O Câncer e sua formação

O termo câncer vem do latim “cancer”, que significa “carangueijo”, no qual deve ter sido empregado em analogia entre a morfologia do crustáceo e ao modo de crescimento infiltrante do tumor (DE ALMEIDA, 2005). Representa um conjunto de mais de 100 doenças e é definido como enfermidades complexas de caráter mutacional, proliferativo, de crescimento celular aberrante e descontrolado, em que células em um mesmo microambiente, invadem os tecidos e órgãos adjacentes, podendo migrar para regiões distantes do organismo, evento este conhecido como metástase (KUMAR et al., 2004; INCA, 2010).

As células do câncer possuem defeitos nos mecanismos que governam a proliferação normal. Entre as características do tumor maligno estão à auto-suficiência da sinalização de fatores de crescimento, insensibilidade a inibidores do crescimento, inibição da morte celular não seguida de autólise (apoptose), potencial replicativo ilimitado, angiogênese, poder de invasão e capacidade de metastatizar-se (HANAHAN & WEINGER, 2000).

A célula neoplásica passa a ser considerada nesta condição quando ela

adquire vantagens metabólicas e capacidades biológicas quando comparadas às

células não transformadas: a) perda do controle da proliferação e divisão celular; b) imortalização celular devido à ativação da enzima telomerase; c) alterações cromossômicas (de forma e número); d) perda das propriedades adesivas da membrana plasmática, que permite o reconhecimento célula-célula e a inibição por contato do movimento e crescimento celular; e) perda de função e da capacidade de diferenciação ou especialização; f) capacidade para invadir tecidos vizinhos ou distantes e formar metástases; g) capacidade de induzir a formação de novos vasos sangüíneos (angiogênese). Observa-se, no entanto, que todos os casos de câncer estão envolvidos com as vias de transmissão de sinais biológicos, no controle positivo e negativo do ciclo celular e da morte celular programada (LIOTTA & KOHN, 2001; RIBEIRO et al., 2003).

A formação do câncer dá-se pelo processo denominado carcinogênese, geralmente ocorre lentamente, podendo levar vários anos para que uma célula cancerosa origine um tumor detectável (Figura 1). Esse processo passa por vários estágios até de chegar à formação tumoral: são os de iniciação, promoção e de

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progressão (SPANDIDOS, 1985; CHABNER & LONGO, 1996; SPENCE &

JONHSTON, 2001; KUMMAR et al., 2004; SPANDIDOS, 2007).

O primeiro estágio da carcinogênese é o da iniciação. As células sofrem o efeito de um agente carcinogênico, também chamado de agente oncoiniciador, que

provocamodificações em alguns de seus genes. Nesta fase as células encontram-se

geneticamente alteradas, mas ainda não é possível se detectar um tumor

clinicamente. Como exemplo de substâncias químicas carcinógenas tem sido descrito

o sulfato de dimetila, metilnitrossuréia, cloreto de vinila, aflatoxinas, dimetilnitrosamina e benzopireno, entre outros agentes não químicos, como: exposição por vírus, hepatite B, HTLV, HPV, radiação ionizante (CHABNER & LONGO, 1996; SPENCE &

JONHSTON, 2001;KUMMAR et al., 2004;JUNG et al., 2006).

Na fase seguinte, denominada de promoção, as células geneticamente

alteradas (iniciadas) sofrem um efeito prolongado dos agentes oncopromotores, induzindo a expressão de proto-oncogenes.A célula iniciada é transformada em célula maligna, de forma lenta e gradual. A suspensão do contato com o agente muitas vezes interrompe o processo nesse estágio. Sendo assim, a promoção pode compreender pelo menos dois mecanismos independentes: a ativação gênica e a atividade mitótica (SPENCE & JONHSTON, 2001; KUMMAR et al., 2004; KLAUNING & KAMENDULIS, 2008).

O terceiro e último estágio é o da progressão e caracteriza-se pela multiplicação descontrolada, sendo um processo irreversível. O tumor maligno já está em fase de desenvolvimento no microambiente favorável, evoluindo até o surgimento das primeiras manifestações clínicas da doença. Os fatores que promovem a iniciação ou progressão da carcinogênese são chamados de carcinógenos. Existe um grande número de agentes que causam lesão e induzem a transformação neoplásica das células, são eles: os carcinógenos químicos, energia radioativa, vírus oncogênicos e alguns agentes microbianos. O fumo, por exemplo, é um agente carcinógeno completo, pois possui componentes que atuam nos três estágios da carcinogênese.

(SPENCE & JONHSTON, 2001; KUMMAR et al., 2004; JUNG et al., 2006;

SPANDIDOS, 2007).

A classificação do câncer é feita de acordo com o tipo de célula que o originou, baseada no componente parenquimatoso, e não de acordo com os tecidos para os quais se espalhou. Pode-se chamar de classificação primária (KATZUNG, 2003; KUMMAR et al., 2004).

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A série de anormalidades metabólicas decorrentes do câncer, bem como os processos invasivos e metastáticos, provoca doença e morte eventual do paciente, a não ser que a neoplasia maligna possa ser erradicada com o tratamento (KATZUNG, 2003; BEZERRA, 2008b).

Agentes adquiridos

(ambientais) que lesão o DNA: Químicos, radiação, vírus

Incapacidade de recuperação DNA

Mutações hereditárias em:

 Genes que afetam a recuperação do DNA;  Genes que afetam o crescimento celular ou apoptose. Célula Normal Reparo do DNA Bem -sucedido Lesão do DNA

Mutações no genoma das células somáticas

Ativação dos oncogenes promotores do crescimento

Inativação do gene supressor de tumor

Alterações nos genes que regulam a apoptose

Proliferação celular desregulada _{Diminuição da apoptose}

Expansão clonal Angiogênese

Escapa da imunidade Mutações adicionais Progressão do tumor

Neoplasia maligna Invasão e Metástase

Figura 1: Fluxograma mostrando um esquema simplificado da base molecular do câncer (Adaptado de KUMMAR et al., 2004).

1.2 Incidência do Câncer

As principais observações relativas à causa do câncer podem ser observadas pelos estudos epidemiológicos existentes, que relacionam a um ambiente particular, a hereditariedade e influências culturais com a ocorrência de tumores malignos. Algumas doenças que se mostrem associadas com um risco maior de desenvolver o

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câncer, podem fornecer dados sobre a patogênese da malignidade (KUMAR et al., 2004).

Desde 2003 o câncer tem sido a segunda causa de morte por doença, atrás apenas de mortes relacionadas a doenças cardiovasculares, com uma incidência anual estimada em 6 milhões de casos (SRIVASTAVA et al., 2005). O câncer atemoriza a sociedade atual por ter se tornado um estigma de mortalidade e dor, sendo responsável por 25 % das mortes. Acredita-se que até 2020 mais 20 milhões de novos casos irão surgir (ALMEIDA et al., 2005; INCA, 2010).

No Brasil, as estimativas para o ano de 2010 apontam que ocorrerá um total de 489.270 novos casos de câncer, sendo 236.240 casos para o sexo masculino e 253.030 para o sexo feminino e serão válidas para o ano de 2011. Estima-se que o câncer de pele do tipo não melanoma (114.000 novos casos) será o mais incidente na população brasileira, seguido pelos tumores de próstata (52.000), mama feminina (49.000), cólon e reto (28.000), pulmão (28.000), estômago (21.000) e colo do útero (18.000) (Figura 2) (INCA, 2010).

Alguns fatores estão associados ao desenvolvimento de alguns tipos de câncer, entre eles os geográficos e ambientais, idade, sexo, hábitos de vida, predisposição genética ao câncer, condições predisponentes não hereditárias, como inflamação crônica e condições pré-cancerosas (KUMAR et al., 2004).

Figura 2: Tipos de câncer mais incidentes estimados para 2010, exceto pele não melanoma, na população brasileira (Fonte: INCA, 2010).

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1.3 O Ciclo celular e o Câncer

A célula surge quando ocorre a fusão ou divisão de duas células. Esse processo dinâmico celular, que ocorre de forma ordenada, pode ser mais bem avaliado através do curso de vida desta célula. Esses eventos se iniciam por ocasião de um processo de replicação, que envolve um período de crescimento seguido pela divisão, sendo denominado de ciclo celular (ALMEIDA et al., 2005).

O ciclo celular é utilizado para controlar o crescimento e a divisão celular, portanto trata-se de um processo evolutivo e ao mesmo tempo conservativo da célula. A estimulação para o crescimento inicia-se com a liberação de fatores, que se ligam aos receptores de membrana da célula e desencadeiam uma cascata de proteínas transdutoras de sinal. Em G0 o DNA apresenta-se enovelado, com atividade nuclear

baixa. Existem duas fases de intervalo chamadas de G1 e G2, em que ocorre a síntese

de RNA e de proteínas; uma fase S, onde acontece à formação e replicação do DNA, e uma fase denominada M, onde a célula executa o processo de divisão em duas células filhas, conhecida como mitose (CRECZYNSKI-PASA; PEDROSA, 2001; FOSTER, 2008).

A regulação do ciclo celular é feita por sinais extracelulares como fatores de crescimento e disponibilidade de nutrientes. Na fase G0 ou que está em quiescência, a

célula nessa fase não está se replicando. Quando as células passam para a fase G1,

ocorre a preparação da célula para a multiplicação, com a produção de fatores de crescimento celulares que são essenciais para a formação da nova célula. Na fase S ocorre a preparação para a síntese de DNA. Em seguida a célula entra na fase G2,

onde há a síntese de componentes para a mitose (divisão celular com manutenção do número de cromossomos específico da espécie), como a produção do fuso mitótico que é feita na fase M. Após o evento da divisão do material nuclear, há um outro evento chamado citocinese (que é a separação da célula mãe, formando duas células filhas com suas organelas e constituintes celulares), finalizando o ciclo de replicação celular (Figura 3) (FOSTER, 2008).

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Figura 3: Esquema das fases do ciclo celular, adapatado de VERMEULEN et al., 2003.

Todo esse processo requer um intenso controle por retroalimentação com o objetivo de assegurar que todas as etapas moleculares sejam seqüenciais e orientadas corretamente. Essa progressão ordenada através das diversas fases do ciclo é orquestrada pelas ciclinas, quinases ciclina-dependentes (CDK’s) e por seus inibidores (FISCHER et al., 2004; KUMAR et al., 2004).

Cada fase do ciclo possui os chamados checkpoints, que podem levar a parada da progressão do ciclo celular e a ativação de mecanismos de reparo (Figura

4)(MALUMBRES et al., 2007). As células vão para a fase seguinte do ciclo celular, de

forma irreversível, se passar pelos checkpoints. O dano ao DNA e/ou mal funcionamento de organelas e estruturas (falha no fuso mitótico) pode ativar a parada do ciclo e a célula pode entrar em morte celular, caso o dano não seja reparado

(FOSTER, 2008). Os pontos de checagem da integridade do DNA operam através do

ciclo, especialmente na transição G1 –S, durante e depois da fase de síntese do DNA,

e antes das células entrarem em mitose (G2 - M) (FISCHER et al., 2004).

Nas células tumorais, os checkpoints são freqüentemente ignorados, resultando em instabilidade genética e conseqüente vantagem proliferativa de células cancerosas, quando comparadas com as células normais (FISCHER et al., 2004).

As ciclinas são proteínas chaves do ciclo celular, que em conjunto com as quinases dependentes de ciclina (CDKs), formam o complexo ciclina-CDK que

coordena a progressão do ciclo (MALUMBRES et al., 2007). Este complexo é

composto por uma subunidade reguladora (ciclina) e uma catalítica (CDK)

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modificações nos seus níveis de expressão de RNAm, quanto nos níveis de proteínas. Assim as ciclinas são produzidas em cada uma das fases do ciclo (FOSTER, 2008).

A proteína do retinoblastoma, pRb, controla a expressão de genes que comprometem as ciclinas que estão no checkpoint na interseção G1-S. No início de G1,

ela está hipofosforilada, o que reprime o avanço do ciclo celular, porque impede a atividade do fator de transcrição E2F. Próximo ao ponto de restrição, os pontos de restrição, os complexos ciclina D – CDK4 e 6 e o complexo ciclina E – CDK2, hiperfosforila pRb, liberando E2F, promovendo desta forma a entrada em S (ALMEIDA et al., 2005). Quando ocorre mutação no gene pRB, o ciclo celular fica desregulado, e mesmo que a célula não esteja preparada para entrar em S ou tenha ocorrido erros, o ciclo progride (MADDIKA et al., 2007). Isto porque o gene pRb é reconhecido como supressor tumoral, pois é capaz de parar o ciclo celular, caso erros sejam detectados. Por isso, mutações no pRB são freqüentemente encontradas em tumores (ALMEIDA et al., 2005).

As células tumorais mostram uma perda no controle da proliferação celular (ponto de restrição) e, muitas vezes, tornam-se independentes de sinais mitogênicos para a sua progressão através das diferentes fases do ciclo celular (HANAHAN & WEINBERG, 2000; LOURO et al., 2002). A perda do controle da proliferação celular envolve mutações em genes reguladores do ciclo celular, os proto-oncogenes e genes supressores tumorais, o que caracteriza o câncer como uma doença genética (LOURO et al., 2002; FOSTER, 2008). Dessa forma, as alterações nos mecanismos de regulação do ciclo celular tornam a célula apta a passar pelo ciclo celular sem a devida checagem e, portanto fazendo com que esta acumule uma série de mutações que contribuem para o surgimento das características malignas do tumor, como auto- suficiência na sinalização de fatores de crescimento, insensibilidade aos inibidores de crescimento, evasão da morte celular programada (apoptose), potencial replicativo ilimitado, angiogênese e invasão tecidual e metástase (HANAHAN & WEINBERG, 2000; LOURO et al., 2002; FOSTER, 2008). Portanto, as células cancerosas diferem das células normais, pelo fato de continuarem a crescer e se dividir, não obedecendo ao controle biológico natural do organismo (HANAHAN & WEINBERG, 2000).

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Figura 4: Esquema dos pontos de checagem do ciclo celular, adapatado de VERMEULEN et al., 2003.

1.4 Morte celular: Apoptose e Necrose

O equilíbrio entre a proliferação e a morte celular regula e controla o número de células no organismo. A cascata de eventos, bioquímicos e fisiológicos, que leva a mudanças na síntese de macromoléculas, na homeostase celular, na regulação do volume celular, e finalmente na perda da viabilidade celular está intimamente relacionada às mudanças morfológicas características de cada tipo de morte celular (BRASILEIRO-FILHO, 2006; TINARI et al., 2008).

Com o propósito de pesquisar e compreender as patologias, diversos tipos de morte celular vêm sendo descritos, tais como a apoptose, autofagia, necrose, catástrofe mitótica, excitotoxicidade e senescência. No entanto, a apoptose e a necrose são os tipos mais intensamente estudados (KRYSKO et al., 2008).

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A morte celular pode ser classificada de acordo com sua aparência morfológica (apoptose, necrose, autofagia ou catástrofe mitótica – Figura 5), critérios com base em enzimas (com ou sem o envolvimento de nucleases ou de classes distintas de proteases, tais como caspases, catepsinas e glutaminases), aspectos funcionais (programada ou acidental, fisiológica ou patológica) ou características imunológicas (imunogênicas ou não imunogênicas) (MELINO, 2001; OKADA & MAK, 2004; GALLUZZI et al., 2007).

Figura 5: Características morfológicas dos principais tipos de morte celular. PS: fosfatidilserina; LC3: proteína citoplasmática que é considerada um marcador da macroautofagia. Fonte: Bruin & Medema, 2008.

A autofagia é uma resposta ativa a falta de nutrientes, diferenciação e desenvolvimento, sendo então um processo adaptativo de resposta ao estresse metabólico, que resulta na degradação de proteínas e organelas. A autofagia é definida como um processo em que proteínas e organelas são degradadas por proteases lisossomais (RICCI & ZONG, 2006).

A catástrofe mitótica não é considerada uma forma de morte, mas sim um sinal irreversível para a morte (RICCI & ZONG, 2006), sendo principalmente associada nos pontos de checagem do ciclo celular. É um processo resultante de mitose aberrante, durante a separação das cromátides irmãs (BREDESEN, 2007). Morfologicamente

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apresentam-se como células aumentadas e multinucleadas, e com defeitos mitóticos, como condensação nuclear incompleta, defeito no alinhamento dos cromossomos e dano DNA (BRUIN & MEDEMA, 2008).

O dano que leva a catástrofe mitótica pode ser induzido por fármacos quimioterápicos como agentes da hiperpolimerização dos microtúbulos (paclitaxel), agentes despolimeralizantes de microtubulos (vinblastina e vincristina) e inibidores de checkpoint quinase 1 (Chk1) (7-hidroxiestaurosporina) (RICCI & ZONG, 2006).

As principais características da necrose incluem: depleção energética, danos a membrana lipídica e perda da função homeostática de canais e bombas de íons. É bem caracterizada pela vacuolização do citoplasma, perda de integridade de membrana e aumento do volume celular (KRYSKO et al., 2008). A necrose é induzida por inibidores da produção de energia celular, desbalanço no fluxo de cálcio, geração de ROS e ativação de proteases não apoptóticas, cada um destes eventos potencializa o outro. A β-lapachona e o honokiol são exemplos de compostos que induzem necrose em células tumorais (BRASILEIRO-FILHO, 2006; RICCI & ZONG, 2006).

A apoptose é um importante fenômeno, bem caracterizado, na citotoxicidade induzida por fármacos anticâncer (KIM et al., 2002; MADDIKA et al., 2007;), sendo também um processo seletivo de deleção celular fisiológica (HENGARTNER, 2000), visto que ocorre para o controle da população celular e do tecido (VERMES et al., 2000), desenvolvimento embrionário ( ZIEGLER & GROSCURTH, 2004), dentre outros processos fisiológicos e patológicos. Foi primeiramente descrita por Kerr e colaboradores em 1972.

Do grego apo= de e ptose= cair, a apoptose é conhecida como morte celular programada, fenômeno esse em que a célula é estimulada a acionar mecanismos que culminam com sua morte. A célula em apoptose não sofre autólise, ela é fragmentada e seus fragmentos são endocitados por células vizinhas, sem desencadear quimiotatismo nem ativação de células fagocitárias, diferentemente da necrose (BRASILEIRO-FILHO, 2006). A apoptose pode ser reconhecida por algumas características marcantes e coordenadas, pode ser observado retração celular e conseqüente perda de aderência com a matrix extracelular e células vizinhas. As organelas mantêm a morfologia, porém em alguns casos, as mitocôndrias podem apresentar ruptura na membrana externa. A cromatina sofre condensação, além disso, na membrana plasmática, formam-se prolongamentos, os chamados blebs, que aumentam de tamanho e se rompem, originados os corpos apoptóticos, onde são rapidamente fagocitados por macrófagos e removidos sem causar processo inflamatório (ZIEGLER; GROSCURTH, 2004).

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A ativação da apoptose ocorre por duas vias gerais: via extrínseca e

intrínseca (Figura 6).

Quando a via intrínseca é ativada (Figura 6), o primeiro passo é o aumento da permeabilidade da membrana mitocondrial seguida da liberação de proteínas que normalmente estavam localizadas no espaço intermembranar [citocromo c, fator de indução da apoptose, Smac/DIABLO (Second Mitochondria-derived Activator of Caspases/Direct IAP Binding Protein with Low Propidium iodideI), entre outros]. O citocromo c se liga a Apaf-1 (Apoptotic peptidase activating factor 1) e forma um complexo multicatalítico chamado apoptossomo. Este complexo ativa a caspase-9 a partir de sua forma zimogênica pró-caspase-9. Então, a caspase-9 cliva as caspases efetoras -3, -6 e -7, ativando-as para realizar a fragmentação do DNA (KUMAR et al., 2004; ZIEGLER & GROSCURTH, 2004; BRASILEIRO-FILHO, 2006).

A via de receptor de morte ou via extrínseca (Figura 6) envolve a ativação de receptores de membrana. Eles são membros da superfamília de receptores de fatores de necrose tumoral (Tumor Necrosis Factor receptor - rTNF). Estão inclusos nessa família os receptores de membrana rTNF-1, FAS (CD95), TRAIL (TNF-related apoptosis inducing ligand), entre outros. Esses receptores possuem um domínio distinto dentro do citoplasma denominado de domínio de morte (Death Domain - DD) que contém uma seqüência de 65 aminoácidos. Após a associação dos receptores de membrana ao seu correspondente DD, ocorre uma mudança conformacional nos receptores, o que promove o recrutamento de uma molécula adaptadora FAS que irá associar-se com o domínio de morte (DD) formando o FADD. Este complexo formado é o responsável por iniciar a cascata de caspases, pois o FADD se liga a procaspase- 8 e forma caspase-8, ativando as caspases efetoras -3, -6 e -7 (STRASSER et al., 2000; ZIEGLER & GROSCURTH, 2004).

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Figura 6: Esquema demonstrando as principais vias de ativação da apoptose, suas interconexões e as alterações morfológicas mais características. Adaptado de MACFARLANE & WILLIAMS (2004) com algumas alterações.

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1.5 Princípios de Quimioterapia Antineoplásica

A utilização de agentes químicos, isolados ou em combinação com o objetivo de tratar os tumores malignos, denomina-se de quimioterapia antineoplásica. Difere da radioterapia e da terapia cirúrgica por ser um tratamento sistêmico e cada vez mais tem se tornado uma das mais importantes e promissoras ferramentas de combate ao câncer no mundo (BONASSA & SANTANA, 2005). Existem as terapias com fotorradiação (KUSUZAKI et al., 2007) e a imunoterapia (HERR & MORALES, 2008).

A proposta do tratamento com os agentes antineoplásicos é de impedir a multiplicação de células cancerosas, a metastização e de proporcionar a destruição do tumor existente (SKEEL, 2007).

No entanto, apesar do considerável arsenal de drogas já existentes para o tratamento do câncer, em muitos casos, o sucesso terapêutico não é alcançado por causa de falhas nos esquemas terapêuticos, altos índices de recidivas, redução da sobrevida dos pacientes e dos efeitos adversos, o que leva a uma contínua busca por novos fármacos (SALGALLER & LODGER, 1998). O fármaco ideal deve aumentar a especificidade, protegendo tecidos normais, minimizar o desconforto dos pacientes e aumentar a eficácia, resultando na erradicação da massa heterogênea do tumor (BRANNON-PEPPAS & BLANCHETTE, 2004).

Diante do exposto anteriormente, é importante que novas estratégias como o restabelecimento do controle do ciclo celular com drogas que agem nos pontos de checagem, possam ser disponibilizadas como uma estratégia viável na terapia anticâncer (FISCHER et al., 2004).

Dentre as substâncias isoladas de produtos naturais encontramos os chamados metabólitos secundários, uma classe química que se destaca pelo grande potencial farmacológico. Estes são produtos de vias condicionais que são ativadas em contextos ou situações particulares. Eles podem ser divididos em diversas classes estruturais: terpenos, lignanas, taninos, lactonas, esteróides, chalconas, flavonas, flavanonas, alcalóides e quinonas, dentre outros (CLARDY & WALSH, 2004).

Além disso, inúmeros análogos foram sintetizados em laboratórios por diferentes grupos de pesquisa, com o objetivo de se identificar os grupos farmacofóricos, estabelecendo, assim, a relação estrutura-atividade na tentativa de se obter fármacos mais potentes (KINGSTON, 2000). A partir deste momento, grandes mudanças ocorreram nos centros de pesquisas, incluindo a identificação de novos alvos moleculares exploráveis, estabelecimento de programas de triagem de produtos naturais em larga escala (HTS – High Throughput Screening), avanços no projeto

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racional de drogas e química combinatória (YUNES et al., 2001; MANN, 2002; ROTHENBERG et al., 2003; BUTLER, 2004; GANESAN, 2004; WESTWELL & STEVENS, 2004; CRAGG & NEWMAN, 2005; CRAGG et al., 2006; NEWMAN & CRAGG, 2007).

Diversos fármacos, nas fases do ciclo celular, irão atuar inibindo a multiplicação celular. Esses fármacos que exercem a sua ação interferindo no ciclo celular são chamados de ciclo-celular específicos. Entretanto, os antineoplásicos que tem a