Biomarcadores moleculares RRIE-DSPP?

Desde que Evans e colaboradores demonstraram a presença de certas proteínas no fluido crevicular gengival de pacientes submetidos a tratamento ortodôntico, mais especificamente a proteína da matriz dentinária (DMP - 1) e a Sialoproteína dentinária (DSP), o estudo destas proteínas aprofundou-se de maneira marcante, e pesquisas correlacionando a sua presença às reabsorções radiculares aumentou de maneira apreciável (EVANS et al., 2000).

Estas proteínas não são rotineiramente liberadas para dentro do espaço do ligamento periodontal, a não ser que haja a presença de uma ativa reabsorção radicular externa (BALDUCCI et al., 2007), pois fazem parte do tecido dentário, mais especificamente da dentina.

A perda da estrutura radicular geralmente é realizada de uma maneira seqüencial, com a perda do cemento dentário antecedendo a dissolução da dentina, porém os produtos da degradação do cemento no fluido crevicular gengival (CGF) foram detectados em ambos os grupos controle e grupos de tratamento, o que de certa forma os desqualificam como marcadores para a RRIE, durante a movimentação ortodôntica, o cemento é reabsorvido e subsequentemente reparado, então as proteínas do cemento não podem ser um indicativo da perda permanente da estrutura radicular (MASH et al., 2004; LIU et. al., 2000; OWMAN-MOLL et al., 1995).

Embora pequenas áreas de reabsorção dentinária tenham sido demonstradas que sofrem reparo; áreas maiores e áreas apicais não sofrem reparo, tornando a perda da dentina uma parte significativa da perda da estrutura radicular (MASH et al., 2004).

Outro trabalho detectou a fosfoproteína dentinária (DPP) no CGF de pacientes com vários graus de reabsorção radicular utilizando a análise por Western Blot, e embora este método não provenha informações quantitativas, foi sugerido que a DPP pode ser útil como marcador da RRIE (MASH et al., 2004; SRINIVASAN et al., 1998). A procura por biomarcadores da RRIE foi intensificada pela descoberta de proteínas específicas do tecido dentinário (Fosfoproteína dentinária-DPP e Sialoproteína

dentinária DSP), que apareceram como subprodutos da reabsorção radicular no fluido crevicular gengival, e foram analisados por ensaios imunoenzimáticos (ELISA), por James Mash (DPP), e posteriormente confirmados (Fofoproteína Dentinária DPP e Sialoproteína dentinária DSP) por Laura Balducci e colaboradores através de eletroforese unidimensional (SDS-PAGE), Western blot, ELISA, e por Shalene e colaboradores (sialoproteína dentinária - DSP) também por Western blot e ELISA (MASH et al.,2004; BALDUCCI et al.,2007; SHALENE et al., 2008).

Laura Balducci identificou e quantificou as proteínas da matriz extracelular associadas com a mineralização da dentina: a proteína 1 matriz dentinária (DMP1), a fosfoproteína dentinária (DPP), e a sialoproteína dentinária (DSP) no fluido crevicular gengival de indivíduos que estavam em tratamento ortodôntico (BALDUCCI et al.,2007).

A dentina é continuamente depositada durante a vida como dentina secundária, somente na superfície pulpar, estas proteínas não são rotineiramente liberadas dentro ou em volta deste espaço (periodontal) como dentina, e pode não existir um processo de remodelação como existente no tecido ósseo. Somente na presença de reabsorção radicular externa é que estas proteínas podem estar livres no espaço do ligamento periodontal (BALDUCCI et al., 2007).

A DMP-1, uma proteína não colágena, identificada na matriz mineral da dentina e do osso, foi encontrada em grandes quantidades no fluido crevicular gengival durante o processo de reabsorção, e isto pode ser atribuído à presença desta proteína que é removida do osso e da dentina durante a RRIE. Através de SDS - PAGE, Laura Balducci comprovou que a concentração total de proteínas do grupo com RRIE foi maior do que do grupo controle, devido à degradação das proteínas da matriz durante a RRIE (proteínas: 77, 66, 55, 50, 26 kDa (BALDUCCI et al., 2007).

Na análise de Western Blot, o tamanho das bandas foi igual para os dois grupos, mas mais intenso para o grupo com RRIE (com anticorpo DMP1: duas bandas, sendo uma de 55 kDa e outra de 66 kDa; anticorpo DPP: uma banda entre 55-60 kDa e anticorpo DSP: duas bandas entre 50 e 70 kDa) (BALDUCCI et al., 2007). A presença de apenas uma banda no anticorpo DPP, pode ser devido a sua intensa carga negativa, que talvez a total transferência para membrana do Western Blot.

No ensaio imunoenzimático (ELISA) ocorreu uma distribuição de valores de concentrações normais (DMP-1, DPP, DSP) dentro de todos os grupos, porém o anticorpo DMP-1 com ELISA mostrou altas concentrações do grupo com RRIE que no

grupo controle, o que não ocorreu entre os grupos com RRIE leve e severa (BALDUCCI et al., 2007).

Embora haja uma diferença estatisticamente significativa entre o grupo controle e o grupo de estudo (RRIE), o que não ocorreu numa pesquisa conduzida pelo grupo de Liu, visto que utilizaram à análise de Western Blot, DMP-1 não é específica para a dentina, e a sua presença não é apenas devido ao processo de RRIE, mas também devido ao aumento da remodelação óssea durante a movimentação dentária ortodôntica (LIU et al., 2000). A DMP-1 não é um bom marcador para a reabsorção radicular, desde que não é possível distinguir entre normalidade e atividade patológica (BALDUCCI et al., 2007).

As concentrações de DPP e DSP foram maiores no grupo com RRIE severa, seguido do grupo com RRIE leve e em menor concentração no grupo controle (BALDUCCI et al., 2007). A presença de pequenas quantidades de proteína DPP e DSP no grupo controle pode ser devido à utilização de anticorpos policlonais que têm reatividade a proteínas com epítopos similares, e talvez, a presença de pequenas quantidades de DPP no grupo controle possa ser sugestivo de pequenas mudanças estruturais, devido à reabsorção fisiológica da raiz dentária, com os odontoclastos e os odontoblastos tendo uma função similar aos osteoclastos e osteoblastos na reabsorção óssea, remodelando e mantendo a superfície radicular (BALDUCCI et al., 2007; WEHRBEIN et al., 1995). Por esse motivo, o autor sugere que devido às concentrações encontradas nas RRIE severas e brandas serem estatisticamente diferentes, e inclusive com relação ao grupo controle, a DPP e a DSP podem ser marcadores moleculares disponíveis para a detecção precoce e o monitoramento dinâmico da RRIE antes do aparecimento nas radiografias de controle, e testes de diagnósticos não invasivos podem ser desenvolvidos baseados nestes mesmos marcadores moleculares (BALDUCCI et al., 2007).

As vantagens segundo James Mash, do método de detecção dos produtos da RRIE através do fluido crevicular gengival são as seguintes:

(1) sensibilidade (2) não invasivo

(3) não há exposição à radiação

(4) informa o estágio da atividade reabsortiva e a sua severidade (5) possibilita a identificação de indivíduos quanto ao risco da doença (6) reduz o tempo entre a consulta clínica e o diagnóstico clínico usual

(7) prediz o subseqüente curso clínico e prognóstico da doença (8) permite implementar alterações na terapia

(9) verifica a resposta atual a alterações no tratamento

James Mash também relacionou grupos tratados com RRIE e grupos controle através de imunoensaio enzimático (ELISA), e também encontrou pequenas quantidades de DPP no grupo controle, sugerindo ser devido a alta sensibilidade do método ELISA, mesmo que o anticorpo utilizado para este fim foi desenvolvido com DPP de ratos, homólogos ao dos seres humanos, pois, o anticorpo para a DPP humana é um desafio, devido à “dobradura“ da proteína e sua extensas modificações pós-traducionais que acomete a molécula, que é “blindada” por numerosos fosfatos e grupos de carboidratos (MASH et al., 2004). Estes grupos são comumente encontrados em outras proteínas e não são particularmente antigênicos, tornando muito difícil a produção de anticorpos contra a DPP humana. Também, a presença de DPP no grupo não tratado (controle) pode ser sugestiva de mudanças sutis no nível estrutural (MASH et al., 2004), A DPP é vista na mudança do estágio de deposição para o de maturação (CHANGE et al., 1996) e esta mudança pode refletir o turnover basal das proteínas da dentina na maturação da raiz, que é parecida a remodelação óssea quando imatura, e o tecido ósseo é recolocado com osso lamelar maduro (MASH et al., 2004), lembrando que o grupo controle é formado por indivíduos de 12 a 16 anos, tempo no qual o ápice dos incisivos maxilares são formados (rizogênese), como os odontoblastos e odontoclastos, trabalhando de maneira similar aos osteoblastos e osteoclastos, formando, reabsorvendo, remodelando e mantendo a dentina (MASH et al., 2004). Não é conhecido se, a remodelação da dentina ocorre, mas estudos têm mostrado que a dentina não é um tecido homogêneo, e que os componentes protéicos mudam com a idade e maturação da raiz (CLARKSON et al., 1998).

Em um estudo recente, Shalene e colaboradores, também encontraram DSP no grupo controle (em poucas amostras), mas realizando Western Blot, creditaram a mudanças estruturais e celulares complexas dentro do periodonto, envolvendo o “front” de mineralização quando a maturação da raiz toma forma, citando inclusive, que o turnover basal das proteínas da matriz dentinária ocorre durante o processo de estruturação da raiz, da dentição jovem para á adulta, e que a DSP pode ter sido liberadas das células pulpares, quando os ápices destes dentes ainda estavam abertos (CHANG et al., 1996; SHALENE et al., 2008). O autor ainda cita que há uma pesquisa sugerindo que a DSP pode não ser exclusivamente da dentina (QIN et al., 2002), DSP e

DPP são expresso de um único RNA mensageiro transcrito, e que este transcrito é derivado de uma grande proteína precursora chamada DSPP, que é tradicionalmente considerada ser específica da dentina. Quin e coleguas encontraram que o gene da DSPP foi expresso em células osteoblásticas, DSP foi detectado nos extratos dos ossos longos de ratos na relação de 1:400 em relação à dentina (QIN et al., 2002). Usando a técnica da reação em cadeia da polimerase de transcriptase reversa, e primers específicos para a porção 5’ DSP e para a seqüência γ’ DPP, DSPP mRNA foi detectado em células osteoblásticas - like e osteoblastos da calvária de ratos, entretanto, este gene foi expresso em um nível muito inferior nos osteoblastos que nos odontoblastos (dentina) (SHALENE et al., 2008; CHANG et al., 1996).

Isto pode indicar que diferentes mecanismos regulatórios governam a expressão da DSPP e que estão envolvidos no tecido ósseo e na dentina (SHALENE et al., 2008). A presença da DSP no osso, embora em pequenas quantidades, pode explicar a presença da DSP no grupo controle (SHALENE et al., 2008). Na análise por Western Blot, Shalene sugeriu a presença de marcadores moleculares (DSP) com massa molecular entre 16 a 54 kDa, similar, segundo a autora, a massa molecular de 55 kDa da DSP achada por Waddington et al., 1998 indicando que a DSP no GCF é um produto da RRIE, pois a DSP intacta, isolada de dentes decíduos com reabsorção fisiológica teve a sua massa molecular de 89kDa, também similar aos estudos efetuados por Quin e colaboradores (SHALENE et al., 2008; QUIN et al., 2002). A indicação destas proteínas (DPP e DSP) como marcadora molecular não é de todo consensual devido: a presença destas proteínas no grupo controle, (mesmo que em pequenas quantidades); a evidência de que estas proteínas não são exclusivas da dentina (são expressas nos tecidos ósseos) podendo estar presentes no fluido crevicular gengival devido ao processo fisiológico da remodelação óssea (que normalmente é elevada em pacientes submetidos ao tratamento ortodôntico), e não devido à reabsorção radicular (MASH et al., 2004; BALDUCCI et al., 2007; WEHRBEIN et al., 1995; SHALENE et al., 2008; QIN et al., 2002).

Além da dificuldade da interação de anticorpos específicos para a maioria destas proteínas, inclusive a DPP (a mais numerosa destas proteínas dentinárias) que é “blindada” por seus grupos fosfatos, dificultando o acesso a epítopos protéicos específicos para a mesma, devido a sua extensa “dobradura” e inúmeras modificações pós traducionais (MASH et al., 2004). Sendo que estes anticorpos (que são de difícil

fabricação, MASH et al., 2004) estão presentes na maioria dos ensaios que envolvam testes imunológicos.

Tendo em vista estudos que propõe que a remodelação da dentina ocorre e mostram que a dentina não é um tecido homogêneo e os seus componentes protéicos mudam com a idade e maturação da raiz, mesmo se considerando que não ocorram reparos significativos da dentina, tornando a perda da dentina uma parte significativa da perda da estrutura radicular (MASH et al., 2004; CLARKSON et al., 1998). Portanto, estas supostas proteínas podem estar presentes no fluido crevicular gengival na ausência da doença, ou mesmo não estar presente no CGF devido ao processo de envelhecimento tecidual.

Até o presente momento, não foram desenvolvidos “kits de diagnóstico” para a detecção da RRIE, que tenham como premissa a utilização destes supostos marcadores moleculares a nível clínico, e sua provável utilização, ficou apenas restritas ao campo especulativo dos artigos que envolvem a pesquisa básica.

Justificativa

A alta prevalência da reabsorção radicular inflamatória externa (RRIE) associada ao tratamento ortodôntico nos impõe a necessidade de integrar evidências científicas, respaldadas por pesquisas básicas, com a prática clínica ortodôntica do dia a dia, com vistas a minimizar as suas seqüelas nos indivíduos por ela acometidos e o seu impacto no custo benefício de um tratamento estético-funcional, geralmente de cunho elegível por parte do paciente. Sendo assim, o diagnóstico precoce desta alteração, não visto por exames radiográficos, pode contribuir para a adequação do tratamento individual, visando minimizar as iatrogenias decorrentes do processo ortodôntico. A proposta do presente trabalho é mapear proteínas diferencialmente expressas secretadas no fluido crevicular gengival, que possam ser utilizadas como marcadores para o diagnóstico precoce da RRIE.