Protocolo de focalização isoelétrica para proteínas do CGF extraídas em meio aquoso.

Na realização do sexto gel bidimensional, foi constatada que algo interferia na focalização da amostra, durante a realização da primeira dimensão, apesar da ausência de rastros ou outros “contaminantes”, e a aparência límpida dos géis unidimensionais, realizados anteriormente. O IPG Buffer, que nos protocolos de praxe, é adotado como sendo de 0,5 % ou 5,0 L para cada 1,0 ml de solução de hidratação foi aumentado experimentalmente.

Inicialmente foi realizada uma focalização sem a amostra, com uma strip controle, onde foi verificado que os padrões eletroforéticos foram atingidos. Então foi constatado que o problema residia na dificuldade de focalização da amostra do GCF. Posteriormente foi realizada mais uma nova focalização, com uma strip embebida em uma amostra e uma strip controle, mas dobrando-se a concentração do IPG Buffer, 1% ou 10 µL, onde foi aventada que houve uma demora significativa para a obtenção dos

Figura 11 - SDS-PAGE 12 % das proteínas extraídas do GCF 1: Marcador de

peso molecular; 2: proteínas extraídas de pacientes sem RRIE; 3: proteínas extraídas de pacientes com RRIE. Aproximadamente 50 g de proteínas totais foram aplicados em cada canaleta. O gel foi corado com Comassie - blue, mostrando as proteínas do fluido Crevicular Gengival.

18,4- 25- 35 - 45 - 66,2 - 116- kDa 1 2 3 90 -

padrões eletroforéticos de focalização, mas esta se consumou de forma apropriada, apesar do atraso em relação ao tempo obtido. Com vistas à tentativa de diminuição do tempo para a focalização, e constatar-se, se as duas amostras poderiam interferir na primeira dimensão, foi aumentada a concentração do IPG Buffer para 1,5% ou 15 L, e foi constatada uma diminuição do tempo de focalização, sem prejuízo na obtenção dos padrões eletroforéticos. Porém, mesmo com a diminuição do tempo de focalização no último experimento, ao qual foi utilizada três strips, havia a possibilidade que a focalização com seis strips (duas amostras em triplicata) aumentasse o tempo de focalização, e foi realizado um novo método de focalização, contrariando a metodologia de rotina, onde as strips foram deixadas durante á noite no tampão de hidratação, sem a adição do IPG Buffer. Com a adição de β0 μl de IPG Buffer e posteriormente, com a aplicação, através dos “cups loading”, que normalmente servem para a aplicação das amostras, de 1 ml da mesma solução inicial com β0 μl de IPG Buffer, foi atingido níveis máximos de saturação dos anfólitos, criando uma “overloading”, durante a focalização isoelétrica, e foi reparado que a mesma atingiu níveis similares à realizada anteriormente. Então, no sétimo gel bidimensional, realizado com duas amostras em triplicata, foi atingido o objetivo inicial: a realização dos mapas protéicos da reabsorção radicular externa.

Na análise 2-DE foram investigadas as mudanças nos perfis protéicos em resposta a reabsorção radicular externa, com alta resolução no padrão dos spots protéicos, no intervalo de pI entre 3 e 11 e massa molecular de 10 a 220 kDa, onde foram detectados (pela coloração da Comassie Briliant Blue G250) a média de 144 “spots” protéicos nos géis em triplicata com a reabsorção radicular externa, e 49 “spots” protéicos de média nos géis em triplicata sem a patologia (Figura 12).

Detectaram-se 13 spots protéicos constitutivos nos dois grupos presentes, tanto no grupo com a reabsorção radicular externa, quanto nos grupo sem a patologia, mas apenas 6 foram validados por ANOVA (<0,05) e foi encontrado 122 spots protéicos diferenciais entre as duas amostras (p< 0,005). As amostras foram submetidas às mesmas condições eletroforéticas, e realizadas análises quantitativas das amostras com e sem a reabsorção radicular externa, utilizando o software Platinum Image Master 2D platium 7.0 (G.E. HealthCare). Os spots protéicos constitutivos foram: os spots ID 2, ID 5, ID 6, ID 11,ID 12, ID 14, sendo que os spots que mais sofreram variação de volume porcentual em relação as amostras com e sem a reabsorção externa, foram os spots ID 5, ID 6, (Figura 13).

Figura 12 – Perfil bidimensional diferencial das proteínas extraídas do GCF. As eletroforeses bidimensionais foram realizadas em triplicata, os géis foram corados

com Commassie Blue, e as imagens analisadas com o software 2-D Platinum (G.E. Healthcare). Após superposição dos três géis de pacientes sem reabsorção externa (A), foram detectados 49spots. Já para a amostra dos pacientes com reabsorção externa (B) foram detectados 144spots.

10 - 20 - 30 - 50 - 60 - 100 - kDa 70 - pI 3 11 (A) 10 - 20 - 30 - 50 - 60 - 100 - kDa 70 - pI 3 11 (B)

Figura 13 - Spots protéicos constitutivos. “Zoom” da região entre 50 e 80 kDa e γ,0 à 6,5 pI onde pode-se observar proteínas encontradas tanto das amostras de pacientes sem RRIE (A), quanto nas amostras dos pacientes com RRIE (B). O “match” dos spots foi validado por ANOVA (p< 0,05).

(A)

O coeficiente de correlação entre as triplicatas de mostras do GCF de pacientes sem a RRIE foi de 0,99 e o coeficiente de correlação entre as triplicatas de pacientes com a RRIE foi de aproximadamente 0,67 (Figura 14). O coeficiente de correlação ideal de 1,0 representa todos os spots proteicos da amostra inseridos em uma reta, o que quase foi evidenciado nas amostras de pacientes sem a RRIE, mas não foi obtido no gráfico de pacientes com a RRIE, devido ao grande número de spots proteicos e principalmente por alguns spots proteicos se distanciarem da reta em relação à grande maioria dos spots protéicos constituintes da média obtida.

A maioria dos spots protéicos situou–se na faixa de pI de 4,0 a 8,0 , com poucos spots ID nestes extremos de pI, no grupo com Reabsorção radicular externa houve muitos spots protéicos com baixa massa molecular, entre 15 e 20 kDa (cerca de 15 spots), o que não ocorreu nas amostras sem patologia, que apresentavam uma maior concentração de spots protéicos de alta massa molecular (acima de 70 kDa).

Houve então, grande diferença relevante entre as amostras com e sem patologia, inclusive com relação aos spots protéicos constitutivos, onde foi constatada a presença de uma maior intensidade do spot ID 5, ID6 (maior porcentagem de volume) no grupo com patologia, em detrimento do grupo sem a reabsorção radicular inflamatória externa, em que o spot ID 5, ID 6 encontrava-se em menor intensidade (Figura 12).

Foi encontrada uma porcentagem de volume de 0,33% do spot A1(ID 5) em relação ao volume protéico total, no grupo sem a patologia, a porcentagem no grupo com patologia foi maior, em relação ao volume protéico total, perfazendo 1,58% (Figura15).

Na Figura 16 foi verificada a relação de volume percentual entre os diferentes spots protéicos constitutivos, sem a reabsorção radicular externa e com a patologia, e os seus respectivos Match ID.

Foi verificado um aumento significativo do spot ID 5 quando se instala a reabsorção radicular externa, assim como do spot ID 11, spot ID 6 e spot ID 2, ou seja: há uma variação dos spots constitutivos durante a instalação da reabsorção radicular externa, sobretudo com a expressão de novas proteínas diferenciais (não constitutivos) de menor massa molecular.

Apareceram 15 Spots protéicos que só foram visualizados nas amostras com patologia e tinham baixa massa molecular (entre 15 e 20 kDa): ID 27, ID 37, ID 41, ID42, ID 43, ID 44, ID45, ID 46, ID 47,ID 48, ID 49, ID 50, ID 51, ID 99, ID 104.

(A) (B)

Figura 14 - Gráficos de correlação de réplicas dos perfís bidimensionais de proteínas do GCF. No

eixo x e y, valores de volume dos spots protéicos do FCG de pacientes sem RRIE (A) e com RRIE (B). O coeficiente R2_{= 0,9981 representa o valor da linha de tendência para os spots.}

Figura 15 - Gráficos da porcentagem do volume do Spot A1. Observa-se que o spot

A1 teve sua expressão aumentada em 478% nas amostras protéicas de pacientes com RRIE (A) em relação à percentagem de volume total protéico da amostra sem RRIE (B).

(A) _(B) 0,33% 99,67% 1,58% 98,42% Com patologia

Figura 16 - Gráfico de porcentagem de volume nas amostras com e sem RRIE. Observa-se

que todos os spots têm sua síntese aumentada nas amostras com RRIE em relação ao teor protéico total da amostra sem RRIE, mas o maior aumento foi evidenciado nos spots 5 e 6. Os spots 5 e 6 correspondem a um maior volume das proteínas totais da amostra com RRIE.

0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1,4 1,6 1,8 2 5 6 11 14

% volume sem patologia %volume com patologia

(%

Vo

l)

VIII.I. Definição do protocolo para análise de proteínas do