Bioensaio

O bioensaio em camundongos para o isolamento de T. gondii foi considerado um método mais sensível quando comparado com a cultura celular, porém o sucesso do isolamento depende da dose inoculada, via de administração e virulência das cepas dos parasitos (Derouin et al., 1987).

Para o isolamento de T. gondii, podem ser utilizados camundongos heterozigotos imunocompetentes, os quais são naturalmente susceptíveis à infecção pelo parasito; a via de inoculação comumente utilizada é a via intraperitoneal, que tem se mostrado mais efetiva do que outras vias, como via oral ou intracerebral (Derouin et al., 1987). Os camundongos são inoculados com taquizoítos ou bradizoítos, e dependendo da cepa inoculada, se virulenta ou avirulenta, o animal pode desenvolver infecção aguda, com formação de ascite, presença de taquizoítos no líquido peritoneal, formação de cistos teciduais e encefalite, o que causa a sintomatologia neurológica observada em alguns animais (Jones et al., 1958)

Diferente do bioensaio para T. gondii, camundongos imunocompetentes não devem ser utilizados para o isolamento de N. caninum, pois estes não são susceptíveis a infecção pelo parasito (Dubey et al., 1988b; Cuddo

n et al., 1992). Diferentes linhagens de camundongos imunodeficientes têm sido empregados no bioensaio para N. caninum, a exemplo de camundongos suprimidos com corticosteróides, camundongos atímicos (“nude”), camundongos com imunodeficiência combinada (“SCID”) e camundongos nocauteados para interferon gama (IFN-γ) (Yamane et al., 1998; Gondim et al., 1999a; Basso et al., 2001).

Além de camundongos imunodeficientes, gerbis (Meriones unguiculatus) mostraram-se naturalmente susceptíveis à infecção por N. caninum e foram utilizados com sucesso para o isolamento do parasito a partir de tecidos de animais infectados (Cuddon et al., 1992; Gondim et al., 1999a). Gerbis também foram empregados para o isolamento de N. caninum por meio de inoculação oral, sendo altamente susceptíveis à infecção oral com oocistos do parasito (Dubey & Lindsay, 2000).

Além do uso de camundongos para o bioensaio desses parasitos, outros animais podem ser empregados para essa finalidade; gatos podem ser utilizados para o isolamento de T. gondii e H. hammondi (Dubey et al., 2003d; Dubey & Sreekumar, 2003) e cães para o isolamento de H. heydorni e N. caninum (Slapeta et al., 2002a; Rodrigues et al., 2004).

O bioensaio para o isolamento de T. gondii em gatos tem apresentado uma maior sensibilidade quando comparado em camundongos, pois gatos são altamente susceptíveis a infecção com bradizoítos e podem ser testados com maiores quantidades de tecidos que camundongos (Dubey, 2001).

Diversos isolamentos de T. gondii têm sido obtidos de galinhas infectadas utilizando-se gatos para a realização dos bioensaios (Dubey, 2009; Dubey et al., 2003d; Sreekumar et al., 2003a; Dubey et al., 2004b; Dubey et al., 2005a; Dubey et al., 2005b).

3. ARTIGO CIENTÍFICO

Frequência molecular, sorológica e isolamento de coccídios Toxoplasmatíneos em galinhas (Gallus domesticus)

Isolation, serological and molecular frequency of Toxoplasmatinae coccidia in chickens(Gallus domesticus)

GONÇALVES¹, Ilka do Nascimento; UZÊDA¹ Rosângela Soares; LACERDA¹ Geisilane de Almeida; MOREIRA¹, Rose Rodrigues Nunes; ARAÚJO², Flábio Ribeiro de; OLIVEIRA², Renato Henrique Marçal de; CORBELLINI³, Luís Gustavo; GONDIM^1*, Luís Fernando Pita.

1

Universidade Federal da Bahia, Escola de Medicina Veterinária, Departamento de Patologia e Clínicas, Avenida Ademar de Barros, 500, Ondina, Salvador, Bahia, Brasil 40170-110.

2

Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária, Embrapa Gado de Corte. Campo Grande, Mato Grosso do Sul, Brasil.

3

Universidade Federal do Rio Grande do Sul, Faculdade de Veterinária, Departamento de Medicina Veterinária Preventiva, Porto Alegre, Rio Grande do Sul, Brasil.

*

Autor para correspondência - E-mail: pita@ufba.b

Resumo

Toxoplasma gondii, Neospora caninum e Hammondia sp. são protozoários coccídios pertencentes a subfamília Toxoplasmatínae. Formas resistentes (oocistos) desses coccídios são, eventualmente, encontradas no ambiente e podem induzir infecção em algumas espécies animais que têm o hábito de se alimentar diretamente no solo. Os objetivos deste trabalho foram: 1) determinar a freqüência molecular desses coccídios em tecidos de galinhas caipiras (criadas em contato direto com o solo) empregando-se uma PCR-nested para o rDNA de parasitos Toxoplasmatíneos; 2) determinar a frequência de anticorpos anti-N.caninum e anti-T.gondii nos animais testados; 3) isolar N. caninum e T. gondii de tecidos de animais soropositivos. A partir de tecidos (cérebro

e coração) de 100 galinhas de criações familiares obtidas em regiões próximas a cidade de Salvador, Bahia, observou-se uma frequência molecular de T. gondii maior quando comparada com a de N. caninum. Não foi detectado DNA de Hammondia sp. nos tecidos das aves investigadas. Anticorpos anti-T.gondii e anti-N. caninum foram observados em 25% (IC 95%: 16,5% - 33,5%) e 17% (IC 95%: 9,6% - 24,4%) das aves, respectivamente. Cinco isolados foram obtidos de 14 das 25 galinhas soropositivas para T. gondiii, sendo que quatro destes foram virulentos para camundongos Suíços. Nenhum isolado de N. caninum foi obtido de tecidos de oito galinhas soropositivas para este parasito. Galinhas foram mais expostas a T. gondii do que a N. caninum na região estudada. O insucesso no isolamento de N. caninum por meio de bioensaio em camundongos imunodeficientes é sugestivo de que galinhas não são hospedeiros eficientes deste parasito.

Palavras-chave – Galinha, Hammondia sp, Neospora caninum, PCR nested, Toxoplasma gondii

Introdução

Toxoplasma gondii, Neospora caninum e Hammondia sp. são protozoários coccídios formadores de cistos. T. gondii pode infectar uma grande variedade de mamíferos, incluindo o homem, além de diversas espécies de aves (Dubey, 2002), sendo que a maioria das aves é resistente ao parasito sem desenvolver sintomatologia da doença. Galinhas são aves cosmopolitas e são consideradas importantes hospedeiros intermediários para T. gondii., podendo também servir como indicadores de contaminação ambiental (Dubey, 2009; Dubey et al., 2002). N. caninum tem grande importância econômica mundial por ser um agente causador de aborto e perdas reprodutivas em bovinos (Dubey, 2003). Cães, coiotes (Canis latrans) e dingos (Canis lupus dingo) e do e são os hospedeiros definitivos do protozoário (McAllister et al., 1998; Gondim et al., 2004). Este protozoário pode infectar várias espécies de mamíferos, e recentemente, galinhas e pardais foram confirmados como hospedeiros intermediários naturais do parasito (Dubey, 2003; Gondim, 2006; Costa et al., 2008; Gondim et al., 2010).

Hammondia heydorni e H. hammondi, apesar de não serem associados com a indução de doença em animais, são próximos filogeneticamente de T. gondii e N. caninum, e podem causar problemas no diagnóstico diferencial em infecções causadas pelos referidos protozoários (Ellis et al., 1999b; Sreekumar et al., 2005). H. heydorni tem cães e raposas como hospedeiros definitivos (Slapeta et al., 2002a; Schares et al., 2003; Schares et al., 2005), ao passo que H. hammondi possui gatos como hospedeiros definitivos (Heydorn & Mehlhorn, 2002; Sreekumar et al., 2005). Diferentes espécies animais têm sido relatadas como hospedeiros intermediários de Hammondia sp. (Mohammed et al., 2003; Silva et al., 2009; Soares et al., 2009), porém não há relato de aves como hospedeiro desses parasitos.

Devido à similaridade morfológica e taxonômica entre os prozoários Toxoplasmatíneos, o diagnóstico molecular tem sido utilizado como uma ferramenta para a diferenciação entre eles (Schares et al., 2005). Pela necessidade de uma técnica molecular que apresente alta sensibilidade, a PCR nested tem sido utilizada para a detecção de DNA de coccídios Toxoplasmatíneos, mesmo quando estão presentes em pequenas quantidades em tecidos (Silva et al., 2009; Santos et al., 2009; Gondim et al., 2010). Os objetivos deste trabalho foram: investigar a frequência molecular de protozoários Toxoplasmatíneos (T. gondii, N. caninum e Hammondia sp.) em tecidos de galinhas caipiras, determinar a frequência de anticorpos anti-N.caninum e anti-T.gondii nos animais testados, e isolar taquizoítos de T. gondii e N. caninum a partir dos tecidos desses animais.

Materiais e métodos Animais

Galinhas caipiras - Foram adquiridas 100 galinhas caipiras de propriedades situadas num raio de 300km da cidade de Salvador, obtidas por conveniência de cinco diferentes municípios, sendo 48 galinhas de Serrinha, 11 de São Gonçalo, 13 de Irará, 08 da Ilha de Itaparica e 20 de Conceição de Feira. Em todas as propriedades onde foram adquiridas as galinhas, havia bovinos e pelo menos um cão. As aves foram

transportadas das propriedades e mantidas em gaiolas metálicas galvanizadas de 75cm x 60cm x 40cm, com água e ração comercial, no Hospital Veterinário da Universidade Federal da Bahia. Foi realizada a coleta de sangue para os testes sorológicos e posteriormente a eutanásia dos animais, seguida de necropsia e colheita de tecidos para os testes moleculares.

Camundongos– Foram adquiridos 14 camundongos Suíços e oito camundongos nocauteados em interferon-gama (IFN-γ) para as tentativas de isolamento de T. gondii e N. caninum respectivamente. Os camundongos Suíços foram obtidos no Laboratório Central (LACEN-Salvador) e os camundongos nocauteados interferon-gama na Fundação Oswaldo Cruz (Salvador).

Todos os procedimentos envolvendo animais foram realizados de acordo com os princípios éticos de utilização de animais e com aprovação do Comitê de Experimentação e Uso de Animais da Escola de Medicina Veterinária da Universidade Federal da Bahia (protocolo: 001/2009).

Reação de Imunofluorêscencia Indireta (IFI)

Taquizoítos de T. gondii (cepa RH) e N. caninum (NC-Bahia e NC-1) mantidos em cultivo de células VERO, no Hospital Veterinário da Universidade Federal da Bahia, foram utilizados como antígenos nas reações de IFI.

Para ambos os testes, utilizou-se um conjugado comercial fluoresceinado anti-IgG de galinha (Zymed, Invitrogen, Camarillo, CA, EUA) ou anti-IgG de camundongo (Sigma, St. Louis, MO, E.U.A.) como anticorpo secundário, dependendo da espécie animal testada. Nas reações para T. gondii foi empregado um ponto de corte de 1:16 em galinhas e de 1:50 em camundongos, e para N. caninum, utilizou-se um ponto de corte de 1:50 para as duas espécies animais testadas (Costa et al., 2008). Foram consideradas como reações positivas aquelas que apresentaram reação periférica total em mais de 50% dos taquizoítos. As amostras positivas foram testadas em diluições dobradas para a

determinação dos títulos de anticorpos. Soros controles positivo e negativo foram utilizados em cada lâmina.

PCR nested

Foram utilizados cérebro e coração de cada animal, sendo que metade de cada órgão foi processada individualmente para extração de DNA. As amostras foram maceradas com adição de nitrogênio líquido e posteriormente realizada a extração de DNA por meio de um kit de extração comercial (Easy-DNA ^TM, Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), de acordo com as instruções do fabricante. Após a extração os DNAs foram armazenados a -20ºC, até a realização da reação de PCR.

A reação de PCR nested foi realizada com dois pares de primers que amplificam a porção ITS-1 (espaço interno transcrito 1) do DNA ribossômico comum dos parasitos Toxoplasmatíneos. A primeira reação foi realizada com o par de primer JS4 (5’-CGA AAT GGG AAG TTT TGT GAA C-3’) (Slapeta et al., 2002b) e CT2b (5’-TTG CGC GAG CCA AGA CAT C-3’) (Monteiro et al., 2007). A segunda reação foi realizada com o par de primer CT1 (5’-TGA ATC CCA AGC AAA ACA-3’) e CT2 (5’-G CGC GAG CCA AGA CAT CCA T-3’) (Sreekumar et al., 2003).

Ambas as reações foram realizadas com um volume total de 25μl sendo 12,5μl de Mix para PCR comercial (50 U/ml TaqDNA polimerase na solução tampão, pH 8.5, 400 M de cada dNTP e 3 mM de MgCl (Master Mix, Promega, Madison, WI), 10,5μl de água ultra-pura, 0,5μl dos respectivos primers e 1,0 de DNA teste. As reações foram realizadas no aparelho GeneAmp PCR System 9700 (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). As condições da PCR para JS4/CT2b foram 40 ciclos a 94°C por 1 min, 60°C por 1 min e 72°C for 1 min, e para CT1/CT2 foram 40 ciclos a 94°C por 1 min, 55°C por 1 min e 72°C por 1 min. As reações foram precedidas por uma etapa de desnaturação inicial a 94°C por 5 min e seguido por uma extensão final a 72°C por 7 min. O tamanho esperado do fragmento amplificado foi cerca de 500 pb na primeira reação e 400 pb na segunda reação. O controle positivo foi obtido de oocisto de H. heydorni de cão naturalmente infectado (Monteiro et al., 2007), como controle negativo,

foi utilizada água ultra-pura. Para a visualização do produto da PCR utilizou-se eletroforese com gel de agarose a 2% e escada de DNA de 100pb (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), ambos corados com “Blue Green Loaging Dye I” (LGC, Biotecnologia, Cotia, SP, Brasil ). As amostras de DNA que geraram reações positivas foram submetidas a uma nova PCR, nas mesmas condições já descritas, porém visualizadas em gel de agarose a 1% para posterior extração e purificação das bandas positivas do gel empregando-se um kit comercial (Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System - Promega, Madison, WI, USA) conforme as instruções do fabricante.

PCR espécie-específica para T. gondii e N. caninum

Para a confirmação da identidade dos taquizoítos observados nas tentativas de isolamento em cultivo celular, foram empregadas duas PCR convencionais para T. gondii e N. caninum utilizando-se os pares de primers TgB1.1/TgB1.4 (Burg et al., 1989) e Np21/Np6 (Yamage et al., 1996), respectivamente de acordo com os protocolos descritos pelos referidos autores.

Sequenciamento e análise dos amplicons

Para o sequenciamento, usaram-se os primers CT1 e CT2 em amostras selecionadas de cérebro e de coração. A termociclagem de sequenciamento e a posterior purificação foram feitas de acordo com recomendações do fabricante, usando-se o kit BigDye Terminator 3.1 (Applied Biosystems, Foster City, CA, EUA), usando 3,2 pmol do primer, 8,0 µL do BigDye e água Milli-Q qsp 20 µL. A termociclagem foi feita nas seguintes condições: 96 ºC por 1 minuto, seguido por 25 ciclos de 96 °C por 10 segundos, 50 °C por 5 segundos e 60 °C por 4 minutos, todos esses passos com rampa lenta (1 ºC/s). A purificação foi feita pelo método do etanol/EDTA. O basecalling foi feito pelo software Sequence Analysis (Applied Biosystems, Foster City, CA, EUA), e a qualidade das sequências foi analisada usando-se o software Sequence Scanner (Applied Biosystems, Foster City, CA, EUA). Os resultados do sequenciamento foram editados por meio dos programas Preg 4, versão 1.5 e Gap, versão 4,10. Utilizou-se o BLASTn

(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/Blast.cgi) para a identificação das sequências encontradas e comparação com aquelas depositadas em bancos de dados públicos.

Bioensaio e isolamento in vitro

Amostras de cérebro e coração (¼ de cada órgão) das galinhas que apresentaram anticorpos contra T. gondii ou N. caninum, foram coletadas e mantidas em PBS com antibiótico e antimicótico (Penicilina G sódica, estreptomicina e anfotericina B – Invitrogen, Auckland, N.Z) a 2%, por um período de 1-48 horas, sendo maceradas e tratadas com tripsina, como descrito previamente (Gondim et al., 2001). Os tecidos processados das galinhas soropositivas para N. caninum e das galinhas soropositivas para T. gondii foram inoculados em camundongos nocauteados em IFN-γ e em camundongos Suíços, respectivamente. Cada camundongo foi inoculado com uma mistura de cérebro e coração de cada galinha soropositiva. Os animais que apresentaram qualquer sintomatologia de doença foram eutanasiados em câmara contendo anestésico inalatório enflurano (1ml/ml) (Farmasa, São Paulo, SP, Brasil). Aqueles que não apresentaram sinais de doença foram mantidos até 50 dias após a inoculação, quando foram eutanasiados, conforme descrito acima. Amostras de sangue dos camundongos foram colhidas no momento da eutanásia para a detecção de anticorpos anti-T. gondii e anti-N. caninum. Somente os camundongos positivos na IFI tiveram seus cérebros processados para a inoculação em frascos de cultura celular contendo monocamadas de células Vero, segundo Gondim el. al., (2001).

A identidade dos taquizoítos isolados em cultura celular foi confirmada por meio de PCR espécie-específica para N. caninum ou T. gondii.

Análise estatística

O teste χ2 de McNemar foi utilizado para verificar a igualdade entre as proporções de respostas positivas nos diferentes testes aplicados na detecção dos protozoários coccídio

Resultados

PCR nested e seqüenciamento

Foram observadas reações positivas na PCR nested em 42 das 100 aves testadas (42%, IC 95%: 32,3% - 51,7%), representadas por bandas com cerca de 400pb, equivalentes a DNA de parasitos Toxoplasmatíneos. Das 42 aves positivas na PCR, a identidade do parasito foi confirmada por sequenciamento em tecidos de 34 aves. DNA de T. gondii foi identificado em 28 galinhas; DNA de N. caninum foi detectado em seis aves. Não foram observadas infecções mistas na PCR nas aves testadas. Entre os tecidos examinados, 30 amostras de cérebros e 25 de corações foram positivas na PCR; 13% das amostras foram positivas simultaneamente em cérebro e coração, evidenciando uma concordância significativa entre a proporção de positivos em ambos os tecidos (p < 0,001). Detectou-se DNA de T. gondii em 13 cérebros, sete corações, e em oito galinhas, observou-se simultaneamente em ambos os orgãos. DNA de N. caninum foi detectado em três cérebros e três corações (Tabela 1). Não foi observado DNA de Hammondia sp. nas amostras testadas.

Tabela 1 - Resultado da PCR nested para a detecção a de DNA de coccídios Toxoplasmatíneos em galinhas e seqüenciamento dos amplicons para a identificação das espécies de protozoários.

Cérebro Coração Cérebro e coração Total PCR nested para

Toxoplasmatíneos ^{17 12 13 42}

Toxoplasma gondii 13 7 8 28

Imunofluorescência Indireta

De 100 galinhas testadas, 25% apresentaram anticorpos anti-T. gondii (IC 95%: 16,5% - 33,5%) e 17% (IC 95%: 9,6% - 24,4%) foram soropositivas para N. caninum. Um total de 9% das amostras apresentou anticorpos para ambos os protozoários testados, sendo que a proporção de positivos para ambos os protozoários foi significativa (p < 0,001). Os títulos de anticorpos variaram de 16 a 4096 para T. gondii, e de 50 a 400 para N. caninum.

Das 42 amostras positivas na PCR nested, 22 amostras também foram positivas na IFI para pelo menos um protozoário testado (p < 0,01) (Tabela 2).

Tabela 2 – Detecção de DNA de Toxoplasmatíneos por meio de uma PCR nested, identificação dos parasitos após seqüenciamento das bandas amplificadas na PCR, e freqüência de anticorpos IgG anti-Toxoplasma gondii e anti-Neospora caninum, em galinhas de quintal oriundas de cinco municípios baianos.

IFI DNA Municípios Número de galinhas T. gondii N. caninum T.gondii e N.caninum Toxoplas-matíneos T. gondii N. caninum Conceição de Feira 20 0 1 0 2 1 0 Ilha de Itaparica 8 0 4 2 1 1 0 Irará 13 2 0 2 10 7 2 São Gonçalo 11 1 1 4 8 7 0 Serrinha 48 13 2 1 21 12 4 Total 100 16 8 9 42* 28 6

IFI = teste de imunofluorescência indireta

Bioensaio e isolamento in vitro

De um total de 25 galinhas soropositivas para T. gondii, foram processados e utilizados tecidos de 14 aves no bioensaio em camundongos, sendo que oito camundongos soroconverteram para T. gondii após a inoculação de tecidos das galinhas. Cinco isolados de T. gondii foram obtidos após a inoculação dos tecidos de camundongos soropositivos em cultura celular. As identidades dos taquizoítos multiplicados in vitro foram confirmadas na PCR específica para T. gondii. Os isolados de T. gondii foram oriundos de galinhas com títulos de anticorpos para o parasito entre 64 e 4096. A média dos títulos transformada em logaritmo dos cinco casos em que houve isolamento foi de 10,2 (variando de 6 a 12) enquanto que a dos nove casos negativos foi de 6,7 (variando de 4 a 11). Quatro dos cinco isolados foram virulentos para camundongos, sendo que dois isolados causaram óbitos nos animais inoculados. Três dos cinco isolados foram de galinhas positivas simultaneamente para T. gondii e N. caninum. O status sorológico das galinhas que deram origem aos cinco isolados, assim como a virulência destes isolados nos camundongos, estão descritos na Tabela 3.

Não houve sucesso nas tentativas de isolamento de N. caninum a partir de tecidos de oito galinhas soropositivas para o parasito inoculados em camundongos imunodeficientes, nem tão pouco houve soroconversão para N. caninum em qualquer dos camundongos inoculados. As galinhas soropositivas para N. caninum e T. gondii simultaneamente (nove aves) não foram utilizadas nos bioensaios para o isolamento de N. caninum.

Tabela 3 - Características dos isolados de Toxoplasma gondii, frente ao status sorológico das galinhas e virulência nos camundongos

IFI *– título de anticorpos Bioensaio em camundongo Galinha/ Identidade Toxoplasma gondii Neospora. caninum

Sinais clínicos Dias para

eutanásia 21 64 Negativo Ausentes 50 31 4096 100 Pêlos eriçados (+++) 41 37 4096 50 Pêlos eriçados (+) 116 45 2048 200 Óbito NA 76 1024 Negativo Óbito NA * Imunofluorescência Indireta

+ Pouco evidente; +++ muito evidente NA = não se aplica

Discussão

No presente estudo, após a realização da PCR nested, detectou-se DNA de parasitos Toxoplasmatíneos em 42% das aves estudadas. Após o seqüenciamento dos fragmentos de DNA amplificados, obteve-se um número maior de galinhas infectadas com T. gondii do que por N. caninum. Tal resultado pode ser justificado pelo número de oocistos de T. gondii comumente excretados pelos hospedeiros definitivos, que equivale a mais de 20 milhões de oocistos eliminados por um único gato (Dubey, 1995), frente ao número de oocistos de N. caninum produzidos pelos cães, que geralmente é inferior a um milhão por cada cão (Gondim et al., 2002, Lindsay et al., 1999, McAllister et al., 1998). Outra possibilidade relacionada à maior freqüência molecular de T. gondii comparada com de N. caninum nas galinhas estudadas, pode ser a uma menor susceptibilidade de galinhas a N. caninum, o que é meramente especulativo e deve ser confirmado em estudos futuros.

Não foi observado DNA de Hammondia sp. nas aves testadas. Até o momento, aves não foram identificadas como hospedeiros intermediários de H. heydorni ou H. hammondi. Galinhas provavelmente são expostas a oocistos de Hammondia sp. excretados pelos

hospedeiros definitivos e tais oocistos devem estar presentes no solo, como ocorre com T. gondii e N. caninum (Schares et al., 2005). Em um estudo recente, também realizado no estado da Bahia (Silva et al., 2009), foram detectados cerca de 4% de caprinos infectados com H. heydorni, o que confirma a existência deste parasito na região estudada. É possível que galinhas não sejam susceptíveis a infecção por Hammondia sp. ou que não sejam hospedeiros intermediários eficientes desses parasitos, ou ainda, a prevalência nesta espécie é muito baixa, não sendo possível detectar o parasito com e amostragem utilizada neste estudo. Contudo, torna-se necessário a realização de estudos com um maior número amostral ou de experimentos envolvendo infecção experimental, para a confirmação desses questionamentos.

A utilização de PCR nested tem sido preferida em diferentes estudos com amostras de campo, devido a sua maior sensibilidade quando comparada a métodos de PCR convencionais, pois na PCR nested são realizadas duas reações de amplificações com dois diferentes pares de primers (Ellis et al., 1999a; Medina et al., 2006; Barratt et al., 2008). No estudo corrente foram empregados os primers JS4 (Slapeta et al., 2002b) e CT2b (Monteiro et al., 2007), e CT1 e CT2 (Sreekumar et al., 2003). A combinação desses primers (JS4/CT2b e CT1/CT2) em uma PCR nested foi utilizada com sucesso