4. RESULTADOS E DISCUSSÃO
4.3 Sistemas concentrados
4.3.1 Caracterização das micropartículas
Inicialmente, os coacervados produzidos pela mistura de micropartículas: soluções de gelatina e soluções de hidrolisados Collagel e Fortigel, foram avaliados em condições muito diluídas, conforme descritos no item 3.3.3 (M & M). Esta etapa foi realizada com o objetivo de identificar as melhores relações para se trabalhar utilizando uma determinada quantidade de partículas: diferentes concentrações de gelatina e dos hidrolisados Collagel e Fortigel, que poderiam auxiliar nas condições mais concentradas de interação partículas: materiais proteicos.
As concentrações de proteínas foram escolhidas para a interação eletrostática seguindo as proporções dos sistemas diluídos. As proporções que produziram as maiores quantidades de coacervados na maior parte do estudo (visualizadas nas fotografias dos sistemas) 1:1, 1:1,1,5, 1:1,75 e 1:2 em todos os sistemas conforme discutido anteriormente. Nestas relações 1:1 e 1:2, conseguiu-se uma boa adsorção de proteína e uma boa quantidade de coacervados produzidos, mesmo utilizando uma baixa quantidade de proteína e de alginato em solução, emulsão ou na forma de partículas.
Além da proporção 1:1 e 1:2, para o estudo com os sistemas concentrados as seguintes proporções volumétricas 1:4, 1:6, 1:8 e 1:10 também foram estudadas, correspondendo aos teores de 1, 2, 4, 6, 8 e 10 % de proteína em solução. A interação eletrostática foi então realizada, respeitando-se estas relações polissacarídeo: proteína, identificadas nos sistemas diluídos, para manter as relações pré-determinadas. Uma quantidade fixa de partícula (100 g) foi colocada em 200 mL de solução proteica, sendo que com o aumento da concentração proteica, aumentou-se somente a quantidade de gelatina e dos hidrolisados em solução, mantendo-se, o mesmo volume final. Após a interação eletrostática estas micropartículas recobertas com diferentes concentrações de gelatina, Collagel e Fortigel foram analisadas para quantificar seu conteúdo de umidade e o teor de proteína adsorvido (Tabelas 3 e 4 respectivamente).
Tabela 3. Teor de umidade (%) nas micropartículas em função da concentração de proteína em solução. Proporção Vol. por Vol. PTN em sol. Umidade (%)
Gelatina Collagel Fortigel
1:1 1% 86,9 ± 1,0Ac 89,8 ± 0,6Ab 91,6 ± 0,8Aa 1:2 2% 86,0 ± 0,8Ac 87,2 ± 0,9Bb 88,8 ± 0,8BCa 1:4 4% 82,6 ± 0,6Bc 86,1 ± 1,4BCb 88,8 ± 0,2BCa 1:6 6% 78,4 ± 1,0Cc 83,8 ± 0,8Cb 89,1 ± 0,5BCa 1:8 8% 78,0 ± 1,1CDc 85,4 ± 0,9Db 89,4 ± 0,7Ba 1:10 10% 76,6 ± 2,2Dc 81,1 ± 0,9Eb 88,2 ± 0,5Ca
* Médias seguidas das mesmas letras (Maiúsculas na coluna e minúsculas na linha) não diferiram de acordo com o teste de Tukey (p>0,05).
Tabela 4. Teor de proteína adsorvido nas micropartículas em função da concentração de proteína em solução (%).
Proporção Vol. por Vol.
PTN em sol.
Proteína adsorvida (%)
Gelatina Collagel Fortigel
1:1 1% 26, 5 ± 0,6Ea 25,1 ± 0,5Eb 16,3 ± 0,4Ec 1:2 2% 35,2 ± 2,0Da 29,8 ± 0,7Db 19,6 ± 0,4Dc 1:4 4% 38,9 ± 0,7Ca 32,6 ± 0,8Cb 21,2 ± 0,9Cc 1:6 6% 44,0 ± 2,1Ba 40,1 ± 0,6Bb 24,7 ± 0,6Bc 1:8 8% 44,4 ± 1,4Ba 40,8 ± 1,4ABb 24,2 ± 1,0Bc 1:10 10% 47,3 ± 1,1Aa 41,4 ± 0,5Ab 29,3 ± 0,5Ac
* Médias seguidas das mesmas letras (Maiúsculas na coluna e minúsculas na linha) não diferiram de acordo com o teste de Tukey (p>0,05).
Analisando-se o teor de umidade das partículas nos sistemas estudados pode-se verificar que o aumento de proteína em solução e o consequente aumento da proteína
adsorvida, nos casos em que gelatina e o hidrolisado Collagel foram utilizados, ocorreu uma diminuição no teor de umidade da micropartícula. O hidrolisado Fortigel, devido a menor adsorção de proteínas, também apresentou menor redução no teor de umidade. Efeito idêntico foi observado anteriormente para partículas produzidas por gelificação iônica recobertas com proteínas (SOUZA et al., 2012; TELLO et al., 2014).
Ao se analisar a porcentagem de proteína adsorvida nas micropartículas (Tabela 4), pode-se observar aumento desta à medida que se aumenta a quantidade de proteína em solução, novamente para o caso da gelatina e dos hidrolisados utilizados. Efeito idêntico foi apresentado anteriormente para partículas produzidas por gelificação iônica recobertas com proteínas (SOUZA et al., 2012; TELLO et al., 2014). Valores máximos de adsorção ocorreram na máxima concentração estudada (10%), atingindo 47,3%; 41,4% e 29,3% para a gelatina, o Collagel e o Fortigel respectivamente.
No caso do Fortigel, observa-se também um aumento no teor de proteína adsorvida conforme a quantidade de material proteico aumenta em solução, porém a quantidade adsorvida é significativamente menor que a observada no caso da gelatina e do Collagel. Conforme discutido na solubilidade dos materiais proteicos (4.2.4), a hipótese de que moléculas menores poderiam, além da adsorção eletrostática, penetrar através dos poros presentes nas partículas de gelificação iônica, não se confirmou para o hidrolisado de menor massa molar (Fortigel). Uma possibilidade a ser estudada futuramente é que seja necessária uma sequência mínima de cargas sequenciais, ou seja, de grupos laterais carregados dos aminoácidos para que a adsorção possa ser facilitada com ou sem penetração dos materiais proteicos pelos poros das partículas.
4.3.2 Tamanho médio e distribuição de tamanho das micropartículas
Os tamanhos médios (D 0,5) das micropartículas de gelificação iônica revestidas com
diferentes concentrações de proteína adsorvida também foram avaliados e encontram-se na Tabela 5. As micropartículas de gelificação iônica sem cobrimento, produzidas para esta etapa do trabalho, apresentaram tamanhos variando entre 83,4±16,6 e 105,2 ± 34,0 µm, decorrentes
das condições de atomização utilizadas. Em estudo anterior, o tamanho médio das partículas de alginato variou de acordo com o tamanho do diâmetro da agulha utilizada para sua produção e a composição do alginato empregado (MOYA et al., 2012). Em relação ao tamanho das partículas de gelificação iônica, independente do material proteico utilizado (gelatina, Collagel ou Fortigel) a adsorção produziu aumento no diâmetro médio das partículas.
Quando a adsorção foi feita com gelatina (Tabela 5) observou-se um aumento progressivo e significativo estatisticamente (p < 0,05) entre os tamanhos obtidos com 1% e 10% de gelatina em solução, respectivamente 122,9 ±13,1 µm e 200,2 ±53,5 µm. Partículas revestidas com gelatina, quando 6, 8 e 10% de proteína em solução foram utilizadas para a adsorção, foram significativamente diferentes e maiores que as partículas obtidas quando Collagel ou Fortigel foram utilizados.
Embora o aumento do teor de proteína adsorvida tenha ocorrido de forma significativa estatisticamente para a gelatina, o Collagel e o Fortigel quando o teor de proteína foi aumentado em solução, aumentos de tamanho com o aumento da quantidade adsorvida foi observado no caso da gelatina, porém não se observaram diferenças significativas entre os diâmetros, no caso da adsorção do Collagel ou do Fortigel.
Tabela 5. Tamanho médio (D 0,5) das micropartículas de gelificação iônica recobertas com diferentes teores de proteína em solução.
* Médias seguidas das mesmas letras (Maiúsculas na coluna e minúsculas na linha) não diferiram de acordo com o teste de Tukey (p>0,05). A distribuição do tamanho das micropartículas de alginato de sódio adicionadas de diferentes concentrações de proteínas (gelatina, Collagel e Fortigel).
Teor de ptn em solução (%) GI + Interação com o Gelatina (µm) GI + Interação com o Collagel (µm) GI + Interação com o Fortigel (µm) 1% 122,9 ±13,1 Ba 132,6±7,8Aa 139,8±9,7Aa 2% 137,1 ±11,3 Ba 143,1±6,4Aa 117,8±5,9Aa 4% 147,7 ±31,3ABa 135,0±33,9Aa 134,9±22,7Aa 6% 164,9 ±20,2 ABa 110,1±4,0Ab 132,5±13,4Ab 8% 158,3 ±15,3ABa 111,2±6,1Ab 116,3±6,3Ab 10% 200,2 ±53,5 Aa 128,9±22,9Aa 120,5±16,6Aa
4.3.3 Morfologia
Através da microscopia óptica (Figura 20), foi possível observar a morfologia e estrutura interna das micropartículas úmidas estudadas após a adsorção da proteína (gelatina e dos hidrolisados) utilizando-se diferentes concentrações de proteína em solução.
Gelificação Iônica
Gelatina Hidrolisado Collagel Hidrolisado Fortigel
1%
2%
6%
8%
10 %
Figura 20. Morfologia através da microscopia ótica das micropartículas úmidas de gelificação iônica (GI) recobertas com solução de proteína em diferentes concentrações (%).
As imagens da microscopia ótica mostraram que as partículas apresentaram formato esférico, sendo matrizes multinucleadas, com gotas lipídicas espalhadas homogeneamente ao longo da matriz formadora das micropartículas.
O recobrimento das partículas com gelatina, Collagel e Fortigel em diferentes concentrações testadas não alterou a morfologia das partículas, porém as partículas recobertas aparentaram estar mais densas após a cobertura, em comparação a partícula de gelificação iônica. Independente da porcentagem de adsorção de proteína as características morfológicas permaneceram similares entre si.
Após a secagem por liofilização, as micropartículas foram avaliadas com relação a morfologia de superfície obtida por microscopia eletrônica de varredura (Figura 21) quando teores de 2 e 10 % de proteína em solução foram utilizados para o recobrimento. Nas imagens
obtidas, pode-se constatar que a estrutura das micropartículas se manteve parcialmente íntegra e esférica após o processo de liofilização. As pequenas bolhas na parede das partículas são provenientes de vesículas de óleo, devido ao tipo de agitador utilizado para produzir as emulsões, anterior a gelificação iônica. Estas vesículas podem ser diminuídas utilizando-se alternativas de maior energia, como homogeneizadores de alta pressão para a produção das emulsões anterior a gelificação iônica e a adsorção proteica. A presença das rugosidades, observadas na superfície, está associada à camada proteica adsorvida sobre a micropartícula. As micropartículas de gelatina apresentam se mais densas e rugosas que as demais partículas produzidas com Collagel ou Fortigel. Em estudo realizado por Li et al.(2009), a introdução de gelatina resultou numa superfície mais densa das microcápsulas em comparação com a morfologia da superfície das microcápsulas sem a presença da gelatina. O anexo 5 apresenta alguns detalhes das partículas liofilizadas com os diferentes tipos de materiais de cobertura utilizados.
Teor de Proteína em solução Tipo de Proteína 2% 10% Gelatina Hidrolisado Collagel Hidrolisado Fortigel
Figura 21. Morfologia por MEV de micropartículas produzidas por gelificação iônica e interação eletrostática em solução com proteína e hidrolisados proteicos, liofilizadas.
4.3.4 Microscopia ótica das micropartículas seccionadas
A Figura 22 apresenta as micrografias de partículas embebidas no material polimerizado e posteriormente fatiadas no micrótomo, observadas por microscopia ótica para partículas produzidas por gelificação iônica e posteriormente recobertas com gelatina, com concentração de 2% de proteína em solução. Pode-se observar que as partículas de gelificação iônica (Fig. 22.1) coradas com o Comassie Blue, que é um corante específico para proteína, não apresentaram coloração, indicando que estas partículas não continham proteína, como esperado. Na Figura 22.2, as partículas de gelificação iônica foram coradas com o PAS, corante específico para polissacarídeos (carboidratos), adquirindo uma coloração rosa típica da interação PAS-carboidratos e não apresentando coloração sobre as vesículas de óleo, resultado também esperado. Na Fig. 22.3, partículas de gelificação iônica recobertas com 2% de gelatina em solução foram coradas com Comasssie Blue, um corante específico para proteínas, podendo-se observar um halo azul no perímetro das partículas correspondendo à camada de proteína adsorvida sobre as partículas obtidas por gelificação iônica.
1. 2. 3.
Figura 22. Microscopia ótica das micropartículas seccionadas e coradas com Comassie Blue e PAS. Sendo 1. Partículas de GI coradas com o Comassie Blue, 2. Partículas de GI coradas com o PAS, 3. Partículas revestidas com gelatina e coradas com o Comassie Blue.
Tipo de Proteína Micropartículas Coradas Gelatina 2% Hidrolisado Collagel 2% Hidrolisado Fortigel 10%
Figura 23. Microscopia ótica das micropartículas seccionadas e coradas com Comassie Blue e PAS.
Após o teste inicial (Fig. 22), onde as partículas foram submetidas a colorações individuais com o PAS ou com o Comassie Blue, uma nova série de colorações com os dois corantes aplicados sucessivamente sobre lâminas seccionadas no micrótomo contendo partículas de gelificação iônica com a proteína ou os hidrolisados adsorvidos, foi realizada. Para estes ensaios foram testadas partículas de gelificação iônica contendo gelatina adsorvida quando 2% de gelatina ou o Collagel e quando 10% de Fortigel estavam presentes em solução, respectivamente.
Na observação das micropartículas seccionadas (Fig. 23) pode-se confirmar a coloração rosa do PAS (Colação especifica do polissacarídeo), principalmente no interior das
partículas e a coloração azul do comassie blue (coloração específica da proteína) na borda das micropartículas. Na partícula revestida pela gelatina pode-se observar uma borda mais densa e rugosa e também mais definida que a observada quando os hidrolisados foram adsorvidos. Adicionalmente pode-se observar que a vesículas de óleo produzido na emulsão que resultou nas partículas de gelificação iônica não foram coloridas, como esperado uma vez que os corantes utilizados eram específicos para carboidratos e para proteínas.
4.3.5 Microscopia confocal de varredura a laser (MCVL)
A adsorção de proteína e dos hidrolisados sobre as micropartículas de gelificação iônica foram também confirmadas por meio da microscopia confocal (Figura 24). Inicialmente, a gelatina, Collagel e o Fortigel foram associados ao corante FIT C e posteriormente adsorvidos sobre as partículas de gelificação iônica. A Figura 24 apresenta as micrografias confocais obtidas na altura média das partículas. Coloração verde típica do FIT C pode ser observada no perímetro das partículas e também por toda a superfície da partícula na meia altura avaliada, indicando que a proteína pode ter-se difundido para o interior da partícula com maior intensidade observada quando gelatina e Collagel foram utilizados e menor intensidade da cor verde para o Fortigel. Estes resultados parecem refletir a maior adsorção proteica obtida no caso da gelatina e do Collagel e menor adsorção para o Fortigel, conforme discutido na avaliação da adsorção proteica sobre as partículas de gelificação iônica e também devido aos pesos moleculares de cada proteína.
1. 2.
3.
Figura 24. Microscopia confocal de partículas produzidas por gelificação iônica recobertas com diferentes proteínas coradas com FIT C. Sendo 1. Gelatina (10%), 2. Hidrolisado Collagel (10%), 3. Hidrolisado Fortigel (10%).
4.4 Avaliação da solubilidade proteína das micropartículas em simulação das condições