Mestrado em Ciência Animal nos Trópicos
Salvador – Bahia 2010
INVESTIGAÇÃO SOROLÓGICA, MOLECULAR E ISOLAMENTO DE COCCÍDIOS TOXOPLASMATÍNEOS EM
GALINHAS (Gallus domesticus)
ILKA DO NASCIMENTO GONÇALVES
ILKA DO NASCIMENTO GONÇALVES
INVESTIGAÇÃO SOROLÓGICA, MOLECULAR E ISOLAMENTO DE COCCÍDIOS TOXOPLASMATÍNEOS EM GALINHAS (Gallus domesticus)
Dissertação apresentada à Escola de Medicina Veterinária da Universidade Federal da Bahia, como requisito para a obtenção do título de Mestre em Ciência Animal nos Trópicos, na área de Saúde Animal.
Orientador: Prof. Dr. Luís Fernando Pita Gondim
Salvador – Bahia 2010
FICHA CATALOGRÁFICA
Gonçalves, Ilka do Nascimento.
Investigação sorológica, molecular e isolamento de coccídios Toxoplasmatíneos em galinhas (Gallus domesticus) / Ilka do Nascimento Gonçalves. - 2010.
85 f. : il.
Orientador: Prof. Dr. Luis Fernando Pita Gondim.
Dissertação (mestrado) - Universidade Federal da Bahia, Escola de Medicina Veterinária, Salvador, 2010.
1. Toxoplasma gondii. 2. Neospora caninum. 3. Reação em cadeia de polimerase. 4.
Galinha. I. Gondim, Luis Fernando Pita. II. Universidade Federal da Bahia. Escola de Medicina Veterinária. III. Título.
CDD - 616.016 CDU - 593.1
INVESTIGAÇÃO SOROLÓGICA, MOLECULAR E ISOLAMENTO DE COCCÍDIOS TOXOPLASMATÍNEOS EM GALINHAS (Gallus domesticus)
ILKA DO NASCIMENTO GONÇALVES
Dissertação defendida e aprovada para obtenção do grau de Mestre em Ciência Animal nos Trópicos.
Salvador, 31 de março de 2010.
Comissão Examinadora:
____________________________________
Prof. Dr. Luís Fernando Pita Gondim - UFBA Orientador
___________________________________
Prof. Dr. Ricardo Wagner Dias Portela - UFBA
____________________________________
Prof. Dra. Caroline Argenta Pescador Universidade Federal do Mato Grosso
Aos meus pais, Clélia e Toninho pelo incentivo.
AGRADECIMENTOS
Ao meu orientador, Prof. Dr. Luís Fernando Pita Gondim, pelo incentivo, ensinamentos e confiança;
As minhas colegas e amigas, Rosa, Mari, Léa, Sara, Lari, Katy e Cynthia, presentes nos momentos de trabalho e diversão;
A minha amiga-irmã, Cris; nenhuma palavra poderia fielmente representar o quanto a nossa amizade é importante para mim;
Aos meus animais Raul e Lua, pelos ensinamentos diários de respeito a todos os seres vivos;
Aos bolsistas Pibic Rose, Geisa e Müller que colaboraram com a realização deste trabalho;
Ao grupo do Lasab, pela realização das coletas, especialmente Prof. Lia, Tati e Éllen;
Ao Dr. Flabio, pela colaboração na realização dos sequenciamentos;
Ao Prof. Ricardo Portela, do ICS-UFBA, que gentilmente disponibilizou seus laboratórios para a realização de análises;
Aos professores, técnicos e estudantes do Laboratório de Diagnóstico das Parasitoses, pela atenção e convivência harmoniosa;
Ao Colegiado de Pós-Graduação da Escola de Medicina Veterinária da Universidade Federal da Bahia;
Ao CNPq pela concessão da bolsa de mestrado e a FABESB pelo suporte financeiro para a execução do projeto.
"Há muitas razões para duvidar e uma só para crer."
(Carlos Drummond de Andrade)
ÍNDICE
Página LISTA DE TABELAS ... VIII LISTA DE ABREVIATURAS ... IX RESUMO ... X ABSTRACT ... XI 1. INTRODUÇÃO ... 01 2. REVISÃO DE LITERATURA ... 03 2.1 HISTÓRICO ...
2.1.1 Toxoplasma gondii ...
2.1.2 Neospora caninum ...
2.1.3 Hammondia sp. ...
2.2 CICLO DE VIDA E TRANSMISSÃO ...
2.2.1 Toxoplasma gondii ...
2.2.2 Neospora caninum ...
2.2.3 Hammondia heydorni e H. hammondi ...
2.3 IMPORTÂNCIA ECONÔMICA ...
2.3.1 Toxoplasmose...
2.3.2 Neosporose ...
2.4 IMPORTÂNCIA DAS AVES NA TRANSMISSÃO DE PROTOZOÁRIOS TOXOPLASMATÍNEOS ...
2.4.1 Toxoplasma gondii ...
2.4.2 Neospora caninum ...
2.4.3 Hammondia sp. ...
2.5 DIAGNÓSTICO DE INFECÇÃO POR PARASITOS TOXOPLASMATÍNEOS EM AVES ...
2.5.1 Testes sorológicos ...
2.5.2 Diagnóstico molecular ...
2.5.3 Bioensaio ...
03 03 05 08 09 09 12 14 16 16 17 18 18 22 23 24 24 26 28 3. ARTIGO CIENTÍFICO - Freqüência molecular, sorológica e isolamento de
coccídios Toxoplasmatíneos em galinhas (Gallus domesticus) ... 30 4. CONSIDERAÇÕES GERAIS... 48 5. REFERÊNCIAS ...
6. ANEXO ...
49 71
LISTA DE TABELAS
Página Tabela 1 - Freqüências de anticorpos anti-Toxoplasma gondii em galinhas
criadas em diferentes Estados do Brasil ...
21
LISTA DE ABREVIATURAS
bp - Pares de bases
ELISA – Ensaio de imunoadsorção enzimática ETS - Espaçador externo transcrito
IFI – Imunofluorescência indireta
ITS1 - Espaçador não codificante interno 1 PCR - Reação em cadeia da polimerase DNA - Ácido desoxirribonucleico RNA - Ácido ribonucleico rDNA - DNA Ribossômico SNC – Sistema nervoso central TAE - Tris-Acetato-EDTA
VERO - Células renais do macaco verde africano AIDS – Síndrome da imunodeficiência adquirida MAT – Aglutinação modificada
HAI – Hemaglutinação indireta
SCID – Camundongo com imunodeficiência severa IFN-γ - Interferon gama
GONÇALVES, I. N. Investigação sorológica, molecular e isolamento de coccídios Toxoplasmatíneos em galinhas (Gallus domesticus). Dissertação (Pós-graduação em ciência animal nos trópicos); Escola de Medicina Veterinária, Universidade Federal da Bahia, 2010.
RESUMO
Toxoplasma gondii, Neospora caninum e Hammondia sp. são protozoários coccídios pertencentes à subfamília Toxoplasmatínae. T. gondii e N. caninum são importantes agentes causadores de doenças nos animais, enquanto que protozoários do gênero Hammondia não têm sido associados à doença. Oocistos desses parasitos podem estar presentes no ambiente e infectar diversas espécies de animais, incluindo galinhas, que têm o hábito de se alimentar diretamente no solo. Os objetivos desse trabalho foram:
determinar a frequência molecular desses coccídios em tecidos de galinhas caipiras;
investigar a frequência de anticorpos anti-N.caninum e anti-T.gondii nos animais testados; isolar N. caninum e T. gondii de tecidos de animais soropositivos. A partir de tecidos (cérebro e coração) de 100 galinhas de criações familiares obtidas em regiões próximas a cidade de Salvador, Bahia, observou-se uma frequência molecular de T.
gondii superior a de N. caninum. Não foi detectado DNA de Hammondia sp. nos tecidos das aves investigadas. Anticorpos anti-T.gondii e anti-N. caninum foram observados em 25% e 17% das aves, respectivamente. Cinco isolados foram obtidos de 14 das 25 galinhas soropositivas para T. gondii, sendo que quatro dos cinco isolados foram virulentos para camundongos Suíços. Nenhum isolado de N. caninum foi obtido de tecidos de oito galinhas soropositivas para este parasito. Galinhas foram mais expostas a T. gondii do que a N. caninum na região estudada. O insucesso no isolamento de N.
caninum por meio de bioensaio em camundongos imunodeficientes é sugestivo de que galinhas não são hospedeiros eficientes deste parasito.
PALAVRAS-CHAVE: Galinha, Gallus domesticus, Neospora caninum, PCR nested, Toxoplasma gondii, Toxoplasmatinae
GONÇALVES, I. N. Isolation, serological and molecular investigation of Toxoplasmatinae coccidia in chickens (Gallus domesticus). Dissertation (Master's degree) – Escola de Medicina Veterinária, Universidade Federal da Bahia, 2010.
ABSTRACT
Toxoplasma gondii, Neospora caninum and Hammondia sp. are coccidian protozoa that belong to Toxoplamatinae subfamily. T. gondii and N. caninum are important agents associated with diseases in animals, whereas Hammondia species are not known to cause disease in animals. Oocysts of these parasites may be found in the environment and are able to cause disease in a variety of animal species which commonly feed on the ground, including chickens. The aims of this study were to determine the molecular frequency of Toxoplasmatinae protozoa in tissues of free ranging chickens; to investigate the frequency of antibodies to N. caninum and T. gondii in the tested animals, and to isolate N. caninum and T. gondii in tissues of seropositive animals.
Tissues (brain and heart) of 100 chickens obtained from small farms close to Salvador city were examined and showed a higher molecular frequency of T. gondii when compared to N. caninum. DNA of Hammondia sp. was not detected in the tissues of the tested chickens. Antibodies to T. gondii and to N. caninum were observed in 25% and 17% of the examined animals, respectively. Five T. gondii isolates were obtained from 14 of 25 T. gondii-seropositive chickens and four of these were virulent for Swiss mice.
N. caninum was not isolated from tissues of eight seropositive chickens. The lack of isolation of N. caninum using imunodeficient mice is suggestive that chickens are not efficient intermediate host of this parasite. It was concluded that chickens were more exposed to T. gondii than to N. caninum in the studied region.
KEY WORDS: Chicken, Gallus domesticus, Neospora caninum, nested PCR, Toxoplasma gondii, Toxoplasmatinae
1. INTRODUÇÃO
Toxoplasma gondii, Neospora caninum e Hammondia sp. são protozoários intracelulares obrigatórios, pertencentes ao filo Apicomplexa, classe Sporozoa, subclasse Coccidia, família Sarcocystidae, sub-família Toxoplasmatinae (Dubey et al., 2002a).
Os coccídios Toxoplasmatíneos desenvolvem-se assexuadamente nos tecidos dos hospedeiros intermediários por multiplicação rápida (taquizoítos) e multiplicação lenta (bradizoítos); os bradizoítos estão presentes no interior de cistos teciduais. A fase sexuada ocorre no epitélio intestinal dos hospedeiros definitivos, que são os únicos com potencial de eliminar oocistos no ambiente (McAllister et al. 1998; Dubey et al., 1998).
Toxoplasma gondii é um coccídio que infecta a maioria dos animais homeotérmicos (Dubey, 1977). A toxoplasmose é uma importante zoonose que pode causar abortos, má formação fetal e doença ocular em seres humanos (Tenter et al., 2000). Em animais de produção, a doença é caracterizada por distúrbios reprodutivos e gera perdas econômicas, principalmente em ovinos, caprinos e suínos, que são consideradas as espécies mais susceptíveis (Garcia et al., 1999; Silva et al., 2003; Pescador et al., 2007b;
Millar et al., 2008). Diversas espécies de aves são infectadas pelo parasito, entretanto, na maioria delas, a infecção cursa de forma assintomática (Dubey, 2002d).
Neospora caninum é um protozoário de importância mundial, por ser uma causa frequente de aborto, perdas neonatais em bovinos (Aguirre et al., 2007; Anderson et al., 1991) e distúrbios neurológicos em animais de companhia (Gondim et al., 2001).
Pequenos ruminantes, como caprinos e ovinos são infectados pelo parasito, porém não é comum o desenvolvimento da doença clínica (Barr et al., 1992; Hassig et al., 2003).
Não se sabe ao certo a importância das aves no ciclo do parasito, entretanto pardais e galinhas foram identificados recentemente como hospedeiros intermediários naturais de N. caninum (Costa et al., 2008; Gondim et al., 2010).
Hammondia heydorni e H. hammondi aparentemente não são patogênicas para seus hospedeiros sendo que canídeos e felinos são hospedeiros definitivos destes protozoários, respectivamente (Blagburn et al., 1988; Slapeta et al., 2002a). Por compartilharem dos mesmos hospedeiros que T. gondii e N. canimum, tornou-se necessário o diagnóstico diferencial dessas infecções (Mohammed et al., 2003; Dubey et al., 2004c). Outras espécies animais têm sido relatadas como hospedeiros intermediários de Hammondia sp., porém não há relato de aves como hospedeiros naturais desses parasitos.
Os protozoários Toxoplasmatíneos possuem semelhanças fenotípicas, dificultando o diagnóstico morfológico entre eles. Estudos moleculares, ultra-estruturais e antigênicos são necessários para a diferenciação desses táxons (Schares et al., 2005). Em estudos filogenéticos foi verificada uma maior proximidade filogenética entre N. caninum e H.
heydorni, e entre T. gondii e H. hammondi (Ellis et al., 1999b; Mugridge et al., 1999;
Mugridge et al., 2000; Slapeta et al., 2002b).
As técnicas de biologia molecular têm sido imprescindíveis para o diagnóstico das infecções e diferenciação dos parasitos coccídios (Mugridge et al., 1999; Sreekumar et al., 2003b; Costa et al., 2008). A reação de PCR, seguida pelo seqüenciamento do DNA genômico, é conclusiva para a identificação do parasito em amostras de tecidos ou em excrementos animais; a PCR nested tem apresentado uma eficácia a PCR convencional em amostras de campo, pois possui uma maior sensibilidade o que a torna bastante útil para amostras que podem apresentar pequenas quantidades do DNA alvo (Barratt et al., 2008; Silva et al., 2009; Gondim et al., 2010).
É conhecido que galinhas são hospedeiros intermediários naturais de T. gondii e N.
caninum; quando criadas em sistema de vida livre (galinha caipira), pode ocorrer a infecção através da ingestão de oocistos dos parasitos presentes no solo, os quais são eliminados por gatos e cães infectados por T. gondii e N. caninum, respectivamente, visto que é comum a criação de várias espécies animais no mesmo ambiente (Dubey et al., 2003b; Dubey et al., 2006b; Costa et al., 2008; Dubey, 2009).
Os objetivos deste trabalho foram: investigar a frequência molecular de coccídios Toxoplasmatíneos em galinhas caipiras criadas no estado da Bahia, investigar a frequência de anticorpos anti-N.caninum e anti-T.gondii nos animais testados, e isolar N. caninum e T. gondii a partir de tecidos de galinhas soropositivas para estes parasitos.
2. REVISÃO DE LITERATURA
2.1 HISTÓRICO
2.1.1 Toxoplasma gondii
Toxoplasma gondii é um coccídio formador de cisto, cuja primeira descrição ocorreu em 1908, por Splendore no Brasil, que identificou parasito em coelhos e o classificou como pertencente ao gênero Leishmania (Dubey, 2008). No mesmo ano, pesquisadores franceses (Nicolle & Manceaux) identificaram, na África, estágios do parasito em fígado, baço e sangue de gondis, (Ctenodactylus gondii), uma espécie de roedor africano (Dubey, 2002d). Posteriormente o parasito foi classificado como uma nova espécie, recebendo o nome de T. gondii (Dubey, 1977).
A primeira descrição em humanos ocorreu em 1923, em uma criança de 11 meses que apresentava hidrocefalia e microftalmia; em cortes do globo ocular foram visualizados parasitos na retina (Dubey, 2008). Em 1937 foi relatado o primeiro caso de toxoplasmose disseminada em um adulto de 22 anos, sendo que nos anos consecutivos o parasito já era considerado um importante agente causador de encefalomielite em neonatos (Pinkerton & Weinman, 1940). Em 1939, Wolf et. al, relataram o primeiro caso de toxoplasmose humana congênita, em uma menina, que após três dias do seu nascimento, começou a apresentar crises convulsivas (Tenter et al., 2000); no exame post-mortem observou-se T. gondii associado a encefalomielite e retinite, que posteriormente foi isolado dos tecidos infectados da menina. Sabin, em 1941, relatou um caso de toxoplasmose adquirida em uma criança, que veio a óbito, cujo córtex cerebral foi inoculado em camundongo e obtido o isolamento do parasito; a cepa
isolada recebeu o nome RH (as iniciais da criança), a qual é utilizada em laboratórios do mundo inteiro (Sabin, 1941).
No Brasil, o microrganismo foi detectado em humanos com infecção congênita, por meio de cortes histológicos de cérebro e coração de um recém nascido, por Torres em 1927(Dubey, 1977; Tenter et al., 2000).
Na década de 80, inúmeros casos de toxoplasmose neurológica foram associados ao vírus Síndrome da Imunodeficiência Adquirida (AIDS), que promove uma reativação da infecção por T. gondii como conseqüência da supressão da imunidade celular, comprovando a gravidade dessa zoonose em pacientes imunossuprimidos (Dubey, 2008).
A toxoplasmose também é observada em animais de produção e companhia. Em animais de produção como caprinos, suínos e ovinos, podem ocorrer problemas reprodutivos e mortalidade. Bovinos e equinos geralmente não apresentam sinais clínicos quando infectados, apesar de produzirem títulos de anticorpos contra o parasito quando infectados (Pescador et al., 2007b; Millar et al., 2008). A doença clínica no gato raramente é observada, mas pode ocorrer em animais jovens ou idosos, com resposta imunológica deficiente (Dubey, 1986).
Na década de 50 o protozoário foi indicado como um importante causador de aborto em ovinos e caprinos, quando T. gondii foi detectado na placenta de fetos abortados de ambas as espécies (Hartley et al., 1954; Hartley & Marshall, 1957). Posteriormente outros relatos confirmaram que o protozoário era a principal causa de perdas reprodutivas nessas espécies, nas quais foram observados abortos no terço final da gestação, mortalidade neonatal, reabsorção embrionária, fetos mumificados e má formação congênita (Arnaudov et al., 1976; Dubey, 1980; Dubey, 1987; Dubey et al., 1987a; Dubey et al., 1987b).
Em 1911, no estado de São Paulo, Cariri observou T. gondii em baço e fígado de pombos; posteriormente, foram relatadas diversas descrições do parasito em pardais e
outras aves, sendo os parasitos visualizados em esfregaços sanguíneos e fragmentos a fresco de tecidos em lâminas de microscopia. Desde então, T. gondii passou a receber diferentes nomes como T. avium, T. fulicae e T. columbae (Dubey, 2002d). Em 1977, Levine observou similaridades entre os parasitos já relatados, e todas as espécies em aves foram denominadas de Toxoplasma gondii (Levine, 1977).
Em 1942, Nóbrega e Reis isolaram o parasito de um pombo; a partir desse momento buscou-se identificar se as espécies que infectavam mamíferos, identificadas como T.
gondii, se tratavam das mesmas espécies detectadas em aves, concluindo-se, portanto, que T. gondii representava uma única espécie de protozoário capaz de infectar mamíferos e aves (Dubey, 2002d).
Relatos de aves infectadas anteriores a década de 50, só podem ser considerados verdadeiros naqueles casos em que o parasito foi isolado por bioensaio, pois não havia técnicas diagnósticas precisas que possibilitassem a diferenciação de outros protozoários semelhantes (Dubey, 2002d).
Em 1939, Hepding relatou o primeiro caso de toxoplasmose em galinha, entretanto a ave apresentava uma infecção concomitante de Doença de Marek. Outros pesquisadores relataram a toxoplasmose aviária, devido à sintomatologia apresentada pela ave;
contudo, em 1953 Erichsen e Harboe relataram toxoplasmose confirmada por isolamento em galinhas que vieram a óbito; foi realizada necropsia, exame histopatológico e inoculado tecido em camundongo, confirmando-se que T. gondii foi o agente causador da alteração clínica, entretanto é desconhecida a possibilidade desse relato ser toxoplasmose primária ou secundária a alguma infecção viral, devido a falta de arquivo desse material para posterior análise (Dubey, 2009).
2.1.2 Neospora caninum
Em 1984, na Noruega, seis filhotes da raça Boxer apresentaram paresia de membros posteriores e alterações neurológicas; os animais foram testados para T. gondii, porém os resultados foram negativos para este parasito. A necropsia revelou intensa
inflamação, necrose e presença de cistos com numerosos parasitos em sistema nervoso central (SNC) e músculo esquelético. Os cistos eram morfologicamente semelhantes a T. gondii, contudo ultraestruturalmente distintos (Bjerkas et al., 1984).
Mielite foi associada a presença de cistos de protozoários similares a T. gondii e Sarcocystis spp. em cérebros de bezerros. Os soros desses animais foram testados para anticorpos contra ambos os parasitos e não reagiram, contudo não foi possível a identificação do agente (Parish et al., 1987).
Foram observados cistos teciduais na medula espinhal e cérebro de um bezerro com cinco dias de vida que apresentava sintomatologia neurológica. No exame imuno- histoquímico desses tecidos não houve reação para T. gondii e uma leve positividade para Sarcocystis spp, sugerindo que se tratava de um novo gênero de coccídio causador de mielite congênita na espécie bovina (O’ Toole & Jeffrey, 1987).
N. caninum foi classificado em 1988 após um estudo em cortes histológicos de 23 cães com histórico de doença neurológica decorrente de toxoplasmose; observou-se, nesses animais, meningoencefalite e miosite. Após avaliações ultra-estruturais dos tecidos desses animais, 13 casos foram confirmados com toxoplasmose e 10 eram distintos de T. gondii, sendo identificados como N. caninum (Dubey et al., 1988a). No mesmo ano, cinco cães foram diagnosticados com poliradiculoneurite e polimiosite decorrentes da infecção por N. caninum. Os parasitos foram identificados nos tecidos infectados naturalmente dos cães e então obteve-se o primeiro isolamento em cultivo celular (Dubey et al., 1988b). A partir desse momento, neosporose foi incluída no diagnóstico diferencial em cães que apresentavam paresia de membros, encefalite e miosite (Uggla et al., 1989).
A primeira associação de N. caninum com abortamento em bovino se deu em 1989 (Thilsted & Dubey, 1989). Na década de 90 o parasito já era considerado um importante agente causador de abortos e alterações neonatais na espécie bovina (Dubey et al., 1989;
Anderson et al., 1991; Barr et al., 1991; Ogino et al., 1992; Wouda et al., 1992).
Em 1998, cães foram identificados como hospedeiros definitivos de N. caninum após ingerirem camundongos experimentalmente infectados com o parasito. A identidade dos oocistos excretados pelos cães foi confirmada como N. caninum por meio de PCR específica para o parasito (McAllister et al., 1998).
Em 2004 coiotes (Canis latrans) foram relatados como hospedeiros definitivos de N.
caninum após ingestão de tecidos de bovinos infectados experimentalmente com o parasito (Gondim et al., 2004b). Em um estudo recente o dingo australiano (Canis lupus dingo) foi identificado como o terceiro hospedeiro definitivo do parasito (King et al., 2010).
No Brasil, os estudos iniciais relataram evidência sorológica do parasito em bovinos no Estado da Bahia (Gondim et al., 1999b), e no mesmo ano, foi confirmado o primeiro caso de bovino infectado com o parasito no país (Gondim et al., 1999c). Em 2001 foi relatado o primeiro isolamento in vitro do parasito a partir de tecido nervoso de um cão com neosporose na Bahia, que apresentou paresia de membros posteriores e foi a óbito (Gondim et al., 2001).
As aves começaram a ser investigadas como possíveis hospedeiros de N. caninum a partir de 1995, quando ainda se desconhecia que cães eram hospedeiros definitivos do parasito. Foi realizada infecção experimental em aves carnívoras, suspeitando-se que as mesmas poderiam servir como hospedeiros definitivos do parasito; dois falcões (Buteo jamaicensis), dois urubus (Cathartes aura), duas corujas (Tyto alba) e três corvos (Corvus brachyrhynchus) foram alimentados com camundongos que haviam sido inoculados com taquizoítos de N. caninum, porém não houve soroconversão e as aves não eliminaram oocistos do parasito (Baker et al., 1995).
Em diferentes estudos foi demonstrado que galinhas e pombos são susceptíveis a infecção por N. caninum (Furuta et al., 2007; Mineo et al., 2009). Os primeiros relatos de aves naturalmente infectadas com N. caninum se deram com a detecção de DNA do parasito em galinhas (Gallus domesticus) e em pardais (Passer domesticus) no Estado da Bahia (Costa et al., 2008; Gondim et al., 2010).
2.1.3 Hammondia sp.
Os protozoários do gênero Hammondia foram os primeiros coccídios relatados em cães e gatos; inicialmente foram denominados de Coccidium bigemina e posteriormente Isospora bigemina, em 1891 por Stiles (Dubey, 1977). Foi observado que os animais eliminavam em suas fezes tamanhos diferentes de oocistos do parasito. As formas que se desenvolviam nas células epiteliais do intestino delgado apresentavam 10-14 x 7,5-9 µm e as formas que se desenvolviam em tecidos subepiteliais apresentavam 18-20 x 14- 16 µm; ambos apresentavam formato ovóide contendo dois esporocistos com quatro esporozoítos cada (Wenyon, 1926, Brumpt, 1949).
O parasito encontrado na lâmina própria intestinal de um cão foi denominado de Sarcocystis bigemina, e quando encontrado nas células do epitélio intestinal, sugeriu-se que se chamasse Isospora heydorni (Tadros & Laarman, 1976). Quando descrito no Brasil pela primeira vez, foi denominado I. bigemina bahiense (Costa, 1956).
O ciclo de vida de I. bigemina era considerado o mesmo para cães e gatos, e estes quando infectados podiam apresentar como sintomas diarréia, anemia, fraqueza, febre e tremores musculares (Levine, 1973). Houve relatos de infecções naturais pelo parasito em cães e gatos que eliminaram em suas fezes oocistos de diferentes tamanhos (Levine
& Ivens, 1965). Não era possível a distinção desses oocistos com oocistos de T. gondii, então todos eram considerados pertencentes a mesma espécie (Levine, 1973; Fayer, 1974; Dubey & Fayer, 1976).
Devido à descoberta de T. gondii e a observação da similaridade com I. bigemina, novas pesquisas foram iniciadas em torno do parasito e outros coccídios que infectavam cães e gatos (Dubey & Fayer, 1976). Um isolado denominado I. bigemina-Berlim-1971 foi obtido de fezes de cães que ingeriram carne bovina crua e eliminaram oocistos do menor tamanho de I. bigemina (Heydorn & Mehlhorn, 2002).
Após alguns estudos para a elucidação do ciclo de vida de I. bigemina, concluiu-se que se tratava de um protozoário obrigatoriamente heteroxeno (Dubey et al., 2002a e
Heydorn & Mehlhorn, 2002). As fases sexuadas e assexuadas do coccídeo ocorreram apenas nas células epiteliais do intestino delgado; o parasito que se desenvolvia na lâmina própria de cães foi denominado de Sarcocystis bigemina, e para o que se desenvolvia nas células epitelias do intestino delgado e que apresentava menor tamanho, manteve-se a denominação de I. bigemina (Dubey et al., 2002c).
No ano de 1975 foi introduzido o gênero Hammondia, com a descrição de Hammondia hammondi, que tem como hospedeiro definitivo felinos, e como intermediário camundongos (Frenkel & Dubey, 1975). Foi proposto então por Tadros & Laarman que o parasito denominado anteriormente de I. heydorni, viesse a ser chamado de Hammondia heydorni (Tadros & Laarman, 1976). Este protozoário tem como hospedeiros definitivos cães e raposas (Schares et al., 2002).
2.2 CICLO DE VIDA E TRANSMISSÃO
Os protozoários Toxoplasmatíneos (T. gondii, N. caninum e Hammondia sp.) possuem semelhanças morfológicas e ultra-estruturais (Speer et al., 1999), porém há diferenças antigênicas, genéticas e biológicas marcantes entre eles (Dubey et al., 2002a). Esses protozoários apresentam ciclos de vida heteroxenos (Mugridge et al., 1999), possuindo três estágios infectantes em seus ciclos: bradizoítos (no interior de cistos teciduais), taquizoítos e esporozoítos (no interior dos oocistos) (Dubey, 1977; Dubey, 1998a;
Dubey et al., 2002a).
2.2.1 Toxoplasma gondii
Os taquizoítos são estágios com formato semi-lunar, de multiplicação rápida e assexuada nas células dos hospedeiros intermediários ou definitivos. Medem cerca de 2 x 6μm e correspondem a forma menos resistente do parasito, dividindo-se por endodiogenia. A disseminação dos taquizoítos no organismo ocorre através das vias linfática e sanguínea, atingindo diferentes órgãos do indivíduo e transformando-se em
bradizoítos com formação de cistos teciduais (Dubey, 1977; Dubey et al., 1998; Black
& Boothroyd, 2000).
Os bradizoítos são formas de multiplicação assexuada lenta, encontrados nos cistos teciduais, sendo predominantemente observados em sistema nervoso central, musculatura esquelética, musculatura cardíaca e olhos, mas podem ser encontrados em outros órgãos. Os cistos podem ter diferentes tamanhos e são envoltos por uma parede fina e elástica. Dependendo do órgão em que se encontram, podem variar de 5 a 100μm, contendo de 2 a 500 bradizoítos, cada um com tamanho aproximado de 7 por 1,5μm.
Estes cistos teciduais estarão presentes durante toda a vida do hospedeiro, podendo permanecer na forma latente sem a indução de sinais clínicos (Dubey, 1977; Dubey et al., 1998; Tilley et al., 1997; Dubey, 1998a; Black & Boothroyd, 2000).
Os oocistos resultam da multiplicação sexuada do protozoário. São excretados nas fezes na forma não esporulada, medem cerca de 10 a 12μm de diâmetro e têm formato subesférico a esférico. A esporulação pode ocorrer entre 1 e 5 dias após a excreção pelos hospedeiros definitivos, dependendo das condições de temperatura, umidade e presença de oxigênio. Os oocistos esporulados podem ser subesféricos a elipsoidais, medem de 10 a 13μm e apresentam dois esporocistos com quatro esporozoítos, cada um medindo 2 por 6-8μm de diâmetro (Frenkel et al.; 1970, Dubey, 1998a).
Os oocistos esporulados são as formas mais resistentes do parasito, podendo permanecer viáveis na água por mais de 54 meses a 4ºC, e no solo até pelo menos 18 meses em condições de temperaturas diversas (Dubey, 1998b). Apresentam resistência ao tratamento com solução de água com hipoclorito de sódio ou por tratamento de ozônio (Wainwright et al., 2007b), porém são inativados com tratamento de radiação ultra-violeta (Wainwright et al., 2007a). Essas informações são de grande importância para a saúde pública, pois é conhecido que uma das vias de infecção dos animais e humanos pelo parasito ocorre pela ingestão de oocistos presentes em água para consumo (Mullens, 1996; Aramini et al., 1999; Bahia-Oliveira et al., 2003; Jones et al., 2005;
Heukelbach et al., 2007; Petersen et al., 2009). A ingestão de vegetais e frutas
contaminadas com oocistos de T. gondii pode contribuir para a infecção em humanos (Kapperud et al., 1996; Petersen et al., 2009).
Os felídeos domésticos e selvagens são os únicos hospedeiros definitivos de T. gondii, os quais eliminam oocistos do parasito nas fezes (Miller et al., 1972). Diversas espécies animais são conhecidas como hospedeiros intermediários do parasito, que albergam em seus tecidos a forma assexuada (Tenter et al., 2000). Os cães podem eliminar oocistos de T. gondii após ingerirem fezes de gato contendo oocistos, servindo como vetores de transporte na transmissão de T. gondii (Schares et al., 2005). Sabe-se que insetos como:
mosca doméstica (Musca domestica) e várias espécies de baratas (Blatella germanica, Periplaneta australasie, Leucophaea maderae e Eurycotes biolleyi) são hospedeiros mecânicos do parasito, pois podem carregar oocistos em seus órgãos intestinais (Frenkel, 1980).
A transmissão pelo protozoário pode ocorrer por via horizontal, vertical, transfusões de sangue, amamentação ou até mesmo em órgãos transplantados contendo cistos do parasito (Dubey et al., 1970b).
Os felinos excretam oocistos nas fezes 3 a 10 dias após a ingestão de bradizoítos, 21 a 24 dias após ingestão de oocistos esporulados, e oito a 13 dias após a ingestão de taquizoítos (Frenkel et al., 1970; Dubey & Thulliez, 1989; Dubey, 1998a).
Após a ingestão de cistos ou oocistos do protozoário pelos felinos, ocorre a ação de enzimas digestivas com a liberação de bradizoítos e esporozoítos, os quais penetram no tecido epitelial do intestino delgado, iniciando-se a fase sexuada (gametogênese) do ciclo no intestino dos felinos, que é chamada de ciclo enteroepitelial. Os bradizoítos ou esporozoítos no epitélio intestinal multiplicam-se por endodiogenia (Black &
Boothroyd, 2000), originando merontes ou esquizontes maduros, os quais dão origem aos merozoítos (Dubey, 1977). Há uma invasão por merozoítos nas células epiteliais do intestino e diferenciação em gametas femininos e masculinos. Após um processo de maturação, são formados os gametócitos, os quais compreendem os microgametas, que são os gametas masculinos, e os macrogametas, que são os gametas femininos. Estes
macrogametas são fecundados nas células epiteliais do intestino, formando o zigoto.
Após a fertilização, é formada uma parede ao redor do oocisto, ocorre uma ruptura da parece epitelial e o oocisto está pronto para ser eliminado nas fezes na forma não esporulada (Dubey, 1977; Dubey, 1998a).
Todos os hospedeiros intermediários, uma vez infectados por T. gondii, podem ter cistos contendo bradizoítos em seus tecidos. O consumo de carnes cruas ou levemente cozidas é uma forma importante de infecção para os animais e seres humanos (Dubey et al., 1970a; Petersen et al., 2009). Os cistos são inativados quando submetidos ao congelamento na temperatura de -12,4ºC a 0ºC, durante sete dias, ou cozimento a 58ºC por 10 minutos (Dubey et al., 1990; Kotula et al., 1991).
2.2.2 Neospora caninum
Os taquizoítos de N. caninum medem em torno de 7,2 por 2µm e são morfologicamente semelhantes aos de T. gondii. Eles podem ser encontrados nos tecidos de hospedeiros definitivos e intermediários, e também correspondem ao estágio menos resistente do parasito (Dubey & Lindsay, 1996; Speer et al., 1999).
Os bradizoítos medem cerca de 8,1 por 2µm e estão presentes no interior dos cistos teciduais. Os cistos de N. caninum são mais frequentemente observados no SNC, porém já foram relatados em músculo esquelético de cães e bezerros que desenvolveram a doença clínica (Peters et al., 2001a). Esses cistos apresentam uma parede com espessura média de 1,9µm, apresentam formato oval, e podem medir até 107µm de diâmetro; o número de bradizoítos contidos nos cistos pode variar de 20 a 100. (Dubey & Lindsay, 1996; Speer et al., 1999).
Os oocistos de N. caninum não-esporulados são esféricos a subesféricos e medem de 10 a 11μm; quando esporulados medem 11,7±0,43µm por 11,3±0,38µm, apresentam parede lisa, com espessura de 0,6-0,8µm, e apresentam dois esporocistos com quatro esporozoítos cada. Os esporozoítos têm forma alongada e medem 6,5 por 2μm (McAllister et al., 1998; Lindsay et al., 1999). Os oocistos são as formas resistentes
encontradas no meio ambiente e são excretadas pelos hospedeiros definitivos, que consistem de cães (McAllister et al., 1998), coiotes (Gondim et al., 2004b) e dingos (Canis lupus dingo ) (King et al., 2010).
Oocistos de N. caninum conservados em solução de ácido sulfúrico a 2% a 4ºC, durante 46 meses, não induziram infecção em gerbis (Meriones unguiculatus) (Uzeda et al., 2007). Entretanto, foram infectantes para gerbis e vacas, quando conservados sob as mesmas condições durante 180 dias (Gondim et al., 2002; Gondim et al., 2004a).
A transmissão de N. caninum ocorre de forma horizontal ou vertical (via transplacentária), sendo esta última bastante comum em bovinos e também observada em outras espécies animais. A transmissão vertical é uma forma importante da manutenção da neosporose num rebanho e pode ocorrer pela ativação da infecção já existente na fêmea, ou esta pode infectar-se em diferentes momentos da gestação (Trees
& Williams, 2005). Em carnívoros a principal forma de adquirir a infecção é por transmissão horizontal, ou seja, por meio da ingestão de tecidos de hospedeiros intermediários contendo cistos do parasito (Barr et al., 1992; Woods et al., 1994; Barber
& Trees, 1998; Jolley et al., 1999; Anderson et al., 2000; Corbellini et al., 2001; Peters et al., 2001b; Almeria et al., 2002; Williams et al., 2002; Rodrigues et al., 2004;
Serrano-Martinez et al., 2004).
São conhecidas diferentes espécies de hospedeiros intermediários do parasito no meio selvagem e doméstico, as quais são capazes de albergar em seus tecidos as formas assexuadas do protozoário (Barr et al., 1991; Barr et al., 1992; Woods et al., 1994;
Jolley et al., 1999; Peters et al., 2001b; Almeria et al., 2002; Williams et al., 2002;
Rodrigues et al., 2004; Serrano-Martinez et al., 2004; Ferroglio et al., 2007; Costa et al., 2008; Gondim et al., 2010; King et al., 2010).
A quantidade de oocistos excretados pelos cães varia de acordo com tipo e origem do tecido animal infectado ingerido. Houve uma maior excreção de oocistos em cães alimentados com tecidos de bezerros infectados, quando comparada com cães que ingeriram tecidos de camundongos infectados (Gondim et al., 2002; Ferroglio et al.,
2007). Foi demonstrado que cães podem re-excretar oocistos após a ingestão de tecidos infectados em um intervalo de 18 e 20 meses decorridos da infecção primária; a idade do animal é também um fator importante na quantidade de oocistos excretados, sendo que animais jovens excretam quantidades superiores de oocistos aquelas excretadas por animais adultos (Gondim et al., 2005).
A transmissão venérea da neosporose foi suspeitada quando DNA de N. caninum foi detectado no sêmen de bovinos soropositivos para o parasito (Ortega-Mora et al., 2003).
Bovinos reprodutores foram infectados experimentalmente com 108 taquizoítos de N.
caninum inoculados por via intravenosa; DNA do parasito foi detectado no sêmen e sangue dos animais (Serrano-Martinez et al., 2007). Em outro estudo, novilhas foram inseminadas com sêmen de touros contendo DNA de N. caninum, porém não houve soroconversão das novilhas que foram inseminadas, nem dos bezerros nascidos dessas fêmeas. No mesmo trabalho, buscou-se o isolamento do protozoário por meio da inoculação de sêmen infectado bovino em camundongos, porém não houve sucesso no isolamento, nem tão pouco soroconversão dos camundongos inoculados (Ferre et al., 2008).
A possibilidade de transmissão de N. caninum por meio do colostro de vacas foi pesquisada. Bezerros receberam leite, no qual foram adicionados taquizoítos do parasito. Os animais soroconverteram, mas não apresentaram sinais de infecção ou lesões em seus tecidos; na PCR de cérebro e coração desses animais não foi detectado DNA de N. caninum (Davison et al., 2001). Entretanto, colostros de vacas soropositivas foram avaliados e DNA do parasito foi confirmado por PCR, o que representa uma via potencial de transmissão do coccídio em bovinos (Moskwa et al., 2007).
2.2.3 Hammondia heydorni e H. hammondi
Os estágios evolutivos do ciclo de vida de Hammondia sp são pouco conhecidos, uma vez que o parasito nunca foi multiplicado in vitro, e além disso, não há relatos de formas teciduais confirmadas por exame imuno-histoquímico ou molecular nos animais (Schares et al., 2003).
Descrições de Hammondia sp. publicadas antes da classificação de N. caninum, ou seja, antes de 1988, devem ser interpretadas com cuidado, especialmente se o parasito não foi estocado para testes imunológicos e/ou moleculares (Schares et al., 2001).
Os oocistos do protozoário, excretados nas fezes dos hospedeiros definitivos, resultam da reprodução sexuada do parasito e correspondem as formas resistentes. Esporulam entre 12 a 72 horas e passam a conter dois esporocistos, cada um com quatro esporozoítos, tornando-se infectantes. Oocistos de H. heydorni são excretados por canídeos, enquanto que os de H. hammondi são excretados por felídeos (Mohammed et al., 2003; Dubey et al., 2004c). Quando não esporulados, apresentam formato esférico a sub-esférico com cerca de 10,6 por 13,2 μm. Quando esporulados medem entre 10-12 x 12-14 μm. Os esporocistos, por sua vez, medem de 6-8 x 4-6 μm, e cada esporozoíto em torno de 6 x 2 μm (Speer et al., 1988).
Cistos teciduais de H. heydorni nunca foram observados em ruminantes e canídeos (Dubey et al., 2002a), porém, supostos cistos do parasito foram descritos em cérebro de porco da índia experimentalmente infectado com oocistos de H. heydorni. Os cistos apresentaram similaridade estrutural com os cistos de T. gondii, H. hammondi e cistos jovens de N. caninum, entretanto a identidade do parasito não foi confirmada através de testes moleculares ou ultra-estruturais, não sendo possível a confirmação de que se tratava de H. heydorni (Matsui, 1991).
Apesar de trabalhos anteriores a 1988 terem descrito diferentes espécies animais como hospedeiros intermediários de H. heydorni, tais resultados são questionáveis, pois não foram realizados testes moleculares ou imunológicos para a confirmação do parasito (Schares et al., 2001). Algumas espécies de ruminantes, como gazela (Gazella gazella) (Mohammed et al., 2003), caprinos (Silva et al., 2009) e bovinos (Soares et al., 2009) foram confirmadas como hospedeiros intermediários naturais de H. heydorni. Os únicos hospedeiros intermediários de H. hammondi, identificados até o momento são camundongos e ratos (Dubey & Sreekumar, 2003).
2.3 IMPORTÂNCIA ECONÔMICA
2.3.1 Toxoplasmose
T. gondii tem ocorrência mundial e infecta diversas espécies de animais homeotérmicos (mamíferos e aves). A toxoplasmose é uma das zoonoses mais difundidas no mundo, com estimativas de que um terço da população mundial esteja infectada com T. gondii (Acha & Szyfres, 1986). Nos Estados Unidos e Reino Unido a prevalência de anticorpos contra o parasito é de 16 a 40%; na Europa Ocidental, América Central e do Sul, as estimativas sobem para 50 a 80% (Tenter et al., 2000; Jones et al., 2001).
Aproximadamente quatro mil crianças nascem com toxoplasmose congênita nos Estados Unidos, gerando um custo anual para o país com o tratamento em torno US$ 8 bilhões (Dubey et al., 2005c). T. gondii, em conjunto com outros dois patógenos (Salmonella sp. e Listeria monocytogenes) são responsáveis por 75% das mortes por causa alimentar no país (Mead et al., 1999). No Brasil estima-se que cerca de 60% da população são infectadas com T. gondii (Sobral et al., 2005).
Dentre os hospedeiros intermediários, os animais de produção que têm sido mais associados com a transmissão da toxoplasmose são suínos, ovinos, caprinos e aves.
Bovinos e eqüinos também se infectam com T. gondii, porém com menor frequência, pois essas espécies parecem apresentar maior resistência à infecção (Garcia et al., 1999).
Entre os animais de produção, ovinos e caprinos são consideradas as espécies animais mais susceptíveis à toxoplasmose. As perdas mais significativas nesses animais estão relacionadas a abortos, porém são também observadas lesões oculares e diminuição na produção leiteira (Acha & Szyfres, 1986; Millar et al., 2008).
Em Pernambuco, em rebanhos com histórico de perdas reprodutivas, foram encontrados 40,4% de animais soropositivos, onde desse total de animais infectados 43,88% eram fêmeas, o que é sugestivo que T. gondii é um importante causador de perdas reprodutivas nesse Estado (da Silva et. al., 2003). A região do nordeste brasileiro tem
sido amplamente estudada, pois a caprinocultura e ovinocultura são atividades bastante exploradas na região e representam 91% e 55%, respectivamente, do efetivo do país (IBGE, 2006).
A associação de T. gondii com perdas reprodutivas em caprinos foi confirmada no sul do Brasil; o parasito foi identificado em amostras de aborto por meio de exame histopatológico, imuno-histoquímico e PCR nested (Pescador et al., 2007b).
No Uruguai, onde cerca de 38% dos ovinos são soropositivos para T. gondii, estima-se que as perdas reprodutivas por toxoplasmose cheguem a 3,9%, gerando uma perda para a economia do país de US$1,4 a 4,7 milhões (Freyre et al., 1999).
2.3.2 Neosporose
A neosporose bovina é responsável por grandes perdas econômicas em todo o mundo.
Os prejuízos diretos decorrentes dessa enfermidade estão relacionados à perda fetal.
Outros prejuízos estão associados com o estabelecimento do diagnóstico, redução da eficiência reprodutiva e redução na produção ou substituição das vacas com os abortos (Barling et al., 2000; Dubey et al., 2006a; Dubey & Schares, 2006).
Transtornos reprodutivos causados pela neosporose são observados em diversos países.
O parasito tem sido responsável por perdas econômicas significativas em gado de corte e leite (Moore et al., 2003; Koiwai et al., 2005; Hall et al., 2005; Pabon et al., 2007). No Brasil foi encontrada uma prevalência de infecção por N. caninum em 23,3% a 57,7%
de fetos abortados no sul do país (Corbellini et al., 2002; Pescador et al., 2007a). O custo por feto abortado, as doses de sêmen utilizadas em inseminação artificial, valor genético da matriz e do touro, a capacidade reprodutiva da progênie, e o aumento do intervalo entre partos nas fêmeas, somam um prejuízo em milhões por ano para o Canadá, Austrália e Nova Zelândia (Aguirre et al., 2007).
Além das perdas reprodutivas, outros prejuízos têm sido associados à infecção por N.
caninum, como a diminuição na produção e no teor de gordura do leite, assim como na
redução da produção de leite; na Califórnia, vacas soropositivas produziam aproximadamente 1kg a menos de leite do que as soronegativas (Thurmond & Hietala, 1997). Na Flórida, as vacas infectadas tiveram uma redução da produção leiteira em 3 a 4% por lactação (Hernandez et al., 2001). Fêmeas com altos títulos de anticorpos contra o parasito produziram menor quantidade de leite do que vacas com baixos títulos em rebanho com surto endêmico de abortos (Bartels et al., 2006).
Perdas econômicas em gado de corte têm sido relacionadas com a infecção por N.
caninum. Bezerros infectados apresentaram redução na eficiência alimentar, diminuição no ganho de peso e menor rendimento de carcaças (Barling et al., 2001). Os animais soropositivos geram maiores custos de tratamento quando acometidos por outras enfermidades em relação aos soronegativos (Barling et al., 2000).
2.4 IMPORTÂNCIA DAS AVES NA TRANSMISSÃO DE PROTOZOÁRIOS TOXOPLASMATÍNEOS
2.4.1 Toxoplasma gondii
Diversas espécies de aves domésticas e silvestres têm sido identificadas como hospedeiros intermediários naturais de T. gondii, a exemplo de anseriformes (patos), accipitriformes (gaviões, abutres, urubus, falcão), galiformes (perdizes, faisões e perus), gruiformes (carquejas), charadriiformes (gaivotas, andorinhas), columbiformes (pombos, rolas), strigiformes (corujas) e passeriformes (pardais, escrevedeira-amarela) (Dubey et al., 2001). A infecção de aves com T. gondii tem sido observada desde 1911, quando o parasito foi observado pela primeira vez em aves, por Cariri (Dubey, 2009).
Estudos sorológicos em aves e isolamento de T. gondii a partir de tecidos de aves por bioensaio em camundongos e gatos, têm sido relatados em diversos países. Essas aves são oriundas de zoológicos (Literák et al., 1992; Zhang et al., 2000; Dubey et al., 2001), criatórios particulares (Leite et al., 2007) e aves de vida livre (Dubey et al., 1992; Quist et al., 1995; Work et al., 2000; Dubey et al., 2003b). Algumas espécies de aves são
resistentes à infecção por T. gondii, porém outras podem desenvolver sintomatologia da doença e ir a óbito. Em 2002, dois gansos foram a óbito por toxoplasmose disseminada, apresentando cistos do parasito em fígado, baço e ureter, além de lesões significativas em outros órgãos (Dubey et al., 2001).
Estudos sobre parasitos Toxoplasmatíneos em galinhas têm recebido grande atenção em diversas regiões do mundo, incluindo o Brasil (Dubey, 2009), que conta com mais de 109.127.169 cabeças de galinhas poedeiras, onde o nordeste do país representa cerca de 14% desse efetivo comercial; porém, essa quantidade de aves no país é subestimada, pois é comum a criação de galinhas caipiras junto com outras espécies animais, o que não é contabilizado (IBGE, 2009). Estima-se que no ano de 2009 o consumo de carne dessa espécie foi de 7,6 milhões de toneladas (http://www.mfrural.com.br/ acesso 02/03/2010).
Frangos de criações comerciais estão menos expostos a T. gondii quando comparados com galinhas caipiras. Na Bahia, 3% de 200 galinhas poedeiras foram soropositivas para T. gondii, número este significativamente inferior ao de galinhas caipiras soropositivas para o parasito (25%) (Costa et al., 2008). No Rio Grande do Sul foi encontrada uma soroprevalência de 2,8% em aves comerciais abatidas em um frigorífico (Meireles et al., 2003).
Devido à mudança de hábitos alimentares, a criação de galinhas caipiras vem aumentando, pois os consumidores têm procurado galinhas orgânicas para o consumo, resgatando então o sistema de criação extensivo. Em 1995, foi demonstrado que pessoas que mantinham criações de galinhas caipiras apresentaram maiores freqüências de anticorpos contra T. gondii do que pessoas que não mantinham contato com aves (Camargo et al., 1995).
Um aspecto importante das aves na transmissão de T. gondii para os carnívoros, é que cães e gatos semi-domiciliados ou de vida livre, tem o hábito de caça, sendo que comumente suas presas são pequenos roedores e aves (Frenkel et al., 1987; Ferroglio et al., 2007). As aves representam 24% dos animais silvestres rotineiramente caçados por
felinos, contudo, as pertencentes à ordem Passeriforme são mais observadas na preferência de caça pelo animal, pois são aves pequenas e encontradas nas cidades (Woods et al., 2003).
Pombos e pardais são as aves silvestres mais comumente encontradas no meio urbano, portanto, são transmissores potenciais de T. gondii e N. caninum para cães e gatos, os quais podem eliminar oocistos no ambiente, facilitando a transmissão desses parasitos para humanos (Literák et al., 1992; Tsai et al., 2006; Alves et al., 2009; Gondim et al., 2010).
O solo contaminado com oocistos de T. gondii pode ser fonte de infecção para animais e humanos, sendo que as galinhas são boas indicadoras de contaminação ambiental, pois se alimentam diretamente do solo (Ruiz & Frenkel, 1980). Em um estudo no Rio de Janeiro, em uma área endêmica para toxoplasmose humana, as galinhas serviram como bons indicadores de contaminação ambiental; obteve-se isolamento de T. gondii em aves que residiam na região estudada (da Silva et al., 2003).
Galinhas alimentadas com oocistos de T. gondii podem albergar cepas virulentas do parasito em diferentes tecidos sem apresentar sinais clínicos de toxoplasmose (Dubey et al., 2002b). Aves infectadas podem servir de fonte de infecção para gatos, que podem ser alimentados com seus tecidos e eliminar oocistos no ambiente (Ruiz & Frenkel, 1980). Em um estudo para avaliar a presença de T. gondii em galinhas e as diversidades genéticas entre as cepas isoladas, foram observadas cepas com variados graus de virulência e uma frequência de animais soropositivos entre 2 a 100% (Dubey, 2009).
Toxoplasma gondii está presente em galinhas em diferentes continentes, sendo que diversos trabalhos têm relatado a soroprevalência para o parasito nessas aves (Dubey et al., 2003a; Dubey et al., 2003b; Dubey et al., 2003c; Dubey et al., 2003d; Sreekumar et al., 2003a; Dubey et al., 2004a; Dubey et al., 2008). No Brasil, galinhas soropositivas para T. gondii têm sido observadas em diferentes regiões do país, conforme dados sumarizados na Tabela 1.
Tabela 1 – Frequências de anticorpos anti-Toxoplasma gondii em galinhas criadas em diferentes Estados do Brasil
Estado Sistema de manejo
Método diagnóstico
n. Ponto de corte
Frequência Referência
AM VL
VL
MAT HAI
50 17
1:5 1:16
66%
41,2%
(Dubey et al., 2006b)
(Ferraroni and Marzochi, 1980)
RS VL MAT 50 1:10 38% (Dubey et al.,
2007)
PA VL MAT 34 1:10 58,8% (Dubey et al.,
2007)
PR VL MAT 40 1:5 40% (Dubey et al.,
2003d)
RJ VL MAT 198 1:10 65,1% (da Silva et al.,
2003)
SP MAT 82
1:10
40,2% (Dubey et al., 2002b)
PE, RN, MA, BA, CE, SE e AL
VL MAT 152 1:5 53,3% (de Oliveira et
al., 2009)
BA VL e C IFI 200
200
1:16 25%
3%
(Costa et al., 2008)
MAT = aglutinação modificada; IFI = imunofluorescência indireta; HAI = teste de hamaglutinação; VL = vida livre, C = criação comercial
O isolamento de T. gondii por bioensaio em camundongos e gatos a partir de tecidos de galinhas naturalmente infectadas, tem sido descrito em vários países, sendo portanto evidente a importância da galinhas na transmissão do parasito (Dubey, 2009). No Brasil o parasito tem sido isolado em diversas regiões, incluindo Amazônia (Dubey et al., 2006b), Rio de Janeiro (Dubey et al., 2003a), Paraná (Dubey et al., 2003d), São Paulo (Dubey et al., 2002b), Pará, Rio Grande do Sul (Dubey et al., 2007), Minas Gerais (Brandao et al., 2006), Pernambuco, Rio Grande do Norte, Maranhão, Bahia, Ceará, Sergipe e Alagoas (de Oliveira et al., 2009).
2.4.2 Neospora caninum
Em um estudo epidemiológico realizado na Holanda, a presença de galinhas, gansos e patos foi associada estatisticamente com uma maior ocorrência de abortos bovinos por N. caninum (Bartels et al., 1999). Em outro estudo epidemiológico, a presença de galinhas foi considerada um fator de risco na transmissão do protozoário para a espécie bovina (Otranto et al., 2003).
A confirmação das aves como hospedeiros intermediários naturais de N. caninum só foi relatada recentemente, quando DNA do parasito foi detectado em tecidos de galinhas e de pardais (Costa et al., 2008; Gondim et al., 2010).
Sabe-se que galinhas caipiras (criadas em contato com o solo) estão mais expostas a N.
caninum do que galinhas de criações comerciais; no Estado da Bahia, 23,5% de 200 galinhas caipiras foram soropositivas para o parasito, ao passo que somente 1,5% de 200 galinhas poedeiras de criatórios comerciais foram soropositivas para N. caninum (Costa et al., 2008).
A identificação de pardais como hospedeiros intermediários naturais de N. caninum, além de galinhas, amplia o leque de hospedeiros naturais do parasito; essas aves provavelmente se infectam a partir da ingestão de oocistos presentes no solo. A identificação de N. caninum em tecidos de aves naturalmente infectadas pode ter uma grande importância epidemiológica, uma vez que tecidos de aves são consumidos por canídeos e outros possíveis hospedeiros definitivos, o que pode ter um grande impacto na disseminação de N. caninum (Gondim et al., 2010).
Infecções experimentais com N. caninum têm sido realizadas em diferentes espécies de aves. Pombos (Columbia lívia) e Poephila guttata foram inoculados com N. caninum com o intuito de investigar se essas aves poderiam servir como hospedeiros intermediários do parasito. Pombos foram susceptíveis à infecção, pois apresentaram sorologia, PCR e cultura celular positivas para o parasito, além de lesões características
em exame histopatológico; Poephila guttata foram resistentes a infecção (McGuire et al., 1999).
Frangos, galinhas poedeiras e ovos embrionados foram inoculados com taquizoítos de N. caninum por via intraperitoneal e cavidade alantoideana. As galinhas demonstraram resistência ao parasito, pois não apresentaram sinais clínicos da doença, porém soroconverteram após 15 dias de inoculação e os títulos de anticorpos não foram dose- dependentes. Contudo, os ovos embrionados infectados induziram a excreção de oocistos em cães, o que coloca a possibilidade do papel das aves na transmissão do parasito para outras espécies animais (Furuta et al., 2007).
Em outro estudo, pombos foram inoculados com taquizoítos de N. caninum, sendo que um pombo foi a óbito após 25 dias de inoculação; no exame imuno-histoquímico, parasitos foram encontrados em pulmões, coração, sistema nervoso central, fígado, baço e rins (Mineo et al., 2009).
Apesar da confirmação de infecção natural de N. caninum em galinhas e pardais (Gondim et al., 2010; Costa et al., 2008) e da demonstração da susceptibilidade de certas espécies de aves em infecções experimentais com o parasito (McGuire et al., 1999; Mineo et al., 2009), ainda não foi confirmado o papel das aves na transmissão do parasito para outras espécies animais.
2.4.3 Hammondia sp.
Até o momento da elaboração deste trabalho, não foram identificados quaisquer relatos de infecção natural por H. heydorni ou H. hammondi em qualquer espécie de ave doméstica ou silvestre.
2.5 DIAGNÓSTICO DE INFECÇÃO POR PARASITOS TOXOPLASMATÍNEOS EM AVES
2.5.1 Testes sorológicos
A reação de Sabin-Feldman (dye test), criada em 1948, foi primeiro teste sorológico desenvolvido para a detecção de anticorpos anti-T. gondii nos animais; este teste ainda é utilizado para a detecção de anticorpos na espécie humana, pela sua alta sensibilidade e especificidade (Reiter-Owona et al., 1999), porém em aves não é mais utilizado pela ocorrência de resultados falsos negativos (Ruiz & Frenkel, 1980).
O teste de imunofluorescência indireta (IFI) tem sido empregado largamente para a detecção de anticorpos anti-T. gondii em humanos e animais, sendo geralmente utilizado anticorpo secundário espécie-específico (Teti et al., 1981). O teste tem sido bastante utilizado para a investigação de anticorpos contra o parasito em aves (Silva et al., 2002).
A IFI foi o primeiro teste sorológico empregado para a detecção de anticorpos anti-N.
caninum (Dubey et al., 1988b), sendo considerado o padrão ouro para o diagnóstico sorológico do parasito (Dubey et al., 1988b; Bjorkman & Uggla, 1999). A IFI para N.
caninum mostrou reação cruzada insignificante com outros parasitos coccídios apicomplexas, em especial em animais infectados com T. gondii, cujas reações geraram fluorescência apical dos taquizoítos de N. caninum (Pare et al., 1995b; Dubey et al., 1996; Trees et al., 1993). Na IFI para N. caninum, só são consideradas positivas, as reações caracterizadas por fluorescência periférica total dos taquizoítos (Pare et al., 1995b). O teste tem sido amplamente utilizado para o diagnóstico sorológico em diferentes espécies animais, incluindo as aves (Bjorkman & Uggla, 1999; McGuire et al., 1999; Furuta et al., 2007; Costa et al., 2008).
O ensaio de imunoadsorção enzimática (ELISA) é utilizado para a detecção de anticorpos contra N. caninum e T. gondii, e apresenta algumas vantagens sobre a IFI:
um maior número de amostras pode ser processado e a leitura do teste é totalmente
automatizada; o antígeno utilizado para o teste pode ser elaborado de diferentes formas, o que muitas vezes torna difícil a comparação dos resultados por diferentes laboratórios (Pare et al., 1995a; Baszler et al., 1996; Bjorkman et al., 1999).
A aglutinação modificada (MAT) é um teste que apresenta elevadas sensibilidade e especificidade. É um teste de grande praticidade, pois não necessita de equipamentos sofisticados e não requer o emprego de um conjugado espécie-específico, podendo ser utilizado em qualquer espécie animal. Ele tem sido utilizado para o diagnóstico sorológico de T. gondii em diversas espécies animais, incluindo humanos (Kirkpatrick et al., 1990; Bjorkman & Uggla, 1999; Cullen et al., 2005; Fenaux et al., 2005; Silva et al., 2007; de Camps et al., 2008; Fornazari et al., 2009; Oksanen et al., 2009). O teste tem sido amplamente utilizado para o diagnóstico sorológico de T. gondii em aves (Prestrud et al., 2007; Salant et al., 2009), incluindo galinhas (Abrahams-Sandi &
Vargas-Brenes, 2005; Carrasco et al., 2006; Aguirre et al., 2007; Alvarado-Esquivel et al., 2008; Bahia-Oliveira et al., 2009). Um teste de aglutinação modificada foi desenvolvido para N. caninum e comparado a IFI e ELISA, apresentando especificidade e sensibilidade semelhantes aos referidos testes (Packham et al., 1998; Romand et al., 1998), contudo a eficiência do teste pode variar de acordo com a espécie animal testada (Bjorkman & Uggla, 1999).
A técnica de hemaglutinação indireta (HAI), a qual é bastante semelhante aos métodos de aglutinação citados acima, tem sido utilizada para o diagnóstico sorológico de T.
gondii em diversas espécies animais, incluindo aves, sendo que neste teste o antígeno é adsorvido a eritrócitos, o que facilita a visualização das reações (Parenti et al., 1986;
Marobin et al., 2004; Gondim et al., 2010).
O Western blotting é um teste sorológico com elevadas sensibilidade e especificidade, sendo particularmente úteis na pesquisa de antígenos específicos de T. gondii e N.
caninum, podendo ser utilizado como exame diagnóstico, teste de imunização ou para a identificação de proteínas dos agentes para a utilização em outros testes diagnósticos, como os diferentes tipos de ELISAs (Harkins et al., 1998; Howe & Sibley, 1999;
Aguado-Martinez et al., 2005; Silva et al., 2007; Andreotti et al., 2009).
Outros exames podem ser utilizados para a detecção de anticorpos anti-T. gondii, a exemplo do teste de aglutinação em látex e teste de fixação de complemento, porém estes têm sido raramente empregados para a detecção de anticorpos em aves (Dubey, 2009).
2.5.2 Diagnóstico molecular
As técnicas moleculares têm grande utilidade para a identificação de agentes infecciosos em tecidos e secreções de animais, possibilitando, em particular, a identificação de RNA ou DNA específicos de organismos, informações estas que não podem ser obtidas por meio dos testes imunológicos ou morfológicos (Singh, 1997).
A PCR tem sido uma importante ferramenta para a detecção e diferenciação de parasitos. Tem sido amplamente difundida, pela sua alta sensibilidade e especificidade, e por ter a capacidade de detectar o DNA dos parasitos em diferentes tecidos, em fezes e fluidos corpóreos (Singh, 1997; Slapeta et al., 2002a; Slapeta et al., 2002b; Sreekumar et al., 2003b; Serrano-Martinez et al., 2007).
Devido a proximidade morfológica e taxonômica entre os coccídios Toxoplasmatíneos, os testes moleculares têm sido utilizados em inúmeros estudos para a diferenciação de T gondii, N. caninum, H. heydorni e H. hammondi (Mugridge et al., 1999; Schares et al., 2005; Wapenaar et al., 2006).
A PCR nested consiste na realização de duas reações de amplificação, sendo um par de primers para cada reação; o emprego de duas amplificações sucessivas aumenta a sensibilidade da reação e tem sido usada com sucesso para a detecção específica de protozoários coccídios, principalmente em amostras de campo, que podem conter quantidades diminutas do organismo alvo (Ellis et al., 1999a; Medina et al., 2006). Essa técnica tem sido utilizada em estudos envolvendo mamíferos e aves, possibilitando a detecção de DNA de um dado parasito, mesmo em animais soronegativos para o mesmo (Santos et al., 2009; Silva et al., 2009; Gondim et al., 2010).
O Espaço Interno Transcrito 1 (ITS-1) do rDNA, é uma seqüência-alvo bastante utilizada como marcador molecular em estudos envolvendo coccídios Toxoplasmatíneos, pois trata-se de uma região menos conservada do rDNA e que possui diferenças marcantes entre as espécies dessa subfamília (Muller et al., 1996). Esta seqüência (ITS-1) está localizada entre os genes que codificam as unidades 18S e 5,8S e são moléculas estruturais dos ribossomos dos eucariotos, estando presente em múltiplas cópias em um mesmo organismo (Hillis & Dixon, 1991). Portanto, o ITS-1 tem ampla utilização para diagnóstico molecular e estudos filogenéticos (Ellis, 1998; Ellis et al., 1998; Mugridge et al., 1999; Sreekumar et al., 2003b; Sreekumar et al., 2005).
Os diferentes isolados ou cepas de T. gondii provenientes de tecidos humanos e de diferentes espécies animais foram classificados em três linhagens clonais (I, II, III), as quais estão relacionadas à virulência e patogenicidade dos isolados (Sibley &
Boothroyd, 1992; Howe & Sibley, 1995, Fuentes et. al., 2001; da Silva et. al., 2005).
Verificou-se que as cepas do tipo I são virulentas para camundongos, ao passo que as cepas dos tipos II e III possuem baixa virulência; as cepas do tipo II são observadas em toxoplasmose humana e as cepas do tipo III são mais freqüentes nos animais não humanos, embora cepas das três linhagens clonais tenham sido observadas em humanos (Howe e Sibley, 1995; Fuentes et. al., 2001; Sibley, 2003).
Em estudos recentes realizados no Brasil, a partir de 125 cepas de T. gondii isoladas de gatos, galinhas e cães, observou-se que os genótipos dessas cepas diferem, em sua maioria, das linhagens clonais tipos I, II e III predominantes nos parasitos isolados na Europa e América do Norte; enquanto que na Europa e Amércia do Norte o tipo II é o tipo predomiannte, no Brasil não foi observada cepa alguma classificada como tipo II (Pena et al., 2008). Esses autores observaram que as cepas de T. gondii do Brasil são altamente diversificadas e se enquadram em quatro tipos genéticos distintos, classificados como BrI, BrII, BrIII e BrIV, sendo que a BrI é altamente virulenta, a BrIII é avirulenta, e as BrII e BrIV são moderadamente virulentas.
