As idades das vítimas cujas amostras foram analisadas variaram entre 4 e 52 anos e a média de idade foi de 23 anos. Em 59,3% dos casos (89/150) a vítima relatou ter sido atacada por um indivíduo desconhecido, em 24,0% dos casos (36/150) foi um indivíduo conhecido, em 10,0% dos casos (15/150) o agressor foi um parente da vítima, em 5,3% dos casos (8/150) a vítima estava desacordada e não soube relatar o que aconteceu e em 1,3% dos casos (2/150) a vítima era portadora de algum transtorno psíquico e não relatou o fato. Perfis Y-STRs foram detectados em 06 (seis) amostras de conteúdo anal e em 57 (cinquenta e sete) amostras de conteúdo vaginal. Em 06 (seis) amostras foi detectada a presença de mistura de material genético proveniente de pelo menos dois homens. Até o momento, 11 suspeitos foram apresentados e os laudos, confeccionados, sendo 04 (quatro) exclusões e 07 (sete) casos com perfis Y-STRs coincidentes. As análises estatísticas foram realizadas com a utilização do banco de dados YHRD (ROEWER et al. 2001).
5 DISCUSSÃO
A observação de que em 28,6% das amostras analisadas a detecção do PSA apresentou resultados conflitantes com aqueles obtidos na quantificação de DNA masculino revela que o exame de PSA realizado, imunocromatográfico “Imun -RÁ IDO S ” p uzi p a W M -Diagnóstica, com sensibilidade de 2,5 ng/ml, não foi um bom indicativo da presença ou ausência de DNA masculino. Testes de PSA em membrana realizados por Hochmeister et al. (1999) com amostras de sêmen com diluições de até 1:1.000.000 apresentaram resultados positivos. No entanto, em amostras forenses não há como determinar a qualidade da amostra e nem sempre os resultados são favoráveis. Os níveis de PSA nos fluidos masculinos podem variar de acordo com a idade e com a ocorrência de determinados eventos na próstata e, portanto, a sua detecção não está diretamente correlacionada à quantidade de sêmen, tampouco à quantidade de material genético presente na amostra (OESTERLING et al. 1995; NIXON et al. 1997; LEIN et al. 1998).
Os resultados obtidos corroboram exercícios anteriores, como o trabalho desenvolvido por Sibille et al. (2002), que obteve amplificação com Y-STRs em 28,8% dos casos, trabalhando com 104 amostras coletadas de vítimas de estupro, em cujas análises citológicas não havia sido detectada a presença de espermatozoides. Em estudo desenvolvido com 26 amostras coletadas de crianças vítimas de estupro, nas quais a determinação do perfil genético autossômico do agressor não pôde ser revelado, devido à presença de mistura de material genético com amostra biológica da vítima, em 24 casos (sucesso de 92,3%) foi possível identificar o haplótipo de Y-STRs do autor (DELFIN et al. 2005). O trabalho citado teve como objetivo principal fornecer base para a implementação da análise de Y-STRs na rotina de Laboratórios forenses das Filipinas.
A análise de Y-STRs em amostras coletadas de vítimas de crimes sexuais pode ser utilizada como prova de contato sexual com a vítima, substituindo a detecção de espermatozoides no exame citológico, quando não for possível esta visualização, com a vantagem de que com a obtenção do haplótipo de Y-STRs, pode-se, em muitos casos, determinar a autoria do crime
(PRINZ et al. 1997; HONDA et al. 1999; HALL; BALLANTYNE, 2003; ROEWER, 2009).
Nos experimentos realizados, a sensibilidade de amplificação foi maior no loco Y-STR DYS391, seguido pelos locos DYS393, DYS389I, DYS458 e DYS437 e os locos de menor eficiência foram os Y-STRs DYS392 e DYS439. De forma semelhante, Sibille et al. (2002) relata que a sensibilidade de amplificação no Y-STR DYS393 foi maior do que no DYS389. De acordo com trabalho publicado por Maiquilla et al. (2011), a ausência de amplificação foi observada mais comumente nos locos DYS19, DYS385, DYS392 e DYS428, enquanto os locos mais robustos, com maiores chances de apresentarem produtos de amplificação em perfis parciais, foram DYS391, DYS393 e DYS437. O mesmo trabalho relata que a comparação entre o tamanho dos amplicons e o sucesso na amplificação não mostrou diferença significante (MAIQUILLA et al. 2011). Dentre os fatores responsáveis por essa diferença em rendimento no produto de amplificação, o mais importante é a hibridização dos iniciadores (GORELENKOV et al. 2001; BEN ZAKOUR et al. 2004).
Após a realização deste trabalho, considerando o elevado sucesso na identificação de perfis de estupradores na ausência de espermatozoides, e o crescente número de indivíduos vasectomizados no Brasil, recomenda-se que os Laboratórios Forenses optem pela realização de exames de DNA em todas as amostras coletadas de vítimas de estupro cujo histórico, de acordo com depoimentos de vítimas e testemunhas, denote evidências de penetração peniana por via oral, vaginal ou anal, ainda que a pesquisa de espermatozoides na análise citológica das referidas amostras tenha apresentado resultado negativo. A ausência de espermatozoides pode ser explicada por uma série de fatores, no entanto, outros tipos de células masculinas tais como leucócitos e células epiteliais provenientes da uretra e do ducto ejaculatório podem ser utilizadas para a determinação de autoria em muitos casos de estupro (HALL; BALLANTYNE, 2003; GUSMAO et al. 2006). Segundo Maiquilla et al. (2011), a tipagem de Y-STRs em amostras provenientes de crimes sexuais deve ser realizada sempre, ainda que a vítima tenha sido submetida a processo de higiene íntima, e, em casos com crianças, mesmo que não haja relato de ejaculação interna, desde que a amostra tenha sido coletada dentro do intervalo de até 72 horas após o fato.
O trabalho realizado por Sibille et al. (2002) considera que há possibilidade de detecção de Y-STRs em amostras com mistura de DNA masculino/feminino até a proporção de 1:2.000 e outros pesquisadores relataram sucesso com proporções de até 1:4.000 (PRINZ et al. 1997). Entretanto, o presente trabalho mostrou ser possível obter até 100% de amplificação nos 16 locos Y-STRs em amostras com mistura de DNA feminino/masculino até a proporção de 1:12.000. A performance na amplificação dos Y-STRs em amostras com mistura de DNA é influenciada pelo desenho dos iniciadores na PCR múltipla, sua sensibilidade e a concentração do menor componente (ROEWER, 2009). Na maior parte dos casos ora analisados, o sucesso da amplificação dos Y-STRs esteve associado à concentração do DNA de origem masculina presente na amostra, independentemente da proporção em relação à quantidade de DNA feminino presente na mistura de material genético.
A repetição do procedimento de quantificação das amostras minimiza erros de pipetagem ou outros erros associados ao processo de quantificação em tempo real.
Apesar destes resultados animadores com a análise de Y-STRs, a extração diferencial (GILL et al. 1985) e amplificação para STRs autossômicos deve ser a primeira opção, sempre que a análise citológica atestar que há espermatozoides íntegros na amostra, em quantidade suficiente para a obtenção do perfil de STRs autossômicos do agressor, devido à maior precisão na identificação do autor (CERRI et al. 2003; JEFFREYS, 2005; BUTLER, 2007; PRINZ et al. 2007). Entretanto, mesmo nessa situação, a amplificação das amostras de DNA provenientes de vítimas de estupro para Y-STRs deve ser uma rotina, para permitir a detecção de perfis masculinos presentes na amostra em quantidade insuficiente para a amplificação de STRs autossômicos, devido à competição com material genético proveniente da vítima e/ou de possíveis parceiros consentidos, misturados na fração não espermatozoide (PRINZ et al. 1997; SIBILLE et al. 2002; CERRI et al. 2003; DELFIN et al. 2005; ROEWER, 2009).
O fato de não ser detectada a presença de DNA de origem masculina nas dez amostras constituintes do grupo controle, que não seriam selecionadas para exame de acordo com os critérios de seleção, denota a confiabilidade do
método escolhido para a seleção das amostras a serem analisadas, baseado nos depoimentos das vítimas.
A quantificação do material genético se mostrou uma eficiente ferramenta de triagem para definir quais amostras deveriam ser amplificadas para STRs do Cromossomo Y, visto que nas amostras com resultado negativo para a presença de DNA masculino, selecionadas aleatoriamente e amplificadas para Y-STRs, não foram observados produtos de amplificação. Das dez amostras selecionadas, duas apresentaram produtos de amplificação, embora com haplótipos parciais, as quais quando submetidas novamente ao processo de quantificação do material genético de origem masculina, apresentaram resultados positivos. A mudança no resultado da quantificação em 20% das amostras selecionadas para o grupo controle reforça orientações dos fornecedores dos kits de quantificação, que recomendam a realização do processo de quantificação em duplicata, para evitar possíveis erros de pipetagem.
Em 2010 foi realizado no Laboratório do Instituto de Pesquisa de DNA Forense da Polícia Civil do Distrito Federal um exame cuja análise de Y-STRs serve de modelo para casos semelhantes no futuro. Uma amostra coletada de uma peça de vestuário (calcinha) de uma vítima de estupro, com resultado positivo para a presença de espermatozoides, foi analisada e o perfil genético de STRs autossômicos obtido na fração espermatozoide foi comparado com o padrão alélico do suspeito apresentado, denotando a exclusão deste homem como produtor do material genético proveniente dos espermatozoides presentes na referida amostra. Um suabe com amostra de conteúdo vaginal coletado da mesma vítima havia sido recentemente analisado, como parte do projeto que gerou este trabalho, no qual, a pesquisa citológica de espermatozoides resultara negativa, mas foi detectada a presença de material genético de origem masculina e o padrão de Y-STRs demonstrou a presença de mistura de material genético, constituída de pelo menos dois haplótipos. O DNA obtido da fração não-espermatozoide da amostra coletada da calcinha foi submetido à amplificação para Y-STRs e o padrão obtido foi exatamente o mesmo observado na amostra de conteúdo vaginal analisada. A vítima, convocada para a coleta de amostra-referência, informou que havia mantido relação sexual com o marido na véspera da ocorrência de estupro. O marido da
vítima forneceu amostra-referência para comparação e foi possível concluir que o perfil genético de STRs autossômicos observado na fração espermatozoide era coincidente com o padrão alélico do marido e os alelos dos marcadores do cromossomo Y observados nas amostras questionadas, coletadas do suabe vaginal e da calcinha, correspondiam à perfeita combinação entre os haplótipos de Y-STRs identificados nas amostras coletadas do marido e do suspeito. O suspeito, cujo perfil genético de Y-STRs fora visualizado apenas na mistura de material genético observada na fração não-espermatozoide obtida da amostra coletada da calcinha e na amostra obtida do suabe com resultado negativo para espermatozoides, seria excluído se a análise fosse realizada apenas na fração-espermatozoide obtida da calcinha.
Recentemente a comunidade científica forense discute novas técnicas para a resolução de casos de estupro em que não foi detectada a presença de espermatozoides e a extração diferencial não pode ser realizada (GILL et al. 1985). Trata-se de um método desenvolvido para a identificação e o isolamento de células masculinas presentes em uma mistura com células femininas e combina hibridização fluorescente in situ (FISH) com microdissecção a laser (LMD) (COLLINS et al. 1994; MURRAY et al. 2007; VANDEWOESTYNE; DEFORCE, 2010). Por esse método, é possível identificar e isolar células masculinas não-espermatozoides presentes em amostras coletadas de vítimas de estupro, em que não foi detectada a presença de espermatozoides e que testes presuntivos tenham detectado a presença de sêmen, buscando obter perfis de STRs autossômicos para comparação com bancos de dados genéticos (MARTIN et al. 2001).
Em um caso forense relatado com sucesso após a aplicação das técnicas de FISH e LMD, a amostra constituída de suabe com impregnação de conteúdo vaginal coletado de uma vítima de estupro foi obtida poucas horas após o intercurso sexual e apresentou resultados positivos extremamente fortes para os testes de PSA e Fosfatase ácida, sendo obtido um padrão de STRs autossômicos, com mistura de DNA masculino e feminino, em que o suspeito apresentado foi excluído (MCALISTER, 2011). A aplicação da técnica, no entanto, é limitada a um número muito reduzido de casos forenses, pois requer que o exame seja realizado até 24 após o intercurso sexual, que as células estejam intactas e que no mínimo 70 células sejam recolhidas para o
sucess a amp ifi açã , qu v a iza a m p im n pa a “ w py numb ”, m 34 i CR m 3 p i a a (FORSTER et al. 2008; BUDOWLE et al. 2009).
Um trabalho mais recente utilizando FISH e LMD relata sucesso na obtenção de perfis autossômicos com apenas 30 espermatozoides e com 15 células epiteliais. As amostras utilizadas no estudo, entretanto, foram coletadas in loco e não em suabes relacionados a ocorrências criminais (MEREDITH et al. 2011). Além disso, trabalhando com amostras reais, com mistura de células masculinas e femininas, há um grande o risco de obtenção de mistura com o perfil da vítima, devido à proximidade entre as células. Segundo McAlister (2011), a técnica de microdissecção a laser (LMD) permite o isolamento de células únicas, no entanto, o recolhimento de células adicionais indesejáveis pode ocorrer, devido à proximidade entre as células.
Estudos recentes realizados com Y-STRs estão modificando a ideia de que todos os homens pertencentes à mesma linhagem patrilinear, ainda que separados por mais de uma geração, compartilham o mesmo haplótipo de Y, pelo menos para alguns locos, denominados RM Y-STRs (do inglês rapidly mutating Y-STRs), descobertos durante uma pesquisa sobre mutações nos Y- STRs em que foram avaliadas as taxas de mutação de 186 STRs com 1996 pares pai/filho reconhecidamente comprovados por análises com STRs autossômicos (BALLANTYNE et al. 2010). Este estudo descobriu 13 Y-STRs com taxas de mutação extremamente maiores do que aquelas observadas nos Y-STRs comumente utilizados para análises forenses (GOEDBLOED et al. 2009). A ocorrência de taxas de mutação tão elevadas deve-se ao pequeno tamanho das unidades de repetição, ao alto número dessas unidades nos alelos e à elevada complexidade das sequências-motivo presentes nesses RM Y-STRs. Os autores afirmam que a descoberta desses marcadores altamente variáveis no cromossomo Y permitirá a mudança de categoria da análise de Y- STRs de atual diferenciação de linhagens para futura identificação individual de homens pertencentes à mesma linhagem ( BALLANTYNE et al. 2010).
Com esta nova perspectiva, a análise de Y-STRs em amostras coletadas de vítimas de estupro que não apresentem espermatozoides deverá, em futuro próximo, definir com precisão individual a autoria de incontáveis crimes de estupro.
6 CONCLUSÃO
Considerando o objetivo principal deste trabalho, de verificar a validade de se implantar na rotina de um laboratório de genética forense a análise molecular de amostras coletadas de vítimas de estupro, nas quais não foi detectada a presença de espermatozoides, a conclusão é de que a utilização de Y-STRs é uma ferramenta poderosa para a identificação da autoria nesses casos. Faz-se necessária, no entanto, uma análise detalhada dos depoimentos prestados pelas vítimas e testemunhas envolvidas, no sentido de esclarecer as circunstâncias e fatos relativos à ocorrência, buscando encontrar indícios de que o autor possa ter contribuído com material biológico para a produção da amostra em questão.
Após a extração de DNA das amostras selecionadas pelos critérios já descritos, antes de se proceder à amplificação para os Y-STRs, deve-se primeiramente quantificar o DNA humano e masculino presente na amostra, lembrando que este procedimento deve ser feito sempre em duplicata. De acordo com os resultados observados neste trabalho, a não detecção de DNA masculino em amostras sem espermatozóides coletadas de vítimas de estupro, após confirmação por repetição do procedimento de quantificação, pode conduzir ao encerramento do exame genético.
Considerando que as amostras coletadas de vítimas de estupro no Distrito Federal, cuja pesquisa citológica de espermatozoides apresentava resultado negativo não seriam submetidas à análise genética, de acordo com os procedimentos de rotina em vigor até o ano de 2009, o fato de detectarmos a presença de DNA de origem masculina em 43% dos casos selecionados para este trabalho mudou a rotina do Instituto de Pesquisa de DNA Forense da Polícia Civil do Distrito Federal, que passou a analisar a parcela dessas amostras que atendam aos critérios estabelecidos, desde meados do ano de 2010, gerando a possibilidade de identificar estupradores com a realização dos procedimentos de extração de DNA, quantificação de DNA de origem masculina e amplificação dessas amostras com Y-STRs.
7 REFERÊNCIAS
ACIERNO, R. et al. Risk factors for rape, physical assault, and posttraumatic stress disorder in women: examination of differential multivariate relationships. Journal of
anxiety disorders, v.13, n.6, p.541-563. 1999.
AGUIAR, G. Vasectomia. 2010. Disponível em: <http://www.vasectomia.med.br>. Acesso em: 11 nov. 2010.
ALONSO, A. et al. Real-time PCR designs to estimate nuclear and mitochondrial DNA copy number in forensic and ancient DNA studies. Forensic Science
International, v.139, n.2-3, p.141-149. 2004.
ANDREASSON, H.; ALLEN, M. Rapid quantification and sex determination of forensic evidence materials. Journal of forensic sciences, v.48, n.6, p.1280-1287. 2003.
BALLANTYNE, K. N. et al. Mutability of Y-chromosomal microsatellites: rates, characteristics, molecular bases, and forensic implications. American journal of
human genetics, v.87, n.3, p.341-353. 2010.
BALLARD, D.J. et al. A study of mutation rates and the characterization of intermediate, null and duplicated alleles for 13 Y chromosome STRs. Forensic
Science International, v.155, p.65–70. 2005.
BEN ZAKOUR, N. et al. GenoFrag: software to design primers optimized for whole genome scanning by long-range PCR amplification. Nucleic acids research, v.32, n.1, p.17-24. 2004.
BENECKE, M. DNA typing in forensic medicine and in criminal investigations: a current survey. Die Naturwissenschaften, v.84, n.5, p.181-188.1997.
BIOSYSTEMS, A. Y-Filer Haplotype Database. 2005. Disponível em:
<http://www.appliedbiosystems.com/yfilerdatabase>. Acesso em: 30 mar. 2011.
BRYCE, L. A. et al. Mapping of the gene for the human telomerase reverse
transcriptase, hTERT, to chromosome 5p15.33 by fluorescence in situ hybridization.
BUDOWLE, B. et al. Simple protocols for typing forensic biological evidence: chemiluminescent detection for human DNA quantitation and restriction fragment length polymorphism (RFLP) analyses and manual typing of polymerase chain reaction (PCR) amplified polymorphisms. Electrophoresis, v.16, n.9, p.1559-1567. 1995.
BUDOWLE, B.; EISENBERG, A. J.; VAN DAAL, A. Validity of low copy number typing and applications to forensic science. Croatian medical journal, v.50, n.3, p.207-217. 2009.
BUTLER, J. M. Forensic DNA Typing: Biology, Technology and Genetics of STR
Markers, Elsevier Academic Press. 2ªed. New York. 2005.
______ . Short tandem repeat typing technologies used in human identity testing.
BioTechniques, v.43, n.4, p.2-5. 2007.
BUTLER, J. M. et al. Forensic DNA typing by capillary electrophoresis using the ABI Prism 310 and 3100 genetic analyzers for STR analysis. Electrophoresis, v.25, n.10-11, p.1397-1412. 2004.
______ . A novel multiplex for simultaneous amplification of 20 Y chromosome STR markers. Forensic Science International, v.129, n.1, p.10-24. 2002.
COMEY C. et al. Extraction strategies for amplified fragment length polymorphism analysis. J. Forensic Sci, v.39, p.1254–1269. 1994.
CAMPBELL, R. The psychological impact of rape victims. The American
psychologist, v.63, n.8, p.702-717. 2008.
CERRI, N. et al. Mixed stains from sexual assault cases: autosomal or Y-
chromosome short tandem repeats? Croatian medical journal, v.44, n.3, p.289-292. 2003.
CHATTERJI, S.; PACHTER, L. Reference based annotation with GeneMapper.
Genome biology, v.7, n.4, p.29. 2006.
CLARK, S. E.; GODFREY, R. D. Eyewitness identification evidence and innocence risk. Psychonomic bulletin & review, v.16, n.1, p.22-42. 2009.
COLLINS, K. A. et al. Identification of sperm and non-sperm male cells in
cervicovaginal smears using fluorescence in situ hybridization: applications in alleged sexual assault cases. Journal of forensic sciences, v.39, n.6, p.1347-1355. 1994.
COLLINS, P. J. et al. Developmental validation of a single-tube Amplification of the 13 CODIS STR Loci, D2S1338, D19S433, and amelogenin: The AmpFSTR® Identifiler® PCR Amplification Kit. Journal of forensics siences, v.49, n.6, p.1265- 1277. 2004
COOPER, G. M. The Cell, A Molecular Approach. Sunderland (MA): Sinauer Associates. 2000.
CULHANE, J. F. et al. Evaluation of semen detection in vaginal secretions:
comparison of four methods. American journal of reproductive immunology, v.60, n.3, p.274-281. 2008.
D'AMATO, M. E.; BAJIC, V. B.; DAVISON, S. Design and validation of a highly discriminatory 10-locus Y-chromosome STR multiplex system. Forensic science
international. Genetics, v.5, n.2, p.122-125. 2011.
DARVES-BORNOZ, J. M. Rape-related psychotraumatic syndromes. European
journal of obstetrics, gynecology, and reproductive biology, v.71, n.1, p.59-65.
1997.
DAVIES, A.; WILSON, E. The persistence of seminal constituents in the human vagina. Forensic science, v.3, n.1, p.45-55. 1974.
DEKAIRELLE, A. F.; HOSTE, B. Application of a Y-STR-pentaplex PCR (DYS19, DYS389I and II, DYS390 and DYS393) to sexual assault cases. Forensic Science
International, v.118, n.2-3, p.122-125. 2001.
DELFIN, F. C. et al. Y-STR analysis for detection and objective confirmation of child sexual abuse. International journal of legal medicine, v.119, n.3, p.158-163. 2005.
DEPO/PCDF. Ocorrências de Estupro no Distrito Federal. Relatórios Anuais da Criminalidade publicados pela Divisão de Estatística e Planejamento Operacional (DEPO). 2011. Disponível em: <http://www.pcdf.gov.br>. Acesso em: 13 abr. 2011.
DISTECHE, C. M. Y Chromosome Infertility, in R. A. Pagon et al. (Ed).
GeneReviews. Seattle (WA). 1993.
DREZETT, J. Estudo de fatores relacionados com a violência sexual contra
crianças, adolescentes e mulheres adultas. 2000. Centro de Referência da Saúde
da Mulher e de Nutrição, Alimentação e Desenvolvimento Infantil, São Paulo. 2000.
DREZETT, J. et al. Study of mechanisms and factors related to sexual abuse in female children and adolescents. Jornal de pediatria, v.77, n.5, p.413-419. 2001.
DUEWER, D. L. et al. NIST mixed stain studies #1 and #2: interlaboratory comparison of DNA quantification practice and short tandem repeat multiplex
performance with multiple-source samples. Journal of forensic sciences, v.46, n.5, p.1199-1210. 2001.
______ .NIST mixed stain study 3: signal intensity balance in commercial short tandem repeat multiplexes. Analytical chemistry, v.76, n.23, p.6928-6934. 2004.
EDWARDS, A. et al. DNA typing and genetic mapping with trimeric and tetrameric tandem repeats. American journal of human genetics, v.49, n.4, p.746-756. 1991.
ELLEGREN, H. Heterogeneous mutation processes in human microsatellite DNA sequences. Nature genetics, v.24, n.4, p.400-402. 2000.
ERLICH, H. A.; ARNHEIM, N. Genetic analysis using the polymerase chain reaction.
Annual review of genetics, v.26, p.479-506. 1992.
EVERS, H. et al. Investigative strategy for the forensic detection of sperm traces.