias são importantes devido à seletividade da ligação catiônica sobre o gel formado, pois os cátions bivalentes preferencialmente se ligam ao bloco do ácido gulurônico como está representado na Figura 3. A força da ligação depende tanto da natureza dos cátions, como das propriedades do polímero, sendo que a gelificação do alginato pode acontecer rapidamente em contato com uma solução de cálcio (WANDREY et al., 2010; VOS et al., 2006; LI, McCLEMENTS, 2011).
Figura 3. Representação esquemática da associação entre o ácido gulurônico e o íon cálcio (WANDREY et al., 2010).
A ligação entre os resíduos dos grupos gulurônicos e o Ca2+ faz com que ocorra um entrelaçamento de cadeias de alginato, que contribui para a formação de hidrogel com uma estrutura de rede tridimensional também chamada de estrutura em forma de “caixa de ovo”. Esta ligação provoca dobraduras e empilhamentos na estrutura do alginato, fazendo com que pareça uma fita com dobras ordenadas ligadas por Ca 2+ ou aparência de “caixa de ovo” conforme está representado na Figura 4 (WANG et al., 2006).
Figura 4. Representação esquemática da estrutura em forma de caixa de ovo entre o alginato e o Ca 2+ (GEORGE, ABRAHAM, 2006).
Apesar de ser muito utilizado na microencapsulação como material de parede, o alginato possui limitações que podem inviabilizar a utilização da partícula, como o tamanho da cápsula formada, a concentração de alginato, a porosidade e a quantidade de material de núcleo a ser encapsulada (CHANDRAMOULI et al., 2004; CHÁVARRI et al., 2010; BURGAIN et al., 2011). A porosidade da membrana acaba permitindo a passagem de pequenas moléculas, restringindo seu uso para moléculas de baixo peso molecular e hidrofílicas (FUJIWARA et al., 2010). Para melhorar esta estabilidade as micropartículas produzidas necessitam posteriormente de um recobrimento para se tornar mais estáveis/funcionais.
2.4 Interação eletrostática
O recobrimento é uma maneira de aumentar a estabilidade da micropartícula, e para isto pode-se utilizar a interação eletrostática entre biopolímeros e a micropartícula obtida pela gelificação iônica (PATIL et al., 2010).
Em solução, interações eletrostáticas atrativas ou repulsivas podem ser utilizadas para microencapsulação. Nesta interação é importante conhecer a carga elétrica, o pH, a concentração e a força iônica presente no meio utilizado para produzir a interação dos polímeros envolvidos (McCLEMENTS, 2006).
A interação eletróstática, pode ser segregativa (onde os biopolímeros se repelem e são indicados como incompatíveis) ou associativas (onde os biopolímeros são capazes de atrair um ao outro). Quando ocorre esta atração, os dois polímeros se complexam produzindo uma separação espontânea de fases, isso é uma separação em sistema coloidal com duas fases líquidas, através da interação entre dois polímeros com cargas opostas, em uma mesma solução, que se associam formando um complexo neutro que precipita. Este método é muito eficiente para encapsular compostos com baixa solubilidade ou insolúveis em água (SCHMITT et al., 1998; KRUIF, TUINIER, 2001; KRUIF et al., 2004).
Para ocorrer uma interação eletrostática e para que possa ser otimizada, deve-se ter duas condições: os biopolímeros devem estar juntos em solução e as cargas opostas devem estar em quantidades estequiométricas (ALVIM, 2005).
Ela pode ser realizada em meio aquoso ou orgânico, dependendo das propriedades físico-químicas do polímero que será empregado e do material a ser encapsulado (SUAVE et
al., 2006). A não utilização de solventes organicos faz com que a interação eletrostática seja
muito explorada na produção de micropartículas, principalmente na área de alimentos (PRATA, GROSSO, 2011).
Biopolímeros como proteínas e polissacarídeos são os mais utilizados para a interação eletrostática, porém também pode haver interação entre dois polissacarídeos como, por exemplo, alginato e quitosana. Além dos fatores citados que influenciam a interação eletrostática, tem-se também a força iônica, densidade e a concentração dos polissacarídeos (YE, 2008).
Para que ocorra a interação eletrostática entre estes biopolímeros (proteína e polissacarídeo), eles devem estar carregados com cargas opostas, sendo os responsáveis pela carga eletrostática os grupamentos laterais no caso das proteínas, como os resíduos de aminoácios, entre outros. Já a carga dos polissacarídeos é resultante de resíduos de ácido glucurônico, grupamentos aminas, resíduos carboxílicos entre outros. Analisando a diferença das cargas conclui-se que proteínas e polissacarídeos constituem os principais materiais utilizados e que sua carga define a interação eletrostática, por isso é necessário realizar um estudo prévio dos materiais a serem utilizados (TOLSTOGUZOV, 1991; ALVIM, 2005).
Alguns fatores influenciam esta interação, sendo eles: forças das cargas opostas, mudanças na temperatura, pH e tempo de interação. Controlar estes fatores, potencializa e induz a interação eletrostática e também melhora a qualidade do produto obtido (BURGESS, CARLESS, 1984; CHILVERS et al., 1988; GANDER et al., 2002).
A estequiometria de um complexo eletrostático depende da conformação e da carga global dos reagentes. Devido a limitações topológicas, proteínas globulares e cadeias de polissacarídeos aniônicos rígidos não conseguem contato entre todos seus grupos carregados. Ao contrário, estruturas de proteínas desdobradas (como a gelatina) tendem a formar o máximo de contato com um polissacarídeo com carga oposta. No entanto, proteínas com uma estrutura desdobrada usualmente formam complexos insolúveis eletricamente neutros, onde as cargas dos componentes são mutuamente neutralizadas (TOLSTOGUZOV, 2003).
2.5 Gelatina
A gelatina é uma proteína de origem animal, capaz de formar um gel termo reversível; o mecanismo de formação envolve interligações iônicas entre grupos amino e carboxílicos dos aminoácidos, com a ajuda de pontes de hidrogênio (FENNEMA, 1996; FARRIS et al., 2009).
Ela é um hidrocolóide de natureza hidrofílica, sendo derivada da dissociação térmica ou química das cadeias polipeptídicas do colágeno. Independente da fonte, a gelatina contém
em média 18 aminoácidos sendo predominantes a glicina e a prolina (ARVANITOYANNIS, 2002).
A gelatina é facilmente digerida e tem em sua composição quase todos os aminoácidos essenciais, com exceção apenas do triptofano. A gelatina comercial pode ser definida de acordo com o método de extração utilizado, isto é, se é resultante da hidrólise ácida ou básica do colágeno, determinando assim pontos isoelétricos diferentes (POPPE, 1997).
Para sua obtenção, o colágeno é desnaturado à uma temperatura entre 50 e 60ºC e posteriormente submetido à hidrólise (ácida ou básica) para quebra das ligações covalentes. A gelatina obtida por hidrólise ácida é chamada gelatina tipo A, e possui ponto isoelétrico entre 7,0 e 9,0, já a gelatina obtida por hidrólise básica é denominada como gelatina tipo B, possui ponto isoelétrico situado entre 4,6 e 5,2 (GENNADIOS et al., 1994).
No pH ácido, a gelatina terá carga positiva líquida e, portanto, pode ser capaz de formar complexos com moléculas de polissacarídeos carregados negativamente, tais como a pectina e o alginato (SARAVANAN, RAO, 2010). O peso molecular da gelatina pode ser influenciado pelo tipo de matéria prima e das condições de processo utilizados na sua obtenção. De maneira geral seu peso molecular pode variar de 300 a 200.000 D (KROCHTA,
et al., 1994).
A tecnologia da microencapsulação utiliza amplamente a gelatina por ter a mesma capacidade de se associar através de interações eletrostática com polissacarídeos como o alginato e a pectina ou demais polímeros com cargas opostas através da interação eletrostática, formando assim um precipitado que tem as seguintes características: micropartículas resistentes, estáveis e pouco porosas (FARRIS et al., 2009).
2.6 Colágeno Hidrolisado
O colágeno é uma proteína fibrosa presente na pele, tendões, vasos sanguíneos, intestinos e cartilagens, correspondendo a 30% da proteína total e a 6% em peso do corpo humano (TONHI, PLEPIS, 2002). A gelatina e os derivados do colágeno contêm 20 tipos de aminoácidos que são fundamentais ao corpo humano (LEE et al., 2012).
As fontes mais abundantes de colágeno são pele de porco, couro bovino, e cartilagens e ossos destes animais. Recentemente na indústria alimentícia, um número crescente de novas aplicações do colágeno e gelatina têm sido encontradas em produtos, tais como: emulsionantes, agentes formadores de espuma, estabilizantes coloidais, formação de película biodegradável, materiais e agentes de microencapsulação, em linha com a tendência crescente para substituir agentes sintéticos com os mais naturais (GÓMEZ-GUILLÉN, et al.,2011).
O colágeno hidrolisado COLLAGEL® foi desenvolvido pela empresa Gelita e é um produto proteico de coloração amarelo claro obtido pela extração do colágeno nativo, derivado do tecido animal. Esta extração é feita através de um processo rigoroso de controle de hidrólise para lhe conferir uma distribuição especial de peso molecular que lhe atribui propriedades emulsificantes. Segundo o produtor Gelita, este tipo de colágeno pode ser utilizado em bebidas em geral, barras de cereais, suplementos alimentares e também como complemento proteico em sobremesas e confeitos. O Collagel possui peso molecular ≥ 10.000 D e um teor de proteína superior a 90%.
O colágeno hidrolisado FORTIGEL® foi desenvolvido e fabricado pela empresa Gelita, com a finalidade de manter a saúde das articulações. Vem ao mercado como um ingrediente inovador que contribui para a regeneração da cartilagem. O FORTIGEL® é uma proteína natural de odor e sabor neutros que pode ser facilmente integrada em várias aplicações, oferecendo excelente solubilidade e produz soluções claras sem interagir com outros ingredientes. Pode aprimorar variados gêneros alimentícios, incluindo laticínios, alimentos funcionais, suplementos alimentares e bebidas. O consumo do FORTIGEL® é proposto para resultar no alívio dos sintomas e aprimoramento da mobilidade em indivíduos
saudáveis. Segunda a fabricante o produto possui um teor de proteína de aproximadamente 97% e é intensamente hidrolisado, não tendo o peso molecular exato descrito pela fabricante.
A utilização destes produtos para produção de coacervados de gelatina ou colágenos hidrolisados complexados com polímeros aniônicos sob a forma de microcápsulas são de especial interesse, pois podem carrear componentes funcionais, fornecer proteção contra a oxidação ou degradação durante a armazenagem. Além disso, o encapsulamento pode também controlar a libertação de componentes funcionais do alimento ou fármaco quando ingeridos (GÓMEZ-GUILLÉN, et al., 2011).
3.
MATERIAL E MÉTODOS
3.1 Materiais
Os materiais utilizados para a produção dos coacervados e das micropartículas foram: alginato de sódio Manugel DMB (alto peso molecular, alto conteúdo de ácido gulurônico, FMC BioPolymer, lote G470020); gelatina alimentícia tipo A (Gelita, 240P/6, lote 21502 P-04); colágeno Hidrolisado Collagel® (Gelita, lote LF22703 11, peso molecular > 10.000 D ); colágeno Hidrolisado Fortigel® (Gelita, lote LF897757 09, intensamente hidrolisado ); Óleo de girassol Mazola (Cargil Agrícola, Mairinque-SP); cloreto de cálcio anidro (Dinâmica, P.M: 110,99, lote 44034, Diadema – SP, Brasil); hidróxido de sódio (Dinâmica, P.M:40, lote 53187, Diadema – SP, Brasil); ácido clorídrico (Merck, Alemanha); ácido sulfúrico (Synth, P.M: 98,08, Diadema - SP, Brasil,). Água destilada e deionizada foram utilizadas bem como os demais reagentes foram de grau analítico.
3.2 Caracterização dos biopolímeros
3.2.1 Determinação de proteína, umidade e cinzas
O alginato de sódio utilizado nos experimentos foi caracterizado quanto a sua composição centesimal, determinando-se o teor de proteína, umidade e cinzas. Para a gelatina e os hidrolisados foi determinado o teor de proteína e umidade.
Para determinação de proteína, o conteúdo de nitrogênio total foi obtido pelo método de Kjeldahl (AOAC, 2006), para a conversão do teor de nitrogênio total para proteína utilizou-se um fator de conversão para gelatina e hidrolisados de 5,55. O teor de umidade (secagem em estufa a temperatura de 105ºC por 12 horas) e o teor de cinzas foram determinados de acordo com AOAC (2006).
3.2.2 Distribuição de massa molar
A distribuição de massa molar dos materiais proteicos foi avaliada através de eletroforese em equipamento Mini-Protean II Bio Rad (USA). A eletroforese da gelatina e do hidrolisado Collagel® foi realizada em gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) de acordo com a metodologia descrita por Laemmli (1970). Foi utilizado gel de 0,75 mm de espessura, sendo os géis de empacotamento de 4% e de separação de 7%. As amostras foram dispersas na proporção de 1% (p/p) em tampão redutor (Tris-HCl 62,5mM; SDS 2%; glicerol 20%; β-mercaptoetanol 5% e azul de bromofenol, pH 6,8) e aquecidas a 95°C por cinco minutos. No gel foram aplicados 4μl de amostra (gelatina) e 10μl de amostra (hidrolisados). A corrida foi realizada a 70V, à temperatura ambiente (23 ± 2°C) durante três horas. As bandas de proteína foram coradas com solução de Coomassie Blue G-250 e para descoloração foi utilizada uma solução contendo metanol (40%) e ácido acético (10%), a descoloração foi feita gradualmente. Após a descoloração fez se a comparação com as bandas das proteínas padrão com massas molares que variaram de 10 a 250 kD (Bio-Rad Laboratories Ltda., Cód: 161-0375).
Para analisar a distribuição de massa molar do hidrolisado Fortigel® foi realizada eletroforese em gel de poliacrilamida-SDS-Tricina de acordo com a metodologia descrita por Laemmli (1970) e adaptada por Schagger e Von Jagow (1987), onde o íon carregador glicina é substituído por tricina. A utilização da tricina permite melhor resolução de pequenas proteínas (menor que 14kD). O gel utilizado foi de 1,5 mm de espessura, sendo os géis de empacotamento de 4% e de separação de 16,5%. As amostras foram dispersas na concentração de 1% (p/p) em tampão redutor (Tris-HCl 62,5mM; SDS 2%; glicerol 20%; β-mercaptoetanol 5% e comassie blue G-250; pH 6,8) e aquecidas a 95°C por cinco minutos. Nas canaletas do gel foram aplicados 20μl de amostra. A corrida foi realizada a 85V, à temperatura ambiente (23 ± 2°C). As bandas de proteína foram coradas com solução de Coomassie Brilliant Blue R-250 (0,1%) e uma solução contendo metanol (40%) e ácido acético (10%) foi utilizada para descorar os géis. Após a descoloração fez se a comparação com as bandas das proteínas padrão com massas molares variando de 1,42 a 26.62 kD (Bio-Rad Laboratories Ltda., Cód: 161-0326).
3.2.3 Determinação da carga superficial dos polímeros
A medida de cargas foi realizada através da determinação do potencial zeta, utilizando o equipamento Zetasizer (modelo Nano-Z, Malvern Instrumentos, Worcestershire, U.K.). Para a determinação foram preparadas soluções de alginato, gelatina, hidrolisado Collagel® e hidrolisado Fortigel® na concentração de 0,1% (p/p). Para a determinação, a solução de alginato foi mantida em agitação constante por 12 horas para sua completa solubilização em temperatura ambiente. Soluções de gelatina e dos hidrolisados foram colocados também sob agitação constante e temperatura de 45ºC por aproximadamente 1 hora para leitura subsequente. Foram feitas leituras, na faixa de pH entre 3 e 7, o ajuste do pH das soluções estudadas foi feito através de titulação manual utilizando ácido clorídrico (HCl) e hidróxido de sódio (NaOH) a 0,1 N, sendo a leitura do pH feita em pHmetro (Digimed, DM 20, S.P., Brasil).
3.3 Produção dos coacervados utilizando sistemas diluídos
Para a produção de coacervados, previamente foram testadas misturas de solução a 0,1% em diferentes pHs (pH 3, 3,5 e 4) para que fosse escolhido o pH que possibilitasse a maior interação entre o polissacarídeo e gelatina. Após a coacervação, os sistemas em diferentes valores de pH foram avaliados identificando-se visualmente o pH onde ocorreu a maior produção de coacervados.
O valor de pH que permitiu a maior produção de coacervados foi utilizado para a continuidade dos experimentos. Após este teste preliminar o pH determinado foi utilizado para a produção dos coacervados com gelatina (utilizado no teste preliminar) e também os hidrolisados Collagel e Fortigel. Para este valor de pH foram avaliados os seguintes sistemas: a. Solução de Polissacarídeo (Alginato): Solução de Proteína (Gelatina tipo A, Hidrolisado Collagel e Hidrolisado Fortigel); b. Emulsão de Polissacarídeo (Alginato) : Solução de Proteína (Gelatina tipo A, Hidrolisado Collagel e Hidrolisado Fortigel) e c. Suspensão de
Micropartículas (Alginato) : Solução de Proteína (Gelatina tipo A, Hidrolisado Collagel e Hidrolisado Fortigel).
A mistura de soluções foi realizada utilizando alginato a 0,1% (p/p) e as proteínas estudadas também a 0,1% (p/p). A emulsão foi preparada como se fosse para a produção de micropartículas e depois diluída a 0,1% (p/p), voltando a ser emulsionada em Ultra turrax® e misturada com as soluções de proteína a 0,1% (p/p). As partículas utilizadas na suspensão foram produzidas como descrito no item 3.4.1 e colocadas em suspensão com solução ácida (água com pH ajustado para 3 e mantidas sob agitação até o momento da mistura com a solução de proteína a 0,1% (p/p). As misturas foram realizadas em tubo de ensaio de 30 ml com tampa rosqueável, para porcionar as quantidades necessárias. Foram utilizadas pipetas volumétricas de 10 e 50 ml para este fim.
A partir desta avaliação, e da descrição feita acima foram preparados sistemas contendo misturas de soluções do polissacarídeo e da proteína e dos hidrolisados, em diferentes relações volumétricas. Foram avaliadas as seguintes relações polissacarídeo: proteína, 1:1, 1:1,5, 1:1,75, 1:2, 1:3, 1:4, 1:6, 1:8 e 1:10, mantendo-se o volume final constante em 30 mL.
Em todos os sistemas, após a preparação, os coacervados produzidos pelas misturas permaneceram em repouso por 4 horas e após este período, os sistemas foram fotografados. Análises adicionais incluindo (potencial zeta, tamanho dos coacervados e teor de proteína remanescente no sobrenadante) foram efetuadas conforme descritos posteriormente.
3.3.1 Produção de coacervados através da mistura entre soluções polissacarídeo: proteína/hidrolisados
A produção dos coacervados utilizando misturas de soluções (Polissacarídeo: Proteína) foi realizada da seguinte maneira: foram preparadas soluções a 0,1% (p/p) de alginato, gelatina e dos hidrolisados. Para completa dissolução do alginato, a solução a 0,1% permaneceu 12 horas sob agitação magnética a temperatura ambiente enquanto gelatina e os hidrolisados foram solubilizados por 30 minutos sob agitação magnética a temperatura de 45°C. Após a dissolução do polissacarídeo e das proteínas, o pH das soluções foi ajustado
para 3 com a adição de ácido clorídrico a 2,5N e 0,1N. A partir disto foram preparadas as misturas entre os biopolímeros respeitando o procedimento e as relações descritas no item 3.3.
3.3.2 Produção de coacervados através da mistura entre emulsão contendo polissacarídeo: óleo de girassol e uma solução de proteína/hidrolisados
Para a mistura entre a emulsão e as soluções, foi feita uma emulsão a partir de uma solução aquosa de alginato a 2% (p/p) contendo 1,65% (p/p) de óleo de girassol sendo emulsificada em Ultra turrax® (IKA, Works do Brasil, RJ) por 3 minutos a velocidade de 14000 rpm. Após a obtenção da emulsão, a mesma foi diluída com água deionizada para 0,1% e novamente emulsificada em Ultra turrax®, na mesma velocidade por 1 minuto. Posteriormente, o pH da emulsão foi ajustado para 3 por adição de ácido clorídrico. A preparação da solução de proteína, foi feita a 0,1%, mantendo as condições descritas em 3.3.1.
Após a emulsão e solução estarem prontas a 0,1% com pH ajustado para 3, fez-se a mistura respeitando o procedimento e as relações descritas no item 3.3.
3.3.3 Produção de coacervados através da mistura de micropartículas de alginato/óleo de girassol e solução de proteína/hidrolisados
A mistura entre uma suspensão de micropartículas produzidas por gelificação iônica contendo óleo de girassol emulsionado, (item 3.4.1) e solução de proteína e dos hidrolisados, foi feita da seguinte maneira: primeiramente produziu-se as micropartículas de alginato, depois de prontas, suspendeu-se uma determinada quantidade de micropartículas em solução ácida (água com pH ajustado para 3 através da adição de ácido clorídrico) para que a suspensão ficasse na concentração de 0,1% (p/p). A preparação das soluções de proteína e dos hidrolisados foi feita a 0,1%, mantendo as condições descritas em 3.3.1.
Para a mistura a suspensão de micropartículas ficou sob agitação magnética para evitar a sedimentação. A mistura foi feita em tubos de vidro com tampa rosqueada, de acordo com o procedimento e as relações estipuladas no item 3.3. Depois que a mistura estava pronta, os tubos foram mantidos sob agitação por 1 hora a temperatura ambiente, para favorecer a interação eletrostática entre as soluções proteicas e a suspensão das micropartículas, e assim evitar a sua sedimentação durante a complexação. A agitação foi feita em agitador de tubos (Homogeneizador de sangue, AP 22, Phoenix, Araraquara, Brasil). Após a agitação os tubos permaneceram em repouso por 12 horas para a realização das análises subsequentes. Para os itens 3.3.1; 3.3.2. e 3.3.3.. Todos os sistemas foram produzidos em triplicata de forma independente.
3.3.4. Determinação da carga superficial
A leitura da carga superficial dos coacervados foi feita através da medida do potencial zeta como descrito no item 3.2.3. Para esta determinação, foram utilizados os sistemas contendo misturas de solução do polissacarídeo: soluções de proteína e dos hidrolisados e das misturas contendo a emulsão polissacarídeo/óleo de girassol e das soluções de proteína e dos hidrolisados. Os coacervados obtidos a partir das misturas contendo micropartículas obtidas por gelificação iônica emulsionadas com óleo de girassol e as soluções de gelatina e dos hidrolisados não foram avaliados quanto ao potencial zeta uma vez que as micropartículas sedimentam rapidamente não sendo possível esta determinação através da medida do potencial zeta eletroforético (Zetasizer).
As misturas que estavam em repouso por 4 horas, mantendo se a metodologia do item 3.3, foi agitada manualmente no momento da leitura retirando-se rapidamente uma alíquota que foi transferida para a cubeta de medida do Zetasizer e a leitura efetuada rapidamente. As determinações do potencial zeta foram feitas em triplicata, sendo assim o valor expresso representa a média de nove valores obtidos.
3.3.5 Determinação da proteína remanescente no sobrenadante após a coacervação
A determinação de proteína remanescente nos sobrenadantes dos sistemas contendo partículas obtidas por gelificação iônica emulsionadas com óleo de girassol e soluções de gelatina e dos hidrolisados foi realizada com a finalidade de avaliar a quantidade de proteína/hidrolisados que não foi adsorvida sobre as partículas, nas diferentes relações quantidade de micropartícula: quantidade de gelatina/hidrolisados estudadas.
A determinação de proteína no sobrenadante foi feita através do kit Bicinchoninic Acid
Protein Assay (BCA, Sigma, 29396 DM, St. Louis, USA) de acordo com procedimento
definido catalogos Sigma BCA 1 and B9643.
Para esta determinação foram estudadas as misturas das partículas emulsionadas: soluções proteicas, conforme descrito no item 3.3.3. porém na concentração de 0,5%. Os sistemas estudados foram: (a) suspensão de micropartículas 0,5% e solução de gelatina 0,5%; (b) suspensão de micropartículas 0,5% e solução de hidrolisado Collagel® 0,5% e (c) suspensão de micropartículas 0,5% e solução de hidrolisado Fortigel® 0,5%. Depois da agitação para se obter a adsorção proteica e da sedimentação após o repouso dos sistemas, as amostras foram centrifugadas em centrífuga (RC-5C Sorvall Instruments, Wilmignton, USA) por 20 minutos a 17.000 rpm, e em seguida, 25 µl dos sobrenadantes transferidos aos poços de uma placa de leitura contendo 96 poços. Na sequência, foram adicionados 200l de reagente e as amostras foram incubadas a 37ºC por 30 minutos. A determinação do teor de proteína contido na amostra foi feita por determinação colorimétrica (leitura em espectrofotômetro 562 m, Espectrofotômetro de microplaca marca Synergy HT, Biotek (Vermont, USA) com software Gen5™ 2.0 para análise dos dados). A quantificação da proteína foi feita a partir de três curvas padrão obtidas utilizando-se uma solução de gelatina, hidrolisado Collagel e hidrolisado Fortigel a 0,5% (p/p). As amostras foram diluídas para atender uma ampla faixa de concentrações na curva padrão. Para as diluições, utilizou-se água destilada e deionizada. Cada sistema foi produzido em triplicatas independentes e para cada relação de quantidade de suspensão de microparticulas: soluções de proteína e dos
hidrolisados a quantidade de proteína não adsorvida sobre as particulas e, determinadas nos sobrenadantes, foi feita em triplicata.
3.4 Sistemas concentrados
3.4.1 Produção de micropartículas por gelificação iônica
Para produzir as micropartículas pelo método de gelificação iônica, foi preparada uma solução aquosa de alginato 2% (p/p) com água destilada e deionizada, mantendo-se a solução sob agitação magnética constante por no mínimo 12 horas para completa dissolução do alginato. Após a dissolução, foi preparada a emulsão adicionando-se óleo de girassol 1,65% (p/p). A solução de alginato e o óleo de girassol foram emulsificados em Ultra turrax® (IKA, Works do Brasil, RJ), por 3 minutos a 14.000 rpm.
A emulsão preparada foi atomizada sobre uma solução de cloreto de cálcio 2% (p/v) com pH ajustado para 3 através da adição de ácido clorídrico 2,5N. Para carrear a emulsão utilizou-se uma bomba peristáltica (com velocidade de fluxo de 556 mL/hora). A atomização foi feita através de um bico atomizador duplo fluido com diâmetro de 1 mm, sob uma altura de 12 cm entre o bico e a solução de cloreto de cálcio, pressão do ar de 0,125 kgf/cm2. As condições seguidas foram otimizadas anteriormente por Mukai-Correa et al.(2004). Durante a atomização a emulsão de alginato permaneceu sob agitação e temperatura de 40ºC, devida a sua viscosidade. Este procedimento facilitou a passagem pelo bico atomizador.
Depois da atomização, as micropartículas obtidas permaneceram na solução de cloreto de cálcio por mais 30 minutos para a cura, mantidas sob agitação constante. Após a cura as micropartículas produzidas foram separadas em peneira de malha de aço com abertura de 53 µm, posteriormente mantidas em água deionizada ajustada a pH 3,0 por 5 min e lavadas
