Armazenar a 15-30°C.
Utilização prevista
Determinação quantitativa da hemoglobina glicosilada A1c no sangue inteiro. Utilização apenas para diagnóstico in vitro. Somente para uso profissional. Significado Clínico
A diabetes Mellitus é uma doença crónica caracterizada por uma hiperglicemia. As consequências são transtornos de metabolismo de hidratos de carbono, lípidos e proteínas. O risco de complicações associados com a diabetes, incluindo nefropatia, retinopatia e doenças cardiovasculares aumenta em pacientes com um mau controlo metabólico Em pacientes diabéticos, onde os níveis de glicose no sangue são elevados, HbA1c é formado
como uma consequência da glicação não enzimática do N-terminal da cadeia beta da molécula de hemoglobina. O nível de HbA1c é proporcional ao nível de
glicose no sangue e tem sido largamente aceito como um indicador da média diária da concentração de glicose no sangue pelas 6-8 semanas precedentes. É por isso um indicador a longo prazo do controlo de diabetes enquanto a medição da glicose no sangue só é um indicador a curto prazo.
Um diagnóstico clínico não deverá ser feito com base no resultado de um só ensaio; deverá assentar-se em dados clínicios e laboratoriais.
Principio
Depois de preparar o hemolisado, onde a fracção lábil é eliminada, as hemoglobinas são retidas por uma resina de permuta de catiões. A hemoglobina A1c é especificamente eluída depois de eliminar por lavagem a
fracção de HbA1a+b e é quantificada pela leitura fotométrica directa a 415 nm.
Dois parâmetros devem ser medidos a fim de calcular a percentagem de HbA1c: Abs da fracção Hb1Ac e Abs do Hb total.
Reagentes Nota 6
Reagente 1 (1x6 ml)
Biftalato de potássio ... 50 mmol/l Detergente, pH 5.0
Reagente 2 (1x 47 ml)
Tampão de fosfato, pH 6.5 ... 48 mmol/l Azida de sódio ... 0.95 g/l Reagente 3
(2x180 ml)
Tampão de fosfato, pH 6.4 ... 72 mmol/l Azida de sódio ... 0.95 g/l Reagente 4
20 pcs
Microcolunas: Contêm uma quantidade previamente pesada da resina equilibrada com um tampão de fosfato.
Preparação
Os reagentes estão prontos a utilizar.
Deixe até que coluna e os reagentes estejam à temperatura ambiente (21- 26°C) uns minutos antes do usoNota1.
Preparação da colunaNotas2-3: Sempre retire primeiro a tampa superior da
coluna e a seguir a tampa inferior. Empurre cuidadosamente o disco superior até à superfície da resina até ao primeiro contacto, sem comprimir a resina. Deixe a coluna drenar e elimene o eluente.
Armazenamento e Validade
Todos os componentes do Kit são válidos até à data de expiração indicada quando conservados a 15-30°C.
Equipamento adicional
- Espectrofotométrico ou colorimétrico de medição de 415 nm - cuvetas compatíveis 1,0 cm – transparentes
- Tubos de ensaio (16x160 mm) - Equipamento geral de laboratório Amostras
Sangue inteiro recolhido em heparina ou EDTA. Estável por pelo menos 7 dias a 2-8°C
Procedimento
1. Comprimento 415 (405-425) nm; Temperatura 21-26°C; Cuveta 1 cm – transparente
2. Ajuste o instrumento a zero com a água destilada 3. Preparação do hemolisado e eliminação da fracção lábil Pipete para dentro do tubo de ensaioNota4:
Sangue 50 μl
Reagente 1 200 μl
Agitar bem e deixar estar à temperatura ambiente durante uns for 10-15 minutos. O hemolisado será utilizado nas fases 5 e 6.
4. Prepare uma coluna: veja a preparação 5. Separação e leitura da fracção de HbA1c:
Pipetar cuidadosamente no filtro superior:
Hemolisado 50 μl Deixe a coluna drenar e elimine o eluente Para remover qualquer resíduo de amostra ficado em cima do disco superior, pipetar:
Reagente 2Nota5 200 μl Deixe a coluna drenar e elimine o eluente
Para eliminar a fração não HbA1c, pipeta:
Reagente 2Nota5 2.0 ml Deixe a coluna drenar e elimine o eluente
Para eluir a fração de HbA1c, coloque a coluna sobre um tubo de ensaio (16 x 100 mm) e junte:
Reagente 3 4.0 ml Recolha o eluato (Fracção HbA1c) Agitar bem e ler a absorvência (Abs) da fracção HbA1c a 415 nm contra
água destilada (AbsHbA1c)
6. Leitura de HbTOTAL
Pipetar para dentro do tubo de ensaio (16x160 mm):
Reagente 3 12.0 ml
Hemolisado 50 μl
Agitar bem e ler a absorvência (Abs) a 415 nm contra água destilada (AbsHbTOTAL)
Cálculo
%HbA1c (CYPRESS) = AbsHbA1c / (3 x AbsHbTOTAL) x100
Factor de conversão:
%HbA1c (NGSP) = 0.86 x [%HbA1c (CYPRESS)] + 0.24 NGSP = National Glycohemoglobin Standarization Program
mmol HbA1c / mol HbTOTAL (IFCC) = 0.94 x [%HbA1c (CYPRESS)] – 2.9 IFCC = International Federation of Clinical Chemistry.
Valores de referência
Intervalo normal: 4.2 – 6.2 % (CYPRESS) Diabetes bem controlada: 6.7 – 9.1 % (CYPRESS) Diabetes não controlada > 9.1 % (CYPRESS)
Estes valores são meramente referenciais. Cada laboratório deve estabelecer os seus próprios valores de referência.
Controlo de Qualidade
Os controlos do sangue são recomendados para monitorizar o desempenho dos procedimentos de ensaio. Cada laboratório deve estabelecer o seu próprio esquema de CQ e as suas próprias acções correctivas caso os controlos não correspondam às tolerâncias aceitáveis.
Características de procedimento
Escala de medida: de 4,0% (NGSP) / 20 mmol/mol (limite de detecção) a 17.0%
(NGSP) / 162 mmol/mol (IFCC) (limite de linearidade).
Precisão:
NGSP Intra-ensaio (n=20) Inter-ensaio (n=20)
Média (%) 5.7 9.2 5.7 9.2
CV (%) 0.80 0.80 2.3 1.9
IFCC Intra-ensaio (n=20) Inter-ensaio (n=20) Média
(mmol/mol)
39 77 39 77
CV (%) 1.20 1.00 3.70 2.50
Sensibilidade:
1 mmol/l HbTOTAL = 0.00905 Abs
1 mmol/l HbA1c = 1.19 Abs
Interacções
As seguintes substâncias não interferem com a determinação do HbA1c nas
concentrações indicadas: bilirrubina 60 mg/dl, triglicéridos 6 g/l e fator reumatoide <750 IU/ml. Alguns fármacos e outras substâncias poderão interferir4.
Outras variantes da hemoglobina como HbE, HbF, carbamil-Hb e acetil-Hb podem interferir com o ensaio5, 6.
Notas
1. Os valores obtidos são independentes da temperatura quando trabalhar dentro do intervalo recomendado (21 – 26°C). Quando a temperatura de trabalho ficar fora do intervalo, multiplique o valor obtido com o factor correspondente indicado nesta tabela:
Temp. de trabalho Factor
18°C 1.29
19 °C 1.18
20°C 1.12
27-30°C 0.91
2. O armazenamento de longa duração das colunas pode fazer com que a resina se grume demais, o que diminui o fluxo e o alongamento da fase de eluição. Para recuperar a eficiência de fluxo é aconselhável - 10 min. antes de começar o teste - to inverter as colunas para voltar a dissolver os conteúdos, ponha-as de novo em pé e deixe que a resina se deposite durante alguns minutos.
3. As colunas apenas podem ser utilizadas uma vez. Não reutilizar. 4. Podem surgir algumas bolhas de ar dentro da resina. A presença delas não
muda o desempenho do teste.
5. Durante o passo 5 e para cada reagente, todo o volume do reagente deve poder passar completamente através da coluna por gravidade antes de pipetar o próximo ou ir adiante. A coluna deve manter-se sempre na posição vertical. O passo 5 completo demora mais de uma hora. 6. O reagente 2 deve ser pipetado duas vezes: primeiro 200 μl e depois 2 ml
após o primeiro volume ter passado através da coluna e ter sido eliminado. Não pipetar 2.2 ml de uma só vez.
7. Use só colunas das reagentes 2 ou 3 do mesmo número de lote. Referências
1. Bisse E, Abraham EC. J Chromatolog 1985; 344:81-91
2. Tietz NW. Clinical guide to laboratory tests, 3rd ed. Saunders Co., 1999 3. N. Engl. J. Med. 1993; 329: 977-986
4. Young DS. Effects of drugs on clinical laboratory tests, 4th ed. AACC Press, 1995 5. Roberts WL et al. Clin. Chem. 2002; 48: 383-385
6. Bry L. et al. Clin Chem 2001; 47:153-163
Cypress Diagnostics: Langdorpsesteenweg 160 • 3201 Langdorp • Belgium
www.diagnostics.be • Tel: ++ 32 15 67 67 68 • e-mail: cypress@diagnostics.be