Este tipo de marcadores bioquímicos pode ser quantificado através de testes laboratoriais, onde se faz a avaliação de parâmetros séricos no sangue e urina que ajudam a determinar alterações da taxa de reabsorção e formação óssea. Assim podem
indicar a presença ou ausência de uma patologia óssea, prevendo o comportamento dessa mesma patologia (Srivastava, 2005).
Os marcadores do metabolismo ósseo ajudam a inferir sobre os principais órgãos e sinalizadores celulares que possam estar envolvidos na etiopatologia da osteoporose (Srivastava, 2005).
Os dois maiores grupos são então os marcadores de reabsorção e formação óssea (tabela 1). No entanto existem outros marcadores do metabolismo ósseo baseados nos mecanismos inflamatórios (Hertrampf et al., 2009).
Marcadores de formação/reabsorção óssea
Dada a complexidade do metabolismo do tecido ósseo é normalmente necessário utilizar marcadores mais específicos para avaliarem a perda de osso e a regeneração do osso, de forma independente.
Tabela 1: Marcadores de reabsorção/ formação óssea
Marcadores de formação óssea Marcadores de reabsorção óssea
Fosfatase alcalina (ALP)
Fosfatase alcalina óssea (BALP) Osteocalcina (OC)
Osteopontina (OPN)
Propéptido N-terminal do procolagénio tipo I (P1NP)
Desoxipiridinolina (DPD)
Fosfatase ácida resistente ao tartarato (TRAP)
Telopeptido C-Terminal do Colagénio tipo I (CTx)
Telopeptido N-terminal do colagénio tipo I (NTx)
Metaloproteinases de matriz (MMPs)
Fosfatase Alcalina
A fosfatase alcalina (ALP) designada pelo código EC 3.1.3.1 pelo comité internacional da bioquímica e biologia molecular é uma enzima hidrolítica responsável pela remoção de grupos fosfato de vários tipos de moléculas, como os nucleótidos, proteínas e alcaloides. O processo de remoção do grupo fosfato é efetuado com recurso a um processo designado fosforilação (Harrison et al., 2008).
Nos mamíferos em geral, a fosfatase alcalina está presente na maioria dos tecidos do organismo, sendo a sua concentração particularmente elevada no fígado, vias biliares, rins e osso. O intervalo normal da fosfatase alcalina é variável consoante a espécie e o tecido em análise. Varia também de acordo com o sexo, idade, concentração de estrogénios. Clinicamente níveis elevados da enzima ALP podem ser indicadores de
que os ductos biliares estão obstruídos, gravidez e perda óssea acelerada (Harrison et al., 2008).
A fosfatase alcalina específica do osso é uma das várias isoenzimas da fosfatase alcalina. Esta é sintetizada pelos osteoblastos, estando envolvida no metabolismo ósseo. Embora o seu papel específico no processo de formação óssea seja ainda desconhecido pensa-se que esteja diretamente envolvida na calcificação da matriz óssea. É portanto considerado um marcador altamente específico do metabolismo ósseo, em especial da formação do osso através dos osteoblastos. Valores muito elevados desta enzima estão normalmente relacionados com o aumento de doençass associadas ao metabolismo ósseo como a osteoporose, doença de Paget e hipertiroidismo (Millán, 2006).
Osteopontina
A osteopontina também conhecida como sialoproteina I, tem um peso molecular que ronda os 66 kDa e é codificada pelo gene OPN. Em seres humanos o gene situa-se no braço longo do cromossoma 13. O gene é composto por sete exões (Kiefer et al., 1989; Young et al., 1990). A OPN é uma proteína da matriz extracelular (MEC) carregada negativamente. É composta por cerca de 300 aminoácidos (297 em rato e 314 em humanos). Esta proteína pode sofrer modificações pós-tradução, que aumentam o seu peso molecular em cerca de 44 kDa (Rangaswami et al., 2006). Esta glicoproteína não colagenosa foi pela primeira vez descrita em 1986, pertencendo atualmente a categoria das proteínas SIBLING (Small Integrin-binding Ligand, N-linked Glycoprotein) (Huang et al., 2005; Banerjee et al. 2009). É caracterizada como uma proteína multifuncional, que embora seja altamente expressa ao nível dos ossos pode ser encontrada em muitos tecidos do organismo, nomeadamente nos macrófagos, células endoteliais, células musculares lisas e placenta. A nível do osso são produzidas por fibroblastos, pré-osteoblastos, osteoblastos, osteócitos, odontoblastos, células de medula óssea e condrócitos hipertróficos (Ashizawa et al., 1996).
Apesar de ainda não se compreenderem detalhadamente as vias de regulação da expressão da OPN, pensa-se que esta esteja envolvida na regulação da mineralização óssea uma vez que é fortemente produzida pelos osteoclastos e osteoblastos. Em particular, os estudos nesta área sugerem que desempenhe um papel na fixação dos osteoclastos à matriz mineral dos ossos (Huang et al., 2005; Banerjee et al., 2009).
Pensa-se que a estimulação da expressão da OPN também ocorra após a exposição das células a citocinas pró-inflamatórias, mediadores clássicos de inflamação aguda (TNF-α, IL-1β, angiotensina II e hormona paratiróide (PTH) (Guo et al., 2001).
O facto de a osteopontina interagir com vários recetores da superfície celular que são expressos ubiquamente torna-a um componente ativo em muitos processos fisiológicos e patológicos, incluindo a cicatrização de feridas, remodelação óssea, tumorogénese, inflamação, isquemia e resposta imunitária. Portanto, a manipulação dos níveis plasmáticos de OPN pode ser útil no tratamento de doenças autoimunes, metástase do cancro e osteoporose (Wang e Denhardt, 2008).
Osteocalcina
A osteocalcina é uma proteína não colagenosa dependente da vitamina K, com um peso molecular de 5 a 6 kDa. É codificada pelo gene BGLAP, sendo produzida no osso pelos osteoblastos maduros e secretada para o espaço extracelular, onde podem entrar na circulação sanguínea ou ligar-se ao osso mineralizado (Puchacz et al., 1989).
Esta contém três resíduos de ácido gamalinolênico (Gla), que são pos- transcricionalmente modificados pela gama-glutamil carboxilase. A carboxilação destes resíduos é essencial para facilitar a sua ligação à hidroxiapatite e posterior deposição na matriz óssea mineralizada. Deste modo a osteocalcina circulante pode estar presente na forma carboxilada como descarboxilada. A vitamina K desempenha portanto um papel especialmente importante por ser um cofator da gama-glutamil carboxilase responsável pela carboxilação da OC, reduzindo deste modo a libertação de OC para a circulação (Yu et al., 2010).
A OC normalmente está implicada na homeostase iónica do cálcio e vários estudos apontam para uma correlação direta entre o aumento dos níveis de soro de osteocalcina e o aumento da densidade mineral óssea. Desde que se descobriu este facto começou a ser utilizada em larga escala como biomarcador do metabolismo ósseo (Huang et al., 2005). Vários autores observaram que existe uma associação entre os níveis desta proteína e o metabolismo energético em modelos animais, devido a relação inversa entre o nível de glicose no plasma/ massa gorda e níveis de OC (Razzaque et al., 2011).
MMPs:
As metaloproteinases de matriz são protéases, endopeptídases dependentes de zinco. Estas constituem uma família de enzimas estruturalmente relacionadas que desempenham um papel fundamental na degradação da matriz extracelular em situações normais ou patogénicas. Estão normalmente implicadas em processos de desenvolvimento embrionário, cicatrização de lesões, angiogénese, imunidade, inflamação, metastização e degradação óssea (Ortega et al., 2003; Yu e Han, 2006).
Foram descritas pela primeira vez por Jerome Gross e Lapière em 1962, que observaram atividade enzimática das mesmas ao nível da matriz extracelular (Krane e Inada, 2008).
Existem mais de 20 metaloproteinases, cada uma codificada por um gene diferente. As MMPs podem ser classificadas em pelo menos cinco grupos principais, de acordo com a sua especificidade, estrutura primária do substrato e localização celular (tabela 2) (Murphy et al., 2002; Visse e Nagasse, 2003). Os principais grupos são: as colagenases, gelatinases, estromelinas, matrilisinas e MMs do tipo membranar (MT- MMPs). Existem outras metaloproteinases que não se enquadram em nenhum deste grupo, tendo portanto uma classificação distinta (Murphy et al., 2002).
Tabela 2: Classificação das diversas Metaloproteinases de matriz (adaptado de: Murphy et al., 2002).
Tipo Gene Substratos principais
Colagenases
MMP-1 MMP-8 MMP-18
Colagénio I,II,III IV e X, gelatina, proteoglicanos, agracano, versicano. Colagénio I,II,III V, VII, VIII e X, gelatina, α-2 antiplasmina.
Colagénio I,II,III e IV, gelatina, plasminogénio, tenascína.
Gelatinases MMP-2
MMP-9
Colagénio I, IV,V,VII, X, XI, gelatina, fibronectina, elastina, agecano. Colagénio IV,V,VII, X, XIV, gelatina, elastina, fibronectina.
Estromelisinas
MMP-3 MMP-10 MMP-11
Colagénio III, IV, IX, X, gelatina, elastina, lamilina, agrecano, perlecano. Colagénio III, IV e V, gelatina, caseína, elastina, fibronectina, agrecano. Inibidor de protéase α-1
Matrilisinas MMP-7
MMP-26
Colagénio IV e X, gelatina, caseína, elastina, transferrina, agrecano Colagénio IV fibronectina, fibrinogénio, gelatina.
MT- MMPs MMP-14 MMP-15 MMP-16 MMP-17 MMP-24 MMP-25
Colagénio I,II e III gelatina, elastina, fibronectina, vitronectina. ProMMP-2, gelatina fibronectina, tenascina, nidogénio, lamelina. ProMMP-2.
ProMMP-2, gelatina.
ProMMP-2, ProMMP-9 e gelatina
Colagénio IV, gelatina, fibronectina e fibrina.
Novas MMPs
MMP-19 MMP-20 MMP-22 MMP-28
Colagénio IV, gelatina, lamelina, nidogénio, tenascina, fibronectina. Amelogenina.
Gelatina e caseína Caseína
As MMPs têm um domínio estrutural semelhante. Na maior parte dos casos são constituídas pelo domínio pro-peptídeo, domínio catalítico e domínio tipo hemopexina C-terminal (Yu e Han, 2006).
As MMPs são produzidas por diversos tipos de células, incluindo linfócitos T e B, fibroblastos, macrófagos, neutrófilos e algumas células epiteliais (Maugeri et al., 2005).
Em condições fisiológicas normais, a atividade das MMPs é regulada através de 3 processos distintos: ativação do percursor zimogénio, regulação dos níveis de transcrição e inibição endógena, através de inibidores de metaloproteinases de matriz. É discutível qual destes processos será mais importante a nível da regulação e qual o impacto que cada um tem na ativação das metaloproteinases. Pensa-se que a regulação transcricional e inibição endógena sejam os processos com maior impacto na regulação das MMPs (Visse e Nagasse, 2003).
São várias as enzimas proteolíticas que degradam a matriz óssea, existindo duas categorias principais de protéases que atuam sobre a matriz óssea: as protéases de cisteína e as metaloproteinases de matriz. O efeito das meteloproteinases está associado ao fornecimento adequado de estrogénios no microambiente ósseo. Caso este fornecimento seja alterado é possível que ocorra a desregulação dos mecanismos de turnover ósseo que vai originar o aparecimento de patologias (Ortega et al., 2003).
As MMPs são essenciais para a iniciação do processo de reabsorção osteoclástica removendo o colagénio da superfície do osso facilitando a sua desmineralização (Ortega et al., 2003).
As colagenases são enzimas que permitem a quebra das ligações peptídicas no colagénio, que se encontra em grandes quantidades na matriz extracelular. As estromelisinas embora exibam uma ampla capacidade para clivar as proteínas de matriz extracelular revelam-se incapazes de clivar os colagénios triplo-helicoidais (Lim e Kim, 2007).
As gelatinases permitem que os organismos possam hidrolisar gelatina em sub- compostos (polipéptidos, péptidos, e aminoácidos) de modo a poderem atravessar a membrana celular e serem utilizados pelo organismo (Hujanen, 2005).
A importância das metaloproteinases de matriz na osteogénese tem sido descrita por vários investigadores, especialmente a MMP-2 e MMP-9. A MMP-2 (72 kDa) e MMP-9 (92 kDa) são designadas respectivamente de gelatinase A e B. Estas têm uma ampla especificidade de substrato, dos quais se destacam a gelatina e vários tipos de
colagénio, entre os quais o colagénio do tipo IV, um dos principais componentes da membrana basal (Murphy et al., 2002). Estes dados levam a acreditar que as MMPs são normalmente necessárias ao desenvolvimento e remodelação do tecido ósseo (Krane e Inada, 2008).
A MMP-2, na sua forma ativa (62 kDa) é uma das MMPs mais importantes na preservação da massa óssea. Esta é altamente expressa no desenvolvimento das células ósseas, em especial nos osteoclastos. Além disso, o potencial da MMP-2 é enfatizado pelas descobertas de que é capaz de clivar colagénios fibrilares nativos que potencializam pro-MMP-9. Este facto aponta para que tenham um papel fundamental na degradação da matriz óssea, contribuindo para o normal metabolismo ósseo (Krane e Inada, 2008). A MMP-2 é a mais amplamente distribuída, estando associada a células do tecido conjuntivo, incluindo fibroblastos e osteoblastos. A sua indução difere fundamentalmente das outras MMPs devido a elementos promotores de genes distintos, que lhe conferem características de expressão constitutiva, indicando provavelmente um papel na dissolução de colagénios danificados ou desnaturados (Mansell et al., 1997).
O papel das mesmas no metabolismo ósseo pode ser observado através do tratamento de cobaias com um inibidor de MMP de largo espectro.Verificou-se que animais MMP-2 knockout apesar de se desenvolverem sem anomalias aparentes, apresentavam ausência de enzimas activas relacionadas a forma autossómica recessiva de osteólise multicêntrica, um distúrbio genético raro que causa a destruição e reabsorção do osso. Mutações no gene MMP2 estão associadas à síndrome de Torg- Winchester, doença autossómica recessiva caracterizada por uma osteólise generalizada, osteoporose grave e artropatia progressiva (Krane e Inada, 2008).
Segundo Nyman et al. (2011) os murganhos MMP-2 knockout registam uma menor DMO do que os ossos dos murganhos do tipo selvagem, mas aparentemente não apresentavavam diferenças no seu comprimento, sugerindo MMP-2 tem uma influência na composição das propriedades biomecânicas do osso.
A MMP-9 é considerada uma das principais protéases responsáveis pela degradação da matriz óssea. Os seus elevados níveis de expressão no tecido ósseo, especialmente nos osteoclastos levam-nos a acreditar no seu papel fundamental para a remodelação e regeneração óssea (Ortega et al., 2003). Os animais sem o gene MMP-9 apresentam manifestações fenotípicas muito pronunciadas, exibindo cartilagem substancialmente hipertrofiada, ossificação deficiente e um atraso na formação da medula óssea. As cobaias MMP-9 knockout revelam também uma diminuição da
formação do osso trabécular e do recrutamento dos osteoclastos (Ortega et al., 2003). Segundo Nyman et al. (2011) os ossos longos de murganhos MMP-9 knockout foram 10% mais pequenos do que os ossos dos ratos do tipo selvagem, sugerindo que esta MMP, tem uma influência estrutural sobre as propriedades biomecânicas dos ossos.
Apesar de ainda ser mal compreendido o papel destas MMPs na formação e reabsorção óssea sabe-se que as gelatinases podem influenciar a arquitectura óssea e as propriedades biomecânicas do osso. Este facto baseia-se nas capacidade da MMP-2 e MMP-9 em processar vários tipo de colagénio, que são críticos para a capacidade do tecido ósseo dissipar energia (Krane e Inada, 2008).
Sabe-se também que a MMP-2 e MMP-9 têm a capacidade de regular a biodisponibilidade e bioatividade do TGF-β através do processamento das proteínas que o tranportam. O seu papel no turnover da matriz óssea e na ativação dos fatores de crescimento, constituem um fator de peso para realçar o papel das gelatinases na microarquitectura óssea (Nyman et al., 2011).
Marcadores Inflamatórios
Nos processos de remodelação óssea induzidos por inflamação, a atividade dos osteoblastos e osteoclastos é influenciada pela sinalização proveniente das células imunitárias mas também de hormonas sistémicas incluindo os estrogénios, pois existem recetores de estrogénios nas células imunitárias (Lerner, 2006 b; Cochran, 2008).
As citocinas são moléculas que influenciam a ativação, crescimento e diferenciação de células. Eles são mediadores que regulam a resposta inflamatória, desempenhando um papel crucial. Sabe-se que várias citocinas bem como outros fatores inflamatórios são capazes de influenciar a reabsorção óssea, induzindo a produção de osteoclastos e a reabsorção óssea (tabela 3) (Cochran, 2008).
Tabela 3: Lista de citocinas pró-inflamatórias envolvidas no metabolismo ósseo.
Citocinas pró-inflamatórias do metabolismo ósseo
Interleucina-1 (IL-1) Interleucina-6 (IL-6) Interleucina-11 (IL-11) Interleucina-17 (IL-17)
Fator de Necrose de Tumor (TNFα) Interferão β (IFNβ)
Proteína C Reativa (PCR)
IL-6
A interleucina-6 atua como citocina pró-inflamatória secundária e anti- inflamatória. Esta é codificada pelo gene IL-6, localizado no braço curto do cromossoma 7. As citocinas do tipo IL-6, também conhecidas por glicoproteína 130 (gp 130), são constituídas por quatro longas α-hélices (Heinrich et al., 2003).
A IL-6 é secretada pelas células T e macrófagos para estimular a resposta imunitária atuando simultaneamente como uma citocina anti-inflamatória e pró- inflamatória, consoante a atividade biológica. Esta citocina é reconhecida como um potente fator da reabsorção óssea, atuando através da estimulação dos osteoclastos no contexto da inflamação crónica e de deficiência em estrogénios. Os estrogénios têm a capacidade de inibir o efeito da IL-6 em células de linhagem osteoclástica, impedindo a perda óssea. Deste modo, verifica-se que está intimamente ligada com as doenças ósseas (Renqing, 2012).
Estudos moleculares indicam que amostras de ossos de fêmeas em pós- menopausicas com osteoporose expressam mais mRNA de IL-6 do que em pós- menopausa com DMO normal. Para além desse facto verifica-se que a produção de IL-6 pelas células sanguíneas aumenta significativamente no tratamento da osteoporose (Renqing, 2012). Estudos experimentais sugerem também que animais com sobreexpressão de IL-6, apresentam um grave comprometimento da microarquitectura óssea cortical e trabécular, consequência da diminuição da osteoblastogénese e aumento
da osteoclastogénese devido a sua ação sobre moléculas sinalizadoras como o RANKL, que, estimula a formação dos osteoclastos (Renqing, 2012).
PCR
A proteína C reativa é uma proteína plasmática de fase aguda produzida no fígado. Foi descoberta por Tillett e Francis em 1930, recebendo a designação de PCR porque foi identificado pela primeira vez no soro de pacientes com inflamação aguda que reagiam com o polissacarídeo C de pneumococos. Inicialmente pensou-se que a PCR podia ser uma secreção patogénica pois os seus níveis encontravam-se elevados em indivíduos com várias doenças, incluindo cancro. Esta hipótese foi mais tarde descartada quando associaram a elevação dos seus níveis a resposta inflamatória (Pepys et al.,2003).
A PCR é codificada pelo gene PCR que está localizado no braço longo do cromossoma 1. É contituída por 224 resíduos de aminoácidos, com uma massa molecular de aproximadamente 25 kDa. Esta proteína é pentamérica com forma de disco e pertence a uma família de proteínas designada de pentraxinas (Murray et al., 2012).
A proteína C reativa possui várias funções associadas à defesa do hospedeiro, nomeadamente: promover a aglutinação, fagocitose de bactérias e fixação de complemento (Pepys e Hirschfield, 2003).
Normalmente a sua concentração é muito baixa em indivíduos saudáveis, porém na presença de estímulos inflamatórios pode ter um aumento significativo. É portanto um indicador extremamente sensível da inflamação (Pablo et al., 2012). O valor da PCR pode subir até 50.000 vezes em caso de inflamação. Obtendo-se um pico máximo por volta das 48 horas após o inicio da resposta. O seu tempo de semivida é constante, portanto, o seu nível é determinado principalmente pela taxa de produção (Pepys Hirschfield, 2003).
Estes aumentos séricos acentuados podem ocorrer não apenas na presença de inflamação mas também infecção, traumatismo e necrose dos tecidos. Como há um grande número de condições diferentes nas quais esta pode aumentar normalmente não é útil no diagnóstico de uma patologia específica. No entanto um elevado nível de PCR pode fornecer um importante suporte para a presença de uma doença inflamatória como artrite reumatóide e até osteoporose. Medir e mapear valores de PCR poderá então ser
também útil para determinar a evolução da doença ou a eficácia dos tratamentos (Murray et al., 2012).
Existem algumas limitações na utilidade clínica da maioria dos marcadores de metabolismo ósseo conhecidos, daí a necessidade da investigação continua no sentido de explorar novas maneiras de melhorar a sua aplicação clínica e até mesmo de encontrar novos marcadores ainda mais fiáveis, que nos permitam estabelecer uma correlação clara entre a sua concentração sérica e o nível de dano ocorrido devido as doenças do metabolismo ósseo.