Biopsia ecoguiada

A biopsia foi efetuada em apenas um dos animais cujos esfregaços sanguíneos apresentavam inclusões eosinofílicas intracitoplasmáticas compatíveis com a doença dos corpos de inclusão. Foram colhidas amostras de rim, fígado e pulmão que, posteriormente

foram conversadas em formol a 10% e enviadas para o Laboratório de Histologia e Anatomia Patológica da UTAD.

10.3.4. Eutanásia

A eutanásia dos 9 animais, entre 10 com resultado positivo no esfregaço sanguíneo, foi efetuada com administração intracardíaca de pentobarbital sódico (Eutasil® 200 mg/ml) na dose de 86 mg/kg.

10.3.5. Necropsia

Os cadavéres foram enviados em refrigeração, no próprio dia da eutanásia, para o Laboratório de Histologia e Anatomia Patológica da UTAD, onde foram sujeitos a necropsia completa para averiguar a existência de alterações macroscópicas e para recolha de amostras de rim, intestino, fígado, pâncreas e pulmão para exame histopatologico.

10.3.6. Histopatologia

Tanto os tecidos colhidos durante a necropsia como os tecidos colhidos por biopsia foram sujeitos a exame histopatologico no Laboratório de Histologia e Anatomia Patológica da UTAD. Os tecidos de alguns dos cadáveres foram congelados antes de fixados.

Para a fixaçao do material foi usado formol a 10% tamponado, sendo de seguida submerso em parafina. Foram obtidas secçoes de 2-3 µm e posteriormente coradas com Hematoxilina e Eosina (H-E).

10.3.5. Análise estatística

Os dados recolhidos foram tratados com recurso ao programa de software Microsoft Excel® 2010 da Windows.

11. RESULTADOS

11.1. Caracterização da amostra

De entre os 43 animais avaliados, a espécie mais frequente foi a Boa constrictor com 72,09% (31 animais), seguida da Python regius com 13,95% (6 animais) e da Python

reticulatus com 9,30% (4 animais). As espécies Morelia spilota (1 animal) e Python molurus

(1 animal) estiveram representadas ambas a 2,33%, como demonstra o gráfico 1. Nesta população, 16 dos animais (37%) eram juvenis e 27 eram adultos (63%) (Gráfico 2).

Como anteriormente referido, os animais foram avaliados independentemente de apresentarem ou não sinais clínicos compatíveis com a doença. Assim sendo, entre os 43 animais, apenas uma Boa constrictor apresentava anorexia e caquexia marcada.

Gráfico 2. Proporção dos grupos etários na população.

A média de pesos obtida foi de 3,32 kg, com peso mínimo de 0,085 kg e máximo de 15,6 kg. Por forma a melhor elucidar a distribuição dos pesos na população amostrada,foram constituídos 7 intervalos de valores. Esta informação está representada na tabela 3 e gráfico 3.

Tabela 3. Distribuição dos animais da população por intervalo de pesos. (Frequência absoluta)

Intervalo de peso (kg) Número de animais

0,08-1,64 19 1,64-3,19 8 3,19-4,74 5 4,74-6,29 4 7,84-9,39 1 9,39-10,95 5 14,05-15,60 1

Gráfico 3. Distribuição dos animais da população por intervalo de pesos. (Frequência relativa)

12.2. Esfregaços sanguíneos

Foram encontradas inclusoes intracitoplasmáticas eosionofilícas compatíveis com os corpos de inclusão da doença em estudo, em apenas 10 dos 43 animais (23%) da população inicial. Todos estes 10 animais eram da espécie Boa constrictor, 9 dos quais adultos e o último um juvenil (Tabela 4). As inclusões em questão eram visíveis em maior abundância em eritrocitos do que em leucócitos, mas pouco abundantes por campo (Fig.9).

Tabela 4. Resultado da pesquisa de corpos de inclusão nos esfregaços sanguíneos.

Positivos Espécie Adulto Juvenil Negativos Boa constrictor 9 1 21 Python regius 0 0 6 Python reticulatus 0 0 4 Morelia spilota 0 0 1 Python molurus 0 0 1

Figura 9. Esfregaços sanguíneos de Boa constrictor. Coloração Hemacolor®. Ampliação 1000x. A)

Inclusão eosinofílica intracitoplasmática num eritrócito (seta). B) Inclusão intracitoplasmática num linfócito (seta). Fotografias gentilmente cedidas pelo Zoo da Maia.

12.3. Necropsia

Apenas 9 dos 10 animais que apresentaram inclusões nos esfregaços sanguíneos foram sujeitos a necropsia. Apenas 2 desses 9 apresentavam alterações macroscópicas dignas de registo, sendo que um deles (animal 3) se apresentava com má condição corporal. O segundo (animal 2) apresentava alterações pulmonares compatíveis com pneumonia, degenerescência hepática e ainda um transudado translúcido livre na cavidade celómica (Fig.10).

Figura 10.Alterações macroscópicas. Boa constrictor. A) Pulmão com nódulos brancos de pequenas dimensoes, de distribuição multifocal compatíveis com pneumonia. B) Degenerescência hepática. Fígado de um rosa pálido e vasos congestionados. Fotografias gentilmente cedidas pela Prof. Doutora Isabel Pires.

A

B

12.4. Histopatologia

Histologicamente, tanto os 9 animais enviados para necropsia como o 10º sujeito a biopsia ecoguiada, apresentaram inclusoes eosinofilicas intracitoplasmáticas, de forma circular a oval, de tamanho variável, nas células de multiplos orgaos, compativeis com Doença dos Corpos de Inclusão (Fig.11). A maior parte dos corpos de inclusão foram encontrados no fígado (em todos os animais) e no rim (em 6 dos animais), seguidos do intestino e pâncreas (3 animais) e pulmão (1 animal) (Tabela 5 e Gráfico 4).

Figura 11. Imagens histopatológicas de Boa constrictor. Coloração H-E. A) Inclusões

intracitoplasmáticas (setas) no fígado. Ampliação 400x. B) Inclusões intracitoplasmáticas (setas) no rim. Ampliação 600x. C) Inclusões intracitoplasmáticas (setas) no pâncreas. Ampliação 600x. Imagens cedidas pelo Laboratório de Histologia e Anatomia Patológica da UTAD.

A B

Tabela 5. Deteção de inclusões em cada um dos animais, nos vários tecidos colhidos para exame

histopatológico. O “x” indica a presença de inclusões.

Fígado Intestino Pâncreas Pulmão Rim

Boa constrictor _{1 x x x x} Boa constrictor _{2 x x} Boa constrictor _{3 x x} Boa constrictor _{4 x x} Boa constrictor _{5 x} Boa constrictor _{6 x x} Boa constrictor _{7 x x x x} Boa constrictor _{8 x} N e c ro p s ia Boa constrictor _{9 x x x x}

Biopsia Boa constrictor 10 x

Gráfico 4.Proporção de amostras com presença de inclusões em cada orgão, relativamente ao total de amostras colhidas.

No animal 1, apesar da ausência de inclusões no pulmão, foi detetada a presença de pigmento. Juntamente com os corpos de inclusão nas células tubulares renais, o animal 4 apresentava nefrose pigmentar. No animal 10, sujeito a biopsia foi visível degenerescência hepatocitária.Os restantes animais 2, 3, 5, 6, 7, 8 e 9 não apresentaram outras alterações ao exame histopatológico.

13. DISCUSSÃO

A doença dos corpos de inclusão é provavelmente a doença vírica com maior destaque nos indivíduos das famílias Boidiae e Pythonidae em cativeiro e está associada a uma elevada taxa de morbilidade e mortalidade, apresentando-se mais severa para os segundos do que para os primeiros (Chang e Jacobson, 2010; Hetzel et al., 2013). Neste estudo, apesar de existirem boídios e pitons, apenas os individuos da espécie Boa

constrictor apresentaram resultados positivos.

Os principais sinais clínicos da doença são gastrointestinais, neurológicos e respiratórios, no entanto não são patognomónicos (Schumacher et al., 1994; Schumacher, 2006). Na espécie Boa constrictor é usual que a apresentação clínica se inicie com regurgitação seguida de anorexia e caquexia, esta última visível em um dos animais deste estudo (animal 3). Apesar de estarem bem descritos e documentados sinais neurológicos, tanto em boídios como em pitons, com maior incidência nestes últimos (Schumacher et al., 1994; Schumacher, 1996), nenhum dos animais do estudo apresentava estes sinais. Assim como também não foram detetados quaisquer sinais respiratórios. O facto de 9 das 10 Boa

constrictor de diagnóstico presumidamente positivo não apresentarem quaisquer sinais

clínicos vem de encontro à possibilidade documentada de infeções subclínicas nesta espécie, tornando estes animais portadores assintomáticos (Vanncraeynest et al., 2006; Chang e Jacobson 2010).

O diagnóstico antemortem recorre principalmente a biopsias de fígado e das tonsilas esofagicas, tecidos que presentam abudantes corpos de inclusão eosinofílicos intracitoplasmáticos (Schumacher, 2006; Chang e Jacobson, 2010; Hetzel et al., 2013). Neste estudo, o único animal sujeito a biopsia ecoguiada (animal 10) apresentou inclusões no fígado, tal como o descrito anteriormente, associadas a degenerescência vacuolar dos hepatócitos (Jacobson et al.,1980; Schumacher et al., 1994; Vanncraeynest et al., 2006; Chang e Jacobson, 2010). Neste animal só foi possivel fazer o exame histopatologico da amostra de fígado uma vez que as amostras de rim e pulmão colhidas e enviadas para o laboratório não possuiam as dimensões necessárias para o mesmo.

Por ser uma técnica menos invasiva e mais prática, nesta coleção de répteis foram utilizados os esfregaços sanguíneos como triagem inicial entre os animais posivitos e negativos, para pesquisa de inclusões em eritrócitos e leucocitos. No entanto, estes apresentam-se como um meio de diagnóstico de baixa sensibilidade (Chang e Jacobson 2010). Por este motivo, não podemos afirmar que os 10 animais que apresentaram corpos

de inclusão no esfregaço sanguíneo sejam os únicos infetados. A ausência de inclusões nos esfregaços dos restantes 33 animais não garante aunsência de infeção. Mesmo estando consciente da probabilidade de falsos-negativos, apenas aqueles primeiros 10 animais continuaram em estudo por ser a opção mais viável, no que diz respeito aos recursos disponibilizados para o desenvolvimento deste estudo.

O diagnóstico post-mortem, tal como no presente estudo, é baseado em alterações macroscópicas detetadas à necrópsia e no exame histopatologico. Na necropsia dos animais em estudo era visível caquexia (animal 3),degenerescência hepática (figado de um rosa pálido e de vasos congestionados) e pneumonia (animal 2), como relatado por Chang e Jacobson (2010) e Carlisle-Nowak (1998). No entanto, ao contrário do que indicam os mesmos autores,não foram encontradas evidências de fibrose pancreática,atrofia e fibrose esplénica, lesões nodulares no esófago e estômago ou estomatite ulcerativa.No animal com pneumonia foi ainda detetada ascite da cavidade celómica ,não diretamente associada à Doença dos corpos de inclusão, mas já anteriormente documentada por Carlisle-Nowak (1998) e possivelmente relacionada com hipertensão portal secundária a doença hepática, hipoproteinemia ou dano vascular por septicemia.

A histopatologia é considerada o diagnóstico final (Schumacher et al., 1994; Chang e Jacobson, 2010). Ao microscópio ótico os corpos de inclusão encontrados neste estudo correspondem aos descritos em casos anteriores, de localização intracitoplasmática, eosinofílicos em coloração com H-E, redondos e ovais, com diâmetro de 1-5 µm. Estas inclusões têm normalmente origem na acumulação intracitoplasmática de uma única proteína (68kD), já anteriormente associada à doença dos corpos de inclusão (Wozniak et

al., 2000). No entanto, sem o auxílio de microscopia eletrónica foi impossível caracterizar

tão detalhadamente os corpos de inclusão encontrados. Na espécie Boa constrictor, os corpos de inclusão encontram-se principalmente nos hepatócitos, nas células epiteliais dos tubulos renais e nos neurónios e células gliais do sistema nervoso central, bem como no pâncreas e nas células epiteliais do sistema gastrointestinal e respiratório (Schumacher et

al., 1994). Também neste estudo se observou maior prevalência de inclusões no fígado (em

todos os 10 animais) e no rim (em 6 dos 10 animais), em particular nos tubulos renais no animal 4. Outras inclusões foram visíveis também no pâncreas,intestino e pulmão. Frequentemente esta espécie apresenta necrose dos tubulos renais e degenerescência vacuolar dos hepatócitos, provavelmente associadas a elevada prevalência de inclusões nessas células (Schumacher et al., 1994). Tanto as pitons como os boídios podem apresentar meningoencefalite não supurativa com degenerescência neuronal, gliose e desmielinização. Apesar de as alteraçoes neurologicas serem mais frequentes em pitons, as inclusoes também surgem no tecido nervoso de boídios (Schumacher et al., 1994). No

entanto, não foi possível a colheita de qualquer porção do SNC aquando da necropsia e, consequentemente não foi realizado um exame histopatologico.

A fonte de infeção nesta coleção em particular é dificil de determinar. Aparentemente já num período anterior ao estudo se verificaram na coleção sinais compatíveis com a doença dos corpos de inclusão, podendo eventualmente ter origem em algum animal entregue ao Zoo no passado. Por sua vez, também a via de transimissão é quase impossível de definir. Pensa-se que o ácaro Ophionyssus natricis possa desempenhar o papel de vetor uma vez que a infestação pelo mesmo é comum em muitos animais com diagnóstico posivito para doença dos corpos de inclusão (Schumacher et al., 1994; Schumacher, 1996). No entanto, não foi averiguado o grau de infestação, embora se saiba da existência do ácaro num reduzido número de animais da coleção. Todos os animais adultos com diagnóstico presuntivo positivo neste estudo se encontravam juntos o que pode sugerir transmissão por via horizontal, por contacto direto. Já o único juvenil infetado encontrava-se separado de todos os adultos anteriormente referidos o que, apesar de fraco valor estatístico, poderá sugerir transmissão vertical da progenitora para as crias.

A etiologia desta doença permanece controversa, sendo que inicialmente se suspeitava da presença de um retrovírus nos animais infetados (Schumacher et al.,1994; Wozniak et al., 2000; Jacobson et al., 2001; Huder et al., 2002; Bodewes, et al., 2013) e, mais recentemente, se tenha sugerido o envolvimento de um arenavírus na infeção (Stenglein et al., 2012; Bodewes et al., 2013; Hetzel et al., 2013). Neste caso seria uma mais valia a realização de PCR para a confirmação do agente etiológico mas os recursos disponibilizados não o permitiram.

Tal como para outras doenças infeciosas nos répteis, ainda não existe tratamento específico para a Doença dos Corpos de Inclusão e, apesar de ser possível fazer terapia de suporte, é considerada fatal (Chang e Jacobson, 2010). Neste caso em particular parte da profilaxia já foi realizada, já que se optou pela eutanásia dos animais infetados e que os animais da espécie Boa constrictor, como possíveis portadores assintomáticos, se encontram separados das restantes espécies. Uma vez que o tratamento de suporte em animais infetados acarreta grandes despesas a longo prazo sugere-se que, de forma a prevenir futuros casos, se aposte numa quarentena mais rigorosa para os novos animais adquiridos, reaproveitando de forma mais proveitosa as instalações disponiveis no Zoo. Sugere-se ainda que durante a quarentena seja realizado um rastreio da doença, quer seja com avaliação de esfregaços sanguíneos ou, caso haja recursos para tal, realização de biopsias de fígado para pesquisa dos corpos de inclusão.

14. CONCLUSÃO

Entre as doenças infeciosas que atingem as coleções de répteis, a Doença dos Corpos de inclusão surge como um verdadeiro risco para Boídios em particular, devendo ser incluida nos diganósticos diferenciais para sinais neurológicos, respiratórios e gastrointestinais.

Apesar de, neste caso, existirem escassos sinais clínicos compativeis e de não ter sido realizado PCR para confirmação da doença, a disseminação das inclusões intracitoplasmáticas pelas células sanguíneas e pelas células dos tecidos colhidos por biopsia e na necropsia indicam um diagnóstico praticamente definitivo. Infelizmente, e embora seja uma técnica dispendiosa e invasiva, a biopsia ainda é o método mais sensivel e fiavel para diagnóstico em animais vivos. Os resultados deste estudo evidenciam ainda a evolução subclínica que pode estar presente nesta infeção. Tendo em conta estas limitações é possivel admitir que os resultados obtidos podem subestimar a prevalência real desta doença nesta coleção.

Ainda permanecem muitas questões relativas à etiologia e ao modo de transmissão mas todos os estudos e pesquisas atuais indicam que a prevenção é a chave para impedir que a infeção entre e se dessimine na coleção.

Em Portugal seria interessante realizar o estudo epidemiológico relativo a Doença dos Corpos de Inclusão, já que até à data não foram encontrados dados a esse respeito, de forma a identificar os focos de infeção tanto em coleções de Jardins Zoológicos como em coleções privadas e evitar a troca e aquisição de animais infetados.

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