Os animais utilizados neste modelo foram ratos Wistar fêmeas, pois são de aquisição pouco dispendiosa, fáceis de se acomodar, alimentar e manipular, quando comparados com animais de porte superior (Oheim et al., 2012). Embora o rato seja uma das espécies mais utilizadas para o modelo OVX, existem outros animais de pequeno porte que também podem ser utilizadas como o murganho e cobaios. Reinwald e Burr (2011) utilizaram murganhos e Guofeng et al. (2006) utilizou cobaio nos seus estudos em modelo OVX. A utilização de espécies de porte superior como coelhos, ovelhas, cães e alguns primatas, requerem condições de acomodação diferentes e os seus custos de aquisição, alimentação e tratamento são muito superiores, no entanto são normalmente imprescindíveis em teste pré-clínicos de fármacos para regeneração óssea uma vez que é aceite na comunidade científica que apenas as espécies de porte superior possuem remodelação óssea Haversiana (Lelovas et al., 2008; Oheim et al., 2012).
Existem várias estirpes de ratos disponíveis no mercado, no entanto a maioria dos autores defende a utilização de estirpes outbreed para efetuar os estudos em osteopenia/osteoporose. Os animais outbreed representam melhor a variabilidade natural que ocorre nas espécies, sendo mais representativas das condições a simular. Os animais da estirpe Wistar e Sprague-dawley (SD) são outbreed, sendo por isso as estirpes mais populares nos estudos osteometabolicos (Löscher et al., 1999; Turner, 2001).
A utilização de modelos animais no estudo das alterações osteometabólicas é frequentemente utilizada por investigadores nesta área. Estes modelos pretendem retratar a deficiência de estrogénios que ocorre na mulher após a menopausa, para se avaliar o decaimento da densidade de massa óssea e os fatores que intervém na perda da mesma (Jee e Yao et al., 2001).
Existem vários modelos de indução de doenças do metabolismo ósseo utilizados com relativa frequência e com bons resultados. O modelo de imobilização é um modelo de indução de osteopenia/osteoporose que apresenta um padrão de perda de osso altamente previsível. No entanto deve ter-se em atenção que embora todos animais apresentem o mesmo padrão de perda de osso, respondem de forma ligeiramente diferente, apresentando quantidades de perda óssea distintas e em diferentes regiões do organismo. Hott et al. (2003) utilizou a
imobilização do membro posterior em ratos da estirpe SD com 9 semanas de idade, verificando a diminuição da ossificação nos mesmos.
O modelo SAM é um modelo extremamente interessante pois permite efetuar algumas deduções sobre os genes que possuem um maior impacto a nível osteometabólico. No entanto a aquisição dos animais geneticamente manipulados é muito dispendiosa e a idade da indução deste modelo não pode ser controlada (Jilka et al., 1996; Lü et al., 2009). Uma outra desvantagem e o facto destes animais geneticamente manipulados pertencerem a linhagens inbreed, não sendo totalmente representativos da variabilidade genética que ocorre na natureza (Löscher et al., 1999).
A indução de osteoporose por excesso de glucocorticoides é uma das causas mais comuns de osteoporose secundária, ocorrendo uma perda significativa de massa óssea sem nenhuma sintomatologia. A quantidade da perda está normalmente relacionada com a dose e a duração da exposição a este fármaco (Compston, 2010). No entanto em experimentação em rato, a utilização do modelo GIO tem revelado resultados inconsistentes. Alguns estudos foram incapazes de detetar a perda óssea em ratos adultos (Shen et al., 1997). No entanto outros encontraram correlação direta entre a administração deste fármaco com a perda de qualidade óssea (Nitta et al., 1999). Face as evidências recolhidas pensa-se que o modelo de GIO não será totalmente eficaz na replicação da perda de DMO observado em seres humanos adultos (Shen et al., 1997; Lelovas et al., 2008).
Os modelos animais que recorrem a gonadectomia (ORX e OVX) para indução de osteoporose possibilitam o controlo da idade em que a condição osteoporótica é mimetizada. Dependendo da idade da indução e da sua duração podemos ajustar o modelo às condições pretendidas e obter respostas mais ou menos expressivas do decrescimo da DMO.
Embora se pense que a osteopenia no sexo masculino seja multifatorial, estudos recentes indicam que a testosterona é um dos principais sinalizadores responsáveis pelo recrutamento dos osteoblastos e inibição da atividade dos osteoclastos (Fink et al., 2006; Tuck e Francis, 2009).
Juma et al. (2012) e Razzaque et al. (2012) utilizaram o modelo ORX para induzir a osteoporose em ratos da estirpe SD do sexo masculino. Este modelo também pode ser executado em outros animais de maior porte (Tabassi et al., 2009; Kumari et al., 2013).
O modelo OVX mimetiza com bastante fidelidade a carência de estrogénios ocorrida nas mulheres após a menopausa. Neste modelo a carência de estrogénios é conseguida através
da remoção cirúrgica dos ovários às fêmeas em idade reprodutiva para cessar a produção de estrogénios (Andrade et al., 2013).
Neste estudo utilizou-se a técnica OVX pois esta técnica é a que melhor representa a osteoporose adquirida pós-menopausa, sendo o único modelo aprovado para testes pré- clínicos segundo as diretrizes regulatórias da FDA e AEM, com a finalidade de se obter a posterior aprovação da entrada desses mesmos fármacos no mercado (Matthai et al., 2001; Turner, 2008).
Não existe uma concordância por parte dos investigadores sobre a melhor idade para se induzir o modelo OVX. A maioria divide-se entre a idade adulta e sénior dos animais para se proceder ao início do modelo. Segundo Jee e Yao (2001) um rato fêmea com 9 meses de idade é ideal para recomeçar a avaliação do tratamento, uma vez que nesta idade atingiu pico de massa ósseo e pode ser manipulado para simular resultados clínicos de osteoporose pós- menopáusica. Outros autores como Power et al. (2002) e Yoon et al. (2012) defendem que as idades mais jovens são igualmente boas para a indução do modelo, tendo efetuado a ovarietomia em ratos por volta dos 3 meses de idade.
No presente estudo resolvemos caracterizar a ovarietomia às 8 semanas de idade, sendo portanto considerado um modelo juvenil de indução de osteoporose. Este tipo de modelo juvenil praticamente não está caracterizado.
Os resultados obtidos em todos os testes utilizados durante este trabalho experimental vão de encontro aos resultados obtidos por autores que utilizaram animais de idades adultas e seniores para a realização de modelo OVX (Campbell et al., 2008, Zhu et al., 2008 Yoon et al., 2012 e Ma et al., 2013). Este facto comprova mais uma vez a validade do modelo utilizado.
Existem diversas discrepâncias entre investigadores sobre as alterações osteometabólicas nos animais carenciados de estrogénios ao longo do tempo experimental. No presente estudo efetuou-se a monotorização dos efeitos metabólicos resultantes da osteopenia induzida pela modelo OVX em 2 intervalos de tempo distintos (3 e 6 meses após cirurgia). Outros autores preferiram prolongar este intervalo de estudo na expectativa de encontrar os pontos mais representativos da curva de decaimento da DMO nos seus animais. Sims et al. (1996) avaliou os resultados em vários pontos durante o estudo, tendo recolhido amostras as 3,9,15,21 e 42 semanas. Power et al. (2002) avaliou a resposta do tecido ósseo à diminuição dos níveis de estrogénios durante 12 meses recolhendo as suas amostras apenas no final do ensaio. Por outro lado Campbell et al. (2008) e Zhu et al. (2008) avaliaram o metabolismo ósseo durante
apenas 6 semanas. Uma vez que os reultados apresentados por estes autores são semelhantes não é possível concluir qual o melhor intervalo temporal para se monitorizar a osteopenia induzida pelo modelo.
O número de animais a ser utilizado também é um fator a ponderar. Este estudo realizou- se com 32 animais (8 por grupo). Este número de animais revelou-se suficiente, uma vez que a taxa de mortalidade associada a este procedimento é relativamente baixa no nosso grupo de investigação.
Mvondo et al. (2011) e Zoth et al. (2012) utilizaram apenas 5 a 6 animais por grupo no seu estudo, por sua vez Iivonen et al. (2006) utilizou entre 10 a 11 animais por grupo e Campbell et al. (2008) 10 animais por grupo.
Após a remoção cirúrgica dos ovários os animais entraram num estado de osteopenia, contraindo mais tarde osteoporose. Este decréscimo da massa óssea deve-se ao facto da reabsorção óssea superar a formação óssea, verificando-se um decréscimo gradual da densidade de massa óssea ao longo do tempo experimental. Esta diminuição da DMO contribui para a validação e verificação do correto funcionamento do modelo animal. Este facto foi confirmado através dos valores registados através das várias técnicas utilizadas neste trabalho para inferir sobre a qualidade do osso, nomeadamente micro-CT, biomecânica, concentração de MMPs no soro entre outros biomarcadores do metabolismo ósseo. Todos os dados obtidos segundo estas técnicas foram coerentes evidenciando um decréscimo da mineralização e consequente perda de DMO.
Neste estudo verificou-se um aumento estatisticamente significativo (p<0,05) do peso corporal por parte dos animais OVX face aos controlos, este aumento de peso é explicado pela depleção da hormona estrogénio que altera o metabolismo do organismo. O facto dos animais OVX aumentarem de peso é também um fator indicativo da fiabilidade do modelo em mimetizar a carência da hormona sexual feminina estrogénio, indicando que a indução do modelo foi conseguida.
Vários autores descrevem estas alterações nos seus estudos. Tromp et al. (2006) verificaram aumentos de massa corporal semelhantes aos registados no presente estudo em ratos da estirpe Wistar. Rachon et al. (2008) verificou também estas flutuações de peso nos seus estudos em ratos SD. Hong et al. (2009) e Potter et al. (2012) obtiveram resultados coincidentes com os nossos, em murganhos da estirpe C57BL6.
Após a menopausa as fêmeas evidenciaram um declínio natural dos níveis metabólicos basais. Esta menor necessidade de alimento, associada a um maior apetite, leva ao aumento da
percentagem de gordura corporal (Roesch, 2006; Brown, 2008). Pensa-se que este aumento da gordura corporal está diretamente relacionado com os recetores de estrogénios uma vez que estudos efetuados em murganhos adultos knockout para o gene dos RE-α e RE-β mostram um aumento no tecido adiposo branco (Roesch, 2006). A proporção entre gordura corporal e massa muscular também se modifica, diminuindo a quantidade de massa muscular e aumentando a percentagem de gordura que constitui o corpo.
O aumento do peso corporal dos animais fruto da ovarietomia conduz a níveis aumentados de adipocitocinas como a leptina. Esta citocina é produzida principalmente pelos adipócitos e os seus níveis circulantes estão diretamente correlacionados com a massa de tecido adiposo branco. Quando a massa gorda diminui, os níveis plasmáticos de leptina diminuem simultaneamente, conduzindo ao aumento do apetite (Gualillo et al., 2007 e Simopoulou, 2007). Níveis aumentados de leptina atuam sobre o hipotálamo diminuindo a ingestão de alimentos e aumentando o consumo de energia. Recentemente foi descoberto que a leptina age como um regulador de crescimento induzindo os osteoblastos à proliferação óssea, síntese de colagéneo e mineralização óssea, deste modo aparentam ter um papel importante no desenvolvimento de patologias ósseas (Simopoulou et al., 2007 e Gualillo, 2007). Segundo Otero et al. (2006) a leptina está também envolvida no processo inflamatório, sendo o seu aumento responsável pela produção de citocinas pró-inflamatórias podendo por isso intervir em doenças como a osteoporose.
Em relação ao peso do útero verifica-se que os animais OVX possuem um valor muito inferior em comparação aos animais SHAM. Esta diminuição do peso uterino foi drasticamente significativa (p<0,05) e deve-se provavelmente à carência de estrogénios provocada após a remoção dos ovários. Roesch (2006), Mvondo et al. (2012) e Zhang et al. (2012) obtiveram os mesmos resultados utilizando também o modelo OVX em ratos Wistar. Esta dimuinuição de peso dos úteros comprova a carência de estrogénios nos animais e a validade do modelo OVX. Iivonen et al. (2006) e Pandey et al. (2013) obtiveram os mesmos resultados em murganho verificando uma correlação direta entre a carência de estrogénios e a diminuição do peso do útero dos animais OVX.
Neste estudo verificou-se uma diminuição do peso dos rins dos animais OVX em relação aos SHAM. A diminuição relativa verificada foi mais acentuada no rim esquerdo que no direito onde esta foi estatisticamente significativa (p <0,05). Esta diminuição do peso dos rins está provavelmente associada a lesões renais relacionadas com a carência de estrogénios. São vários os autores que defendem a correlação entre as lesões renais e carência de
estrogénios (Armando et al., 2002; Antus et al., 2003; Oestreicher et al., 2006; Yanes et al., 2008). Os estrogénios desempenham um papel de proteção do rim devido a sua ação sobre os componentes do sintema angiotensina-renina-aldosterona (RAS). Pensa-se que os estrogénios reduzam os níveis de recetores de angiotensina I (AT1-R) nos rins, atenuando a resposta da Angiotensina II, e que desta forma possa ocorrer insuficiencia renal consequente da sobrecarga (Rogers et al 2007; Yanes et al., 2008). Estas lesões renais podem ter sido também agravadas, devido ao facto dos animais terem sido ovarictomizados ainda numa idade juvenil, sendo expostos a esta sobrecarga renal ainda com apenas 8 semanas de idade.
Os marcadores séricos referem-se concretamente a substâncias presentes no soro do organismo, as quais têm a particularidade de aumentar ou diminuir a sua concentração, indicando uma alteração metabólica específica ao nível do metabolismo do organismo. Estes marcadores são normalmente avaliados com recurso a diversas técnicas como autoanalisadores, immunoblotting, zimografias, ELISA, Kits específicos entre outras técnicas.
Neste trabalho as análises dos valores séricos de albumina, proteína total, triglicéridos, creatina cinase e fosfatase alcalina foram medidos com recurso a um autoanalisador. Este aparelho que permite efetuar testes automatizados em amostras de soro ou plasma, permitindo aumentos significativos no número de amostras que poderiam ser processados, neutralizando os erros métodos a que o processo manual está sujeito.
A maioria dos autores recorre a utilização de aparelhos como autoanalisadores face aos métodos tradicionais para determinar a concentração sérica ou plasmática dos biomarcadores. Para além do recurso a estes equipamentos é também possível recorrer-se a utilização de Kits otimizados para a medição destes parâmetros bioquímicos. As medições das concentrações dos indicadores séricos utilizados no nosso estudo foram todas efetuadas com recurso ao autoanalisador. Investigadores como Tanizawa et al, (2000); Shen et al. (2008) e Mvondo et al. (2011) recorreram a autoanalisadores para efetuarem a determinação dos valores séricos pretendidos. Por sua vez, Sabeno et al. (2004) e Yoon et al. (2012) recorreram a Kits específicos para determinarem os seus parâmetros bioquímicos.
As análises dos marcadores séricos de osteopontina, osteocalcina, interleucina-6 e proteína C reativa foram efetuadas através da técnica de immunoblotting. Esta é uma técnica de elevada especificidade apresentando baixo níveis de sinal ruidoso aquando da quantificação da intensidade de volume da proteína em questão. No entanto esta técnica apresenta como desvantagem o facto de ser necessário fazer uma transferência para a membrana de nitrocelulose, perdendo-se por vezes proteína nesta transferência. Proteínas de
peso molecular inferior a 15 kDa são extremamente difíceis de transferir horizontalmente para a membrana. Como alternativa a esta técnica poderão ser utilizadas outras técnicas como Slotblot, ELISA (Ensaio Imunoenzimático Ligado a Enzima) e RIA (Ensaio Rádio- Imunitário). Hertrampf et al. (2009) utilizou um Kit de ELISA, para avaliar os níveis séricos dos seus marcadores ósseos, por outro lado Zhao et al. (2006) utilizou a técnica RIA para determinar a concentração dos seus marcadores de turnover ósseo.
A técnica de zimografia foi utilizada para dosear as MMPs no soro. Esta é uma técnica de electroforese que permite detetar a atividade de uma determinada enzima diretamente no gel onde se fez a separação eletroforética. Esta técnica permite a adição dos substratos sobre os quais a enzima em estudo atua. O substrato pode ser adicionado no próprio gel ou no tampão de incubação (Wilkesman e Kurz 2009). A atividade enzimática e a sua classificação frente a inibidores enzimáticos podem ser determinadas acrescentando os inibidores isoladamente ou em conjunto nos tampões de incubação dos géis em análise. Existem vários autores que recorrem a esta técnica para verificarem a presença de MMPs em amostras de sangue, urina ou extrato lacrimal (Maugeri et al., 2005; Caseiro et al., 2012). Existem no entanto outras técnicas que se podem utilizar como o ELISA, Immunoblotting e alguns Kits apropriados (Yi e Lin, 2007; Belido et al., 2010)
O nosso ensaio no que diz respeito a biomarcadores foi efetuado apenas com recursos ao soro dos animais. Poder-se-ia recorrer a outros fluidos, bem com outros tecidos para se fazer a avaliação da concentração dos mesmos, uma vez que grande parte dos biomarcadores se encontram amplamente difundidos pelo organismo em concentrações diferentes. Utilizou- se apenas soro porque um dos principais objetivos deste estudo seria conseguir relacionar a concentração de biomarcadores séricos e a qualidade do osso, estabelecendo marcadores de referência que pudessem ser utilizados em pacientes humanos, sem haver necessidade de os submeter a radiações e a exames invasivos.
A albumina é a proteína produzida no fígado mais abundante no plasma sanguíneo. As albuminas séricas são importantes na regulação do volume de sangue, mantendo a pressão oncótica no sangue. Esta também serve de transportadora para moléculas de baixa solubilidade em água isolando natureza hidrofóbica de moléculas incluindo hormonas lipossolúveis, sais biliares, bilirrubina não conjugada, ácidos gordos, cálcio, transferrina, e alguns fármacos (Farrugia, 2010).
Neste estudo não se observaram alterações estatisticamente significativas na concentração de albumina no soro entre os animais OVX e SHAM. No entanto existe uma
clara tendência que nos revela uma ligeira diminuição da concentração de albuminas dos animais ovarietomizados face aos animais controlo durante todo o tempo experimental. Estes resultados estão de acordo com vários autores que efetuaram estudos utilizando esta proteína como marcador sérico. Vários investigadores como Sims et al. (1996), Tanizawa et al. (2000) e Ulase Cay (2011) obtiveram resultados semelhantes, verificando um ligeiro decréscimo dos valores séricos de albuminas em ratos OVX das estirpes Wistar e SD.
A medição da proteína total é um teste bioquímico utilizado para medir a quantidade total de proteína no plasma sanguíneo ou no soro. Neste estudo, observou-se uma diminuição dos valores de proteína total aos 3 e a 6 meses nos animais OVX. Aos 3 meses de ovarietomia verificou-se um decréscimo estatisticamente significativo (p<0,05). Vários autores como Fortepiani et al. (2002) e Hassam et al. (2012) verificaram também uma diminuição de proteína total nos animais OVX, existindo outros que não verificaram este decréscimo de proteína total no seu modelo OVX (Oestreicher et al., 2006). Concentrações de PT inferiores ao intervalo de referência geralmente refletem situações patológicas como doenças hepáticas ou situações de lesão renal e consequente proteinúria (Yanes et al., 2008). No caso do presente estudo, pensa-se que esta diminuição do nível de proteína total nos animais OVX esteja relacionada com lesões renais e proteinúria, uma vez que se verificou uma diminuição significativa do peso relativo dos rins dos animais OVX, sobretudo na resposta a 3 meses.
Os triglicéridos são ésteres derivados do glicerol e ácidos gordos. Estes são lípidos sanguíneos produzidos no fígado que permitem a transferência bidirecional de gordura adiposa e de glicose no sangue.A variação sérica dos triglicéridos não revelou diferenças significativas entre os animais SHAM e OVX, verificando-se um decréscimo apreciável dos triglicéridos nos animais ovarietomizados na resposta a 3 meses, que desaparece nos animais com 6 meses de osteoporose. Autores como Hidaka et al. (2004) corroboram os nossos resultados, uma vez que reportam níveis mais baixos de triglicéridos nos ratos OVX. Hidaka et al. (2004) verifica-se que por volta dos 4 meses de ovarictomia os ratos da estirpe SD apresentavam um decréscimo do valor de TG. Também Sims et al. (1996) verificou um ligeiro decréscimo do valor sérico dos triglicéridos nos animais OVX da estirpe SD. Por outro lado, Mvondo et al. (2011); Zych et al. (2009) e Ma et al. (2013) verificaram subidas ainda que às vezes ligeiras dos valores dos triglicéridos em ratos Wistar ovarietomizados.
A creatina cinase é uma enzima expressa em diversos tecidos, que catalisa a conversão da creatina, consumindo adenosina trifosfato (ATP) para criar fosfocreatina (PCr) e adenosina difosfato (ADP). Esta reação enzimática é de carácter reversível. A CK tem especial
importância em tecidos que consomem rapidamente ATP, como o músculo-esquelético, músculo liso entre outros (Bong et al., 2008).
Clinicamente, esta enzima é utilizada como um biomarcador sérico do enfarte do miocárdio, distrofia muscular e isuficiencia renal aguda (Kamisha et al., 2013).
As variações no parâmetro sérico creatina cinase não foram estatisticamente significativas. Verifica-se uma diminuição clara na concentração desta enzima na resposta a 3 meses por parte dos animais OVX, seguida de uma inversão de tendência aos 6 meses. Esta instabilidade da CK a nível dos animais SHAM podem ser explicadas através da elevada sensibilidade desta enzima. Fatores como a hemólise sanguínea são suficientes para alterar drasticamente o valor desta enzima. A idade também é um fator a ter em conta neste parâmetro sérico, uma vez que as concentrações desta enzima no organismo tendem a diminuir com a idade. Autores como Rowach et al. (2011) e Sotiriordou et al. (2003) verificaram uma diminuição do valor da CK nos seus estudos, enquanto Shen et al. (2008)