No século passado, houve uma grande revolução no desenvolvimento de agentes citotóxicos para a terapia do câncer. Foi possível alcançar o controle de certas neoplasias, como as neoplasias da infância, leucemia aguda, doença de Hodgkin, linfomas não-Hodgkin, neoplasia trofoblástica gestacional e tumores de células germinativas (ISMAEL et al., 2008).
O desenvolvimento da terapia antineoplásica frente a mudanças severas, como a limitação da indicação de algumas drogas e o fato das substâncias citotóxicas causarem danos não só unicamente no tumor como no tecido normal e saudável, tornou-se cada vez mais freqüente a busca por agentes mais seletivos (ISMAEL et al., 2008).
A quimioterapia clássica, porém, traz ao paciente uma série de limitações quanto a sua freqüência de uso e a tolerância orgânica frente às reações adversas. Normalmente, dependendo do tipo de reação provocada pelo medicamento, o paciente precisa de um intervalo entre os ciclos, maior ou menor, visto que as doses utilizadas nos pacientes é individual e são calculadas baseando-se na superfície corporal de cada indivíduo.
Os novos agentes estudados podem ser utilizados como protótipos para a síntese de análogos mais promissores. A obtenção de análogos é um processo comumente utilizado para descobrir os grupamentos essenciais à atividade biológica, e isso pode ser feito através de estudos da relação entre a estrutura e atividade biológica servindo de base para a otimização molecular (GARRETT & WORKMAN, 1999; WILSON & DANISHEFSKY, 2007).
Têm-se por objetivo, neste processo, o desenho racional e o desenvolvimento de uma segunda geração de agentes com características melhoradas, tais como o aumento da eficácia e da estabilidade, a melhora das propriedades farmacocinéticas e a diminuição dos efeitos colaterais (ORTHOLAND & GANESAN, 2004).
Adicionalmente, a descoberta de novas drogas através da extração de produtos naturais tem tido limitações quando comparados com as substâncias sintéticas pesquisadas. Alguns achados mostram que dentro da indústria farmacêutica a descoberta de produtos naturais promissores para o tratamento de muitas doenças são caros e desafiam o tempo e custo dessas pesquisas (LAM, 2007).
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Inúmeras vantagens das novas técnicas de estudo da relação estrutura- atividade, obtidos por técnicas recentes de modelagem molecular, as técnicas tradicionais de modificação molecular e relação estrutura-atividade, apesar de serem dispendiosas e requer extenso período de investigação, são, ainda, de suma importância na descoberta e na caracterização de novos fármacos, onde novos agentes terapêuticos podem ser desenvolvidos pela análise inicial de dados teóricos (WERMUTH et al., 1998; THOMAS, 2000).
Sabendo da importância farmacológica das chalconas, neste trabalho, nos propusemos a estudar a atividade antitumoral da chalcona (E)-1-(4-Nitrofenil)-3- fenilprop-2-en-1-ona, substância sintética, obtida através de uma reação química entre a acetofenona e para-nitro benzaldeído. O grupo das chalconas é considerado uma das maiores classes de substâncias com potencial e muitos interesses farmacológicos (NOWAKOWSKA, 2007). Desse modo, pesquisas vêm sendo realizadas no desenvolvimento de novos análogos. Vale ressaltar que a obtenção desta chalcona (CG) envolve procedimentos relativamente simples, possibilitando sua obtenção em larga escala.
De acordo com a literatura, compostos puros podem ser considerados promissores para justificar novos estudos, quando apresentarem CI50 menor que 1
µg/mL (PESSOA et al., 2000). Considerando esse valor, a CG mostrou-se bastante citotóxica contra as 5 linhagens tumorais humanas estudadas (HL-60; HCT-8; SF-295;
MDA-MB-435; K562). A CI50 variou de 0,30 µg/mL em células de HCT-8 a 0,84 µg/mL
em células de SF-295, a primeira é a linhagem de colón e a segunda do sistema nervoso. Outro ponto a ser observado é a citotoxicidade da CG nas células de K562 (0,43 µg/mL), pois essas células de leucemia mielóide crônica possuem a presença do cromossomo Philadelphia, que resulta em um mau prognóstico para os pacientes e confere maior resistência aos tratamentos antitumorais convencionais devido a uma alteração citogenética específica, resultante da translocação recíproca entre os braços longos dos cromossomos 9 e 22 (MELO et al., 2003; SKEEL, 2007). O potencial citotóxico da CG assemelha-se com os dados encontrados na literatura para outras chalconas estudadas, segundo o trabalho de Srinivasan et al., 2009, mostrou atividade antitumoral in vitro em três derivados de chalconas (11a, 11f, 11h) para as linhagens de câncer de pulmão, H2009 e A549, com CI50 (5.1 ± 1.9; 2.3 ± 0.3; 1.9 ± 0.1 µM).
De acordo com VINCENZO et al., (2000), as chalconas inibem a proliferação de células de câncer de ovário primário. A atividade anti-invasiva (in vitro) pode ser encontrada e demonstrada entre chalconas contendo o grupo fenil. Outras atividades foram descritas com elevado potencial citotóxico em células humanas de colón.
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Apesar de não termos estudado outros análogos de chalconas, é certo que a atividade anticâncer deste composto (CG) está relacionada com a sua estrutura química, na adição do NO2 (eletronegativo) ao anel B da molécula. Essa modificação estrutural interfere na relação estrutura-atividade, proporcionando mecanismos de ação diferentes.
A manutenção da homeostase nos organismos multicelulares é obtida através do balanço entre a proliferação e morte das células. Alguns tipos de morte celular têm sido descritos: apoptose (tipo I), morte celular associado com autofagia (tipo II), necrose ou oncoses (tipo III), catástrofe mitótica, entre outros (KRYSKO, 2008).
Na avaliação do potencial antitumoral de uma substância, é muito importante que se investigue a utilização de células normais a fim de se obter informações sobre a seletividade para a célula normal e tumoral (ZUCO et al., 2002; ANAZETTI et al., 2003). A CG testada em linfócitos periféricos humanos estimulados com fitoemaglutinina, apresentou CI50 de 1,79 µg/mL em 72hs. Este valor sugere que houve
maior citotoxicidade em células HL-60 do que em PBMC quando incubada igualmente por 72h. Os dados também mostraram que a citotoxicidade da CG foi tempo- dependente, onde viu-se em 24h de exposição, 10,51 µg/mL; em 48h, 2,29 µg/mL e 72h, 1,79 µg/mL. Compostos com ação anticâncer, em sua maior parte, têm como alvo moléculas e/ou processos celulares compartilhados por células normais e tumorais, então é de se esperar algum nível de toxicidade.
Ainda participando do “screening” na molécula, foi realizada a investigação da atividade hemolítica com eritrócitos de camundongos buscando caracterizar o mecanismo citotóxico direto sobre a membrana plasmática das células, já que os mesmos possuem grande semelhança com os eritrócitos humanos, principalmente quanto à sensibilidade (COSTA-LOTUFO et al., 2002; DRESCH et al., 2005). Este método é um ótimo indicador para averiguar agressão in vitro, por causa da estabilidade mecânica característica da membrana eritrocitária (SHARMA; SHARMA, 2001).
A ausência da atividade hemolítica foi observada para CG, onde a EC50
mostrou ser acima de 200 µg/mL (790,5 µM), sugerindo possivelmente que o
mecanismo de atividade citotóxica desempenhado por essa substância, não esteja relacionado à indução de dano em nível de membrana plasmática, mas por uma possível interferência com os mecanismos intracelulares.
Os resultados do teste antiproliferativo de exclusão por azul de tripan serve para observar também os efeitos citotóxicos (Figura 15), onde verificou-se a
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confirmação com o ensaio do MTT (Tabela 3). O ensaio permitiu distinguir as células capazes de drenar o corante ácido azul de tripan para fora da célula em contraposição àquelas que não possuem capacidade. A absorção desse corante é um forte indicativo de dano na membrana plasmática que culmina na morte celular (HYNES et al., 2003; MINERVINI et al., 2004). A CG apresentou maior atividade antiproliferativa que o controle negativo nas concentrações testadas após as 24h de incubação e agiu de maneira concentração-tempo-dependente, sendo que na maior concentrção (4,0 µM), houve uma redução da proliferação celular após as doze horas de incubação, com um provável efeito citostático, seguido de efeito citotóxico após as 24h. Apesar de ser utilizado para estudos de citotoxicidade este teste não distingue qual via de morte está participando dela. Visto que sistemas de transporte ativo estão em pleno funcionamento em células viáveis, contudo, nos estágios iniciais da apoptose estes sistemas ainda estão em funcionamento, enquanto que na necrose não.
As avaliações morfológicas realizadas pelo ensaio da LA/BE mostraram que após o tratamento com CG, nas concentrações de 2,0 e 4,0 µM houve um aumento da população de células apoptóticas com 60,44% e 94%, onde as células apresentavam cromatina condensada, fragmentada e de um verde brilhante intenso quando excitadas pela luz azul (BRIGGS; JONES, 2005). VINCENZO et al., (2000), em seu estudo comprovaram-se que ao testar derivados de chalconas pelo método de Brometo de etídeo, verificaram-se que em 1 e 4 h de encubação não houve mudanças significantes no padrão celular, enquanto que em 24h, houve uma diminuição significante de células viáveis, o que corrobora com os nossos resultados expostos.
Investigando o mecanismo de ação envolvido na citotoxicidade em que a CG está relacionada, a inibição da proliferação celular foi mensurada pela inibição da síntese de DNA, através da atividade antiproliferativa pela incorporação do BrdU (análogo da timidina), que tem o intuito de avaliar a taxa de proliferação por meio do percentual de células que incorporam o BrdU (DOLBEARE et al., 1983). Porém, o resultado encontrado mostrou que não houve diminuição da incorporação do BrdU ao DNA das células de HL-60 testadas (Figura 17), mas observou-se a diminuição da população celular, como mostrado na Figura 18. Esses resultados refletem que provavelmente a ação da CG não está relacionada à inibição da síntese de DNA.
As substâncias utilizadas na terapia do câncer apresentam características diversas em seus mecanismos de ação, o grupo dos taxanes e dos alcalóides da vinca, por exemplo, atuam em nível microtubular, já as antraciclinas atuam impedindo a síntese de DNA, RNA e proteínas (BONASSA, 2005).
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Subseqüentemente ao estudo de inibição de síntese de DNA, alterações morfológicas foram investigadas usando a coloração por May-Grünwald-Giemsa com o intuito de determinar que tipo de morte celular estivesse relacionado com a citoxicidade das substâncias (MARINHO-FILHO et al., 2010). Apoptose é uma das formas de morte celular de grande importância nos sistemas biológicos, pois desempenha um papel essencial no desenvolvimento dos tecidos e órgãos, na regulação da resposta imune, na eliminação de células senescentes e na morte celular induzida pelas drogas antineoplásicas (HU & KAVANAGH, 2003; VERMEULEN et al., 2005).
A morte celular via apoptose pode ser identificada por uma série de alterações morfológicas na célula como diminuição do volume celular, condensação da cromatina, fragmentação nuclear, formação de corpos apoptóticos e de prolongamentos da membrana plasmática (“blebs”). Já a necrose ocorre por uma ação rápida da droga na célula e é caracterizada pelo aumento do volume celular inicial e perda da integridade da membrana plasmática (KERR et al., 1972; DARZYNKIEWICZ
et al., 1992; STRASSER et al, 2000). Na análise da exposição das células de HL-60
com as concentrações testadas de CG em 24 horas de exposição, foram facilmente visualizadas, por microscopia óptica, a diminuição do volume celular, condensação da cromatina, fragmentação nuclear, presença dos blebs e formação de corpos apoptóticos, condizendo com as características já mostradas nos ensaios de LA/BE.
A indução de apoptose em células tumorais é um benefício para o tratamento do câncer (LOS et al., 2003). A apoptose é a morte celular programada da célula que envolve o controle genético de eventos bioquímicos e morfológicos das células, incluindo a externalização da fosfatidilserina, liberação do citocromo c da mitocôndria e ativação de caspases (SCHULTZ & HARRINGTON, 2003). A citometria de fluxo é uma ferramenta bastante valiosa para estudo estrutural e funcional das células, sendo considerado um método rápido e preciso, tendo boa aplicação para investigação de compostos com atividade antitumoral. As características inerentes à morfologia das células apoptóticas como condensação de cromatina e a redução do volume celular são detectadas por meio do desvio da luz incidida sobre a célula para frente e para o lado (DARZYNKIEWICZ et al., 1992; RAMANATHAN,1997; LIMA, 2005).
A citometria de fluxo utiliza um sistema para observar células individuais obtidas a partir de uma suspensão celular. Assim, uma população de células passa ao longo de tubos capilares, onde um sistema óptico registra o parâmetro que se deseja medir e alimenta um computador com os dados obtidos. Corantes fluorescentes
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específicos são utilizados para os componentes celulares que se deseja observar, permitindo o uso do citômetro de fluxo no diagnóstico das neoplasias e como uma poderosa ferramenta para a compreensão das alterações celulares causadas por compostos biologicamente ativos (SHAPIRO et al., 1995; MARINHO-FILHO et al., 2010).
Os estudos realizados com citometria de fluxo mostraram diminuição significativa do número de células a partir da concentração de 2,0 µM (equivalente a
CI50) e pouca perda da integridade de membrana, na mesma concentração, diferindo
apenas da maior dose (4,0 µM), que apresentou perda importante dessa integridade de membrana. Em relação à análise da fragmentação do DNA, a CG apresentou nas maiores concentrações testadas (2,0 e 4,0 µM), 22,54 e 48,49% respectivamente. Enquanto que no ciclo celular, observou-se que na fase G2/M, a maior concentração
testada (4,0 µM), apresentou parada nesta fase de 20,87%. VICENZO e colaboradores (2000) mostraram em seu trabalho que os compostos derivados de chalcona, tiveram
um aumento da fragmentação do DNA e mostraram parada em G2/M do ciclo celular,
se equiparando aos dados encontrados neste estudo.
A progressão apropriada ao longo do ciclo celular é monitorada por pontos de checagem (checkpoints) que correspondem às etapas de transição G1/S e G2/M para
detectar defeitos durante a síntese de DNA e a segregação cromossômica, respectivamente (MALUMBRES & BARBACID, 2009). Assim, o dano celular pode causar a parada do ciclo na fase G1 para permitir que o sistema de reparo atue antes
da passagem para a próxima fase. Essa passagem (G1 S) é regulada pela
fosforilação da proteína Retinoblastoma (Rb) por quinases dependentes de ciclinas (Cyclin-Dependent Kinases, CDKs), principalmente, após a formação dos complexos ciclina D-CDK4 e ciclina D-CDK6. Em seu estado hipofosforilado, a Rb liga-se e inibe a transcrição do fator de transcrição E2F. O complexo de ciclina D-CDK fosforila a Rb, a qual libera o E2F, permitindo ao mesmo atuar na ativação de genes e expressão de proteínas (ciclina E) necessários para entrar na fase S (HARBOUR et al., 1999; MALUMBRES & BARBACID, 2009). Assim, é provável que a parada do ciclo celular causada pela CG possa estar relacionada à presença de possíveis alterações percebidas na síntese de proteínas e RNA (Fase G2), pela alteração na maquinaria de
reparo ou em alguma fase do processo mitótico (Fase M). Certamente, a atuação do maquinário enzimático de reparo não conseguiu corrigir o dano celular, levando às células leucêmicas à morte por apoptose.
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com o objetivo de melhor caracterizar a via apoptótica da envolvida. A anexina V é um representante de uma família de proteínas ligadas a fosfolipídeos dependentes de cálcio, e possuem alta afinidade por bicamadas fosfolipídicas de membrana, ricas em fosfatidilserina. Os fluocromos conjulgados podem ser uma ferramenta fundamental para monitorar as mudanças de assimetria de membranas celulares fosfolipídicas, sendo, portanto um excelente método para determinar a presença de células apoptóticas (THIAGARAJAN & TAIT, 1990; KOOPMAN et al., 1994). O ensaio da anexina V foi realizado para detectar a externalização da fosfatidilserina (evento ocorrido na fase inicial da apoptose), o qual é um fosfolipídeo interno da estrutura da membrana, e que ao ser externalizado, sinaliza para os macrófagos induzindo a fagocitose da célula, evitando a liberação do conteúdo celular para o meio extracelular (VERMES et al, 1995; ZIMMERMANN et al, 2001; FREIKMAN et al, 2008).
Após 24h de exposição a CG, observou-se um aumento, de modo concentração-depedente, no número de células anexina positiva, representada pela apoptose inicial e tardia. Células apoptóticas mostram perda da assimetria aumentando a externalização de PS principalmente na dose de 4,0 µM. Houve um aumento discreto de células em necrose, nas doses de 2,0 e 4,0 µM (Figura 23). É importante destacar que o evento de externalização da fosfatidilserina ocorre por causa da liberação de citocromo c devido à perda de integridade da membrana mitocondrial (GOLDSTEIN et al., 2000; FREIKMAN et al, 2008).
Bioquimicamente, a apoptose é tida como a morte celular programada, executada por uma família de proteases- as caspases- que, à ativação, regulam o desmonte da célula de maneira precisa e orquestrada, e este é o processo inconfundível da apoptose (JIMENEZ, 2009). As caspases estão agrupadas em dois tipos: iniciadoras (2, 8, 9 e 10) e efetoras (3, 6 e 7) (WANG et al., 2005). A CG foi capaz de ativar as caspases 3 e 7 nas concentrações de 2,0 e 4,0 µM. Também ativou a caspase 8, nas três doses testadas (1,0; 2,0 e 4,0 µM) e a caspase 9, na maior concentração (4,0 µM). As duas maiores sinalizações da apoptose no organismo humano, são a via “extrínseca” iniciada pela ativação de receptores de morte presentes na membrana que conduz a uma clivagem das caspases e a via “intrínseca” caracterizada pela despolarização mitocondrial, liberação de citocromo c e ativação de caspases (MONTENEGRO et al., 2010). Diante do exposto sugere-se que a CG age somente pela via extrínseca nas concentrações de 1,0, 2,0 e 4,0 µM.
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A mitocôndria desempenha um importante papel no programa apoptótico. O Citocromo c, normalmente reside no espaço entre as membranas interna e externa da mitocôndria, onde ele atua na transferência de elétrons como parte da fosforilação oxidativa. Após a sinalização do processo de morte (apoptose), a membrana mitocondrial externa torna-se despolarizada e o citocromo c é secretado da mitocôndria para o citosol circundante. Este associa-se a outras proteínas para desencadear a cascata de eventos que culminam na apoptose. Uma vez no citoplasma, o citocromo c associa-se à proteína Apaf-1, formando o apoptossomo, que culmina em ativar a procaspase-9, convertendo-se em caspase-9, chamado de processo da via intrínseca (FANG et al., 2008; WEINBERG, 2008; JIMENEZ, 2009).
Para a investigação de eventos apoptóticos através do envolvimento mitocondrial, pelo método do Western blot, a CG não mostrou diferença na expressão do citocromo c e procaspase-9 nas concentrações e tempos testados em relação ao controle. Em adição, o tratamento das células de HL-60 com a CG não está unicamente associada com a liberação do citocromo c, mas com o aumento da expressão da caspase-9 clivada quando encubada por 24 h exposta a maior concentração (2,0 µM), Entretanto, baseado nos resultados encontrados, é adequado conjeturam que na maior concentração 4,0 µM, as duas vias da apoptose são ativadas. Estes resultados se equiparam a outros estudos com derivados de chalconas, como o realizado por FANG et al.(2008), que mostrou o envolvimento da expressão de vários marcadores de morte celular, entre eles as caspases 8, 9 e 3, como também o citocromo c, quando testados com o isolespeol, mostrando a utilização também das duas vias envolvidas no mecanismo de morte celular. NISHIMURA et al. (2007), estudram a ação antitumoral da isobavachalcona, onde foi observado aumento da expressão da caspase-3 e 9, como também do Bcl-2 e Bax.
De acordo com a literatura, a atividade citotóxica de algumas chalconas já foi relacionada a diferentes mecanismos de ação, entre eles: (a) inibição da incorporação celular da timina, uridina e leucina, inibindo desta forma a síntese de RNA, DNA e proteínas; (b) inibição não-competitiva da interação entre 1-cloro-2,4-dinitrobenzeno e a glutationa S-transferase (GST) (DIMMOCK et al., 1999); (c) desestabilização dos microtúbulos, através da competição com a colchicina pelo sítio ativo da tubulina, provocando um decréscimo no crescimento tumoral, alquilação do processo mitótico (LAWRENCE; McGOWN; DUCKI, 2000; LAWRENCE et al., 2006); (d) inibição da interação entre a oncoproteína MDM2 e a proteína de supressão tumoral p53, levando a um aumento da atividade transcripcional da p53, reativando a integridade genômica
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(STOLL et al., 2001); (e) inibição da liberação de histamina, possivelmente através da inibição da proteína C quinase (PKC), já que esta enzima constitui um importante receptor para certos tipos de tumores, exercendo uma atividade antitumoral (MIDDLETON et al., 1987).
Além disso, de acordo com Dimmock e colaboradores (1999), a introdução de grupos hidroxila favorece o aumento da citotoxicidade. Estudos realizados por Gordon e colaboradores (1993), com dihidroxichalconas indicaram um aumento na atividade antitumoral. Há também uma inibição da produção de lactato nas células tumorais tipo ascíticas de Erlich (SUOLINNA, 1975).
Na oncologia muitos agentes antineoplásicos de uso clínico são considerados genotóxicos e mutagênicos, como por exemplo, o etoposídeo, teniposídeo, doxorrubicina, entre outros. Vários agentes alquilantes são considerados leucemogênicos. A relação entre a atividade citotóxica, genotóxica e mutagência ainda não está bem elucidada (ANDERSON & BERGER, 1994; DE MESA et al., 2002).
Esse tipo de exposição ao indivíduo provoca algumas vezes o desenvolvimento de segunda malignidade. Apesar desse risco, o benefício provocado por muitas substâncias antineoplásicas, que resulta na remissão parcial ou completa do tumor é considerado. O objetivo da avaliação sistemática da carcinogenicidade dos agentes citotóxicos em diversas espécies animais e também em células humanas permite a identificação e o desenvolvimento de agentes menos tóxicos, sendo benéfico aos pacientes (AYDEMIR & BILALOGLU, 2003).
Vários ensaios para identificação de agentes mutagênicos e/ou genotóxicos vem sendo desenvolvidos (MACGREGOR et al., 2000). A ocorrência de mutações, no entanto, depende da natureza da lesão e das respostas celulares aos danos no DNA. (SILVA et al., 2003).
O teste do cometa é considerado um método com sensibilidade adequada relacionado à detecção da quebra de fitas simples ou dupla do DNA (GONTIJO & TICE, 2003). É essencial para a avaliação da segurança de novos fármacos (HARTMANN et al., 2003). Os testes citogenéticos in vitro têm fornecido informações fundamentais para o estabelecimento do potencial mutagênico de agentes químicos e físicos. O estudo de danos no DNA em nível cromossômico é essencial uma vez que a mutação cromossômica é um evento importante no processo de carcinogênese (SALVADORI et al., 2003).
O uso das células de PBMC, obtidas do sangue periférico como células-modelo para avaliar a genotoxicidade deve-se ao fato dessas células serem sensíveis aos