Pró-Reitoria de Pós Graduação e Pesquisa
Programa de Pós Graduação “
Stricto Sensu
" em
Ciências Genômicas e Biotecnologia
ANÁLISE MOLECULAR COM Y-STRS EM
AMOSTRAS BIOLÓGICAS SEM
ESPERMATOZOIDES
COLETADAS DE VÍTIMAS DE ESTUPRO
Autora: Karla Angélica Alves de Paula
Orientador: Prof. Dr. Rinaldo Wellerson Pereira
ANÁLISE MOLECULAR COM Y-STRS EM AMOSTRAS BIOLÓGICAS SEM ESPERMATOZOIDES COLETADAS DE VÍTIMAS DE ESTUPRO
Dissertação apresentada no Programa de Pós-Graduação Stricto Sensu em Ciências
Genômicas e Biotecnologia da Universidade Católica de Brasília, como requisito para a obtenção de Título de Mestre em Ciências Genômicas e Biotecnologia.
Orientador: Prof. Dr. Rinaldo Wellerson Pereira
Ficha elaborada pela Biblioteca de Pós-Graduação da UCB P324a PAULA, Karla Angélica Alves de
Análise molecular com Y-STRSem amostras biológicas sem espermatozoides
coletadas de vítimas de estupro. / Karla Angélica Alves de Paula – 2011.
78f. : il.; 30 cm
Dissertação (mestrado) – Universidade Católica de Brasília, 2011.
Orientação: Rinaldo Wellerson Pereira
1. Espermatozoides. 2. Estupro. 3. DNA. 4. Biotecnologia. I. Pereira, Rinaldo Wellerson, orient. II. Título.
Dedico este trabalho ao meu pai, José do Rêgo Alves, in memorian, por ser a minha melhor
AGRADECIMENTOS
“A mente que se abre a uma nova ideia jamais voltará ao seu tamanho original”.
RESUMO
Referência: DE PAULA, Karla. Análise molecular com Y-STRs em amostras biológicas sem espermatozoides coletadas de vítimas de estupro. 2011. 78 folhas. Dissertação de Mestrado em Ciências Genômicas e Biotecnologia da Universidade Católica de Brasília. Brasília, 2012.
A detecção de espermatozoides em amostras coletadas de vítimas de estupro confirma a ocorrência do ato sexual, enquanto a sua ausência normalmente encerra a investigação biológica no crime em questão, deixando uma lacuna quanto è determinação da autoria do delito e até mesmo quanto à tipificação do crime. Em crimes sexuais, no entanto, existe a possibilidade de que o material vaginal coletado não contenha espermatozoides do agressor (por exemplo, em quadro clínico de azoospermia, utilização de preservativo, prática de coito interrompido, etc.), mas apresente células de origem masculina, como células epiteliais ou leucócitos, presentes no líquido seminal. Nesses casos, não existe a possibilidade de separar o material genético de origem masculina por meio da técnica de extração diferencial e a identificação da autoria pela análise do DNA fica prejudicada, pois na amplificação para STRs autossômicos em amostras com mistura de DNA com proporções iguais ou superiores a 50:1, o perfil genético do doador minoritário normalmente não é visualizado. Técnicas moleculares usando Y-STRs representam uma poderosa ferramenta para a identificação de perfis masculinos nesses casos. Com o objetivo de avaliar a amplificação efetiva de Y-STRs em amostras com mistura de DNA masculino e feminino, visando relacionar os resultados obtidos com o histórico de cada caso e definir uma estratégia de ação em casos semelhantes no futuro, seiscentas ocorrências de estupro cujas amostras de conteúdo vaginal apresentaram resultado negativo para a pesquisa de espermatozoides no exame citológico, foram analisadas. Foram selecionados 150 casos de vítimas femininas em que o histórico apontava para a ocorrência de estupro com possível penetração e/ou ejaculação, cuja comunicação do fato fora realizada até 4 dias após a ocorrência do evento delituoso. Após a quantificação, verificou-se que em 43% dos casos selecionados foi detectada a presença de DNA de origem masculina, sendo que em 83% das amostras a proporção de DNA feminino em relação à quantidade de DNA masculino foi superior a 100:1. As amostras com presença de DNA de origem masculina foram amplificadas para 16 Y-STRs (DYS456, DYS389 I, DYS389 II, DYS392, DYS393, DYS438, DYS390, DYS458, DYS19, DYS385, DYS391, DYS439, DYS635, Y_GATA_H4, DYS437 e DYS448), sendo obtidos quatro tipos de perfis, definidos de acordo com o número de locos Y-STRs com produto de amplificação, variando de haplótipo insuficiente (até 5 locos Y-STRs) ao haplótipo completo. A detecção do antígeno prostático específico (PSA) foi realizada em todas as amostras selecionadas e os resultados obtidos são conflitantes com os resultados da quantificação de DNA masculino em 28,6% das amostras analisadas. Os resultados obtidos corroboram exercícios realizados anteriormente e mudaram a rotina do Instituto de Pesquisa de DNA Forense da Polícia Civil do Distrito Federal, quanto à definição pela análise genética de amostras coletadas de vítimas de estupro, na ausência de espermatozoides.
ABSTRACT
Reference: DE PAULA, Karla. Molecular analysis with Y-STRs in biological samples without sperm cells collected from rape victims. 2011. 78 sheets. Master dissertation in Genomic Sciences and Biotechnology. Universidade Católica de Brasília. Brasília, 2012.
The detection of sperm cells in samples collected from victims of sex crimes confirms the occurrence of the sexual act, while its absence usually closes biological research, leaving a gap as to the authorship of the crime and even how to define whether there was a crime. In sex crimes, however, there is the possibility that the collected vaginal material does not
contain rapist’s sperm cells (e.g., azoospermy, condom use, practice of coitus interruptus), but
other male cells like epithelial cells or leukocytes may be present in seminal fluid. In these cases, the isolation of male cells by differential extraction technique is not possible and the identification of authorship by DNA analysis is impaired, since the amplification for authosomal STRs in samples with a mixture of DNA with ratios equal to or greater to 50:1, the genetic profile of minority donors is not commonly displayed. Molecular techniques using Y-STRs are a powerful tool for the identification of male profiles in these cases. In order to evaluate the effective amplification of Y-STRs in samples with mixture of male and female DNA, looking for relate the results obtained with the history of each case and devise a strategy for action in similar cases in the future, six hundred incidents of rape victims whose samples were negative in study sperms cells were analyzed. We selected 150 female victims’
cases when the history pointed to possible occurrence of rape with penetration and ejaculation or, whose communication was actually held up to 4 days after the criminal fact. Following the quantification, it was found that in 43% of selected cases was detected the presence of male DNA source, and in 83% of the samples the proportion of female DNA in relation to the amount of male DNA was greater than 100:1. The samples with male DNA were amplified for 16 Y-STRs (DYS456, DYS389 I, DYS389 II, DYS392, DYS393, DYS438, DYS390, DYS458, DYS19, DYS385, DYS391, DYS439, DYS635, Y_GATA_H4, DYS437 and DYS448) and the profiles obtained were classified into four types, defined according to the number of Y-STRs loci with amplification product, ranging from insufficient haplotype (up to five Y-STRs loci) to complete haplotype. Detection of prostate specific antigen (PSA) was performed in all selected samples and the results are conflicting with the quantification of male DNA in 28.6% of them. These results confirm previous work performed by other authors and moreover changed the routine of the Instituto de Pesquisa de DNA Forense of Civil Police of the Federal District in Brazil, in order to define whether or not the genetic analysis of samples collected from rape victims in cases without sperm cells.
SUMÁRIO
1 Introdução ... 11
1.1. Crimes sexuais ... 11
1.2. Identificação de autoria em crimes de estupro ... 14
1.3. O DNA em genética forense ... 15
1.4. Y-STRs ... 22
1.5. Quantificação do material genético ... 25
1.6. Prováveis causas para a ausência de espermatozoides em amostras de crimes sexuais ... 28
1.7. Procedimentos utilizados nos laboratórios forenses para a detecção de sêmen em amostras de crimes sexuais ... 30
1.7.1. Métodos de detecção de sêmen em amostras de crimes sexuais ... 30
1.7.2. Procedimentos utilizados para a detecção de sêmen em laboratórios forenses brasileiros ... 32
2 Objetivos ... 33
2.1. Objetivo Geral ... 33
2.2. Objetivos específicos ... 33
3 Material e Métodos ... 34
3.1. Amostras ... 34
3.1.1. Processo de seleção ... 34
3.2. Extração do material genético ... 35
3.3. Quantificação do DNA de origem humana e masculina ... 36
3.4. Amplificação do DNA ... 36
3.5. Detecção dos Produtos de PCR ... 37
3.6. Análise dos haplótipos ... 38
3.7. Detecção do Antígeno Prostático Específico (PSA) ... 38
4 Resultados ... 40
4.1. Detecção de DNA masculino presente nas amostras ... 40
4.2. Produtos de amplificação obtidos com STRs autossômicos e amelogenina ... 40
4.3. Produtos de amplificação obtidos com Y-STRs ... 41
4.3.1. Haplótipo Y-STR completo ... 43
4.3.2. Haplótipo Y-STR incompleto ... 44
4.3.3. Haplótipo Y-STR parcial ... 45
4.4. Distribuição das amostras quanto ao número de locos Y-STRs
amplificados em relação à quantidade de DNA ... 47
4.5. Distribuição das amostras quanto ao número de locos Y-STRs amplificados em relação ao tempo decorrido até a coleta do material... 47
4.6. Análise de eficiência dos Y-STRs ... 48
4.7. Detecção do Antígeno Prostático Específico (PSA) ... 48
4.8. Quantificação das amostras controle ... 49
4.9. Amplificação de amostras com resultado negativo na quantificação de DNA masculino ... 49
4.10. Características das amostras selecionadas ... 50
5 Discussão ... 51
6 Conclusão ... 57
7 Referências ... 58
Apêndice A Haplótipos Y-STRs ... 72
1 INTRODUÇÃO
1.1. CRIMES SEXUAIS
A violência contra a mulher é a mais disseminada e menos reconhecida forma de violação aos direitos humanos e representa um dos principais problemas de saúde comunitária do mundo, minando a energia, comprometendo a saúde física e mental e consumindo a auto-estima da mulher (GARCIA-MORENO, 2002; HEISE et al. 2002). A Organização Mundial de Saúde estima que 20% das mulheres do planeta serão fisicamente ou sexualmente atacadas por um homem, em algum momento de suas vidas (HAILE-MARIAM; SMITH, 1999).
Estima-se que há aproximadamente doze milhões de crimes sexuais por ano, em todo o mundo (DREZETT et al. 2001). Só nos EUA, ocorrem anualmente 683 mil estupros e na cidade de São Paulo há o registro de 42 mil estupros por ano (JUNIOR, 2011). As pessoas que sobrevivem aos traumas físicos ou psicológicos gerados por tais violências não merecem ser chamadas de vítimas e sim de sobreviventes (DREZETT, 2000; REIS et al. 2004). Segundo o Relatório Anual da Criminalidade publicado pela Divisão de Estatística e Planejamento Operacional - DEPO, em 2010 foram registradas 626 ocorrências de estupro no Distrito Federal (DEPO/PCDF, 2011). De acordo com dados fornecidos pela Secretaria Nacional de Segurança Pública - SENASP, no ano de 2010 foram registrados os seguintes números de estupros nos estados: GO, 1.066; BA, 1.862; PE, 1.793; AM, 1.030; PA, 1.278; SE, 1.206; RJ, 4.418; SP, 5.823; RS, 3.857 (SINESPJC/MJ, 2011).
A agressão sexual é um ato de violência que ocorre, por definição, contra a vontade da vítima, que é forçada a praticar ou permitir atos sexuais por via genital, oral ou anal, muitas vezes envolvendo agressão, abuso e degradação. O atacante controla a situação, pelo uso da força física, ameaças de danos e intimidação. A maioria das vítimas percebe que sua sobrevivência depende da sua submissão ao infrator e às suas demandas (HEWITT, 1980).
agressor do sexo masculino (REIS et al. 2004). Acredita-se que em nossa sociedade o abuso sexual seja tão comum quanto o grau de supremacia masculina existente. O abuso sexual é considerado uma violência de gênero e corporifica a sexualidade exercida como forma de poder (HAILE-MARIAM; SMITH, 1999; DREZETT, 2000; HEISE et al. 2002).
A violência sexual é uma ocorrência súbita, inesperada e imprevisível. A vítima depara-se com uma situação de risco de vida que ela é incapaz de resolver de forma eficaz. Seus métodos habituais de lidar com ameaças e conduzir as relações interpessoais falham. A ocorrência de estupro é uma violação ao seu físico, às suas crenças básicas e às suas suposições sobre o seu ambiente, seus relacionamentos com outras pessoas e consigo mesma, podendo gerar graves efeitos psicológicos (HEWITT, 1980; DARVES-BORNOZ, 1997; CAMPBELL, 2008; JORDAN et al. 2010). A forma como a vítima lida com o trauma do estupro é dependente de vários fatores, incluindo a sua força pessoal, a sua rede de apoio social, a sua fase no ciclo da vida e a forma como ela é tratada após o fato (HEWITT, 1980; DREZETT, 2000).
Quando um indivíduo é submetido a um estresse extremo, os mecanismos psicológicos são evocados na tentativa de lidar com essa situação. Se o estresse é poderoso, então os mecanismos de defesa devem ser igualmente poderosos. Assim, a vítima de estupro pode ter um choque emocional que acarreta um senso exagerado de irrealidade e distanciamento (HEWITT, 1980; CAMPBELL, 2008).
vítimas de estupro desenvolvem transtornos de sexualidade ou transtornos psicológicos pós-traumáticos e cerca de 18% das sobreviventes têm pensamentos suicidas (DARVES-BORNOZ, 1997; ACIERNO et al. 1999; Junior, 2011).
A incidência real deste tipo de crime não é fácil de mensurar, visto que os dados estatísticos são subestimados devido aos aspectos sociais, psíquicos e biológicos envolvidos (DREZETT, 2000). Estudo realizado nos Estados Unidos conclui que o estigma do estupro persiste e as vítimas têm uma grande preocupação em relação à divulgação do fato de terem sido estupradas (ACIERNO et al. 1999). A esse respeito, os órgãos de justiça devem primar pela confidencialidade dos fatos e a preservação da privacidade das vítimas de crimes sexuais. Os padrões observados de denúncia revelam que a queixa é mais frequente quando o autor é um desconhecido (ACIERNO et al. 1999). O que se observa é que a denúncia de crimes sexuais cometidos por conviventes ou aparentados normalmente ocorre depois de um longo período de abuso, principalmente se as vítimas são crianças ou adolescentes (REIS et al. 2004). Em alguns casos, depois de prolongado período de impunidade, o autor relaxa nas precauções para não ser flagrado e o ato delituoso é testemunhado por outro parente, que relata o caso à Polícia.
O perfil mais comum da vítima de estupro, segundo estudo desenvolvido nos Estados Unidos (KUHN et al. 1999), envolve a vulnerabilidade. A maioria das mulheres estupradas analisadas apresentava baixa estatura e baixo peso, algumas eram deficientes mentais e muitas, menores de 14 anos, e a gratificabilidade, a maioria das mulheres eram jovens e fisicamente saudáveis. Fatores de natureza sócio-econômica também interferem, sendo constatado no trabalho citado que a vítima quase sempre estivera andando a pé, desacompanhada, em locais de pouco movimento e em horário noturno, embora este fator talvez esteja mascarado, pela sub-notificação dos casos de estupro. Segundo Jordan e colaboradores, no entanto, a ocorrência de crimes sexuais está mais relacionada a fatores culturais, sociais e econômicos do que a aspectos pessoais, tanto da vítima como do agressor (JORDAN et al. 2010).
e/ou atentado violento ao pudor regularmente matriculadas no Serviço de Atenção Integral à Mulher Sexualmente Vitimada do Centro de Referência da Saúde da Mulher e de Nutrição, Alimentação e Desenvolvimento Infantil, nas crianças houve predomínio de agressores conhecidos (84,5%), principalmente aqueles do núcleo familiar ou com elas aparentados. Nas adultas destacou-se o agressor com o qual mantinham relacionamento afetivo e/ou sexual no momento da violência ou anteriormente a ela (25,2%). O morador da vizinhança foi o agressor mais frequente entre adolescentes (27,6%) e adultas (27,9%) e o segundo agressor mais frequente entre crianças (16,5%). O crime sexual ocorreu durante atividades cotidianas e em espaços públicos, nas adolescentes (78,2%) e nas adultas (82,9%). Entre as crianças, a violência sexual foi perpetrada, principalmente, dentro de espaços privados (70,5%) (DREZETT, 2000; DREZETT et al. 2001).
1.2. IDENTIFICAÇÃO DE AUTORIA EM CRIMES DE ESTUPRO
A identificação de autoria é uma das questões mais importantes na criminalística e, para este fim, vítimas e eventuais testemunhas podem ser convocadas para prestar declarações sobre a identificação do autor do crime em duas fases do processo judicial (WELLS; OLSON, 2003). Na polícia, vítimas e testemunhas poderão examinar retratos de criminosos, fazer o auto de reconhecimento ou prestar declarações sobre o fato, contribuindo para a feitura do retrato falado do agressor. Na fase de julgamento, o juiz avaliará as declarações prestadas pela vítima ou testemunha, verificando as circunstâncias da identificação do suspeito.
A maioria das pessoas é capaz de reconhecer centenas de rostos vistos anteriormente a partir de encontros pessoais ou através dos meios de comunicação, entretanto, os processos de percepção e memória têm limitações próprias e sofrem influência de outros processos cognitivos como a atenção, o temperamento e os aspectos da personalidade, as expectativas do grupo social a que pertence e a linguagem utilizada (PINTO, 1986). Devido às limitações funcionais e estruturais do sistema cognitivo, há a possibilidade de os dados sensoriais serem falíveis e a memória imprecisa (WELLS; OLSON, 2003).
dados são assimilados pelas testemunhas que, ao serem questionadas sobre o fato, fornecem depoimentos acrescentando, muitas vezes, as informações pós-evento, como se estas tivessem sido realmente presenciadas (LINDSAY, 2004). É consenso que testemunhas desenvolvam falsas memórias com eventos sugeridos, o que ocasiona uma fonte de erros nos relatos. A memória humana não se limita apenas ao registro de fatos ocorridos, há registros que são resultado de processos dedutivos, ocasionados por perguntas ou por informações obtidas entre a ocorrência do crime e o momento das declarações prestadas (PINTO, 1986; LINDSAY, 2004).
Segundo estudos simulados, nos quais foram detectados erros no reconhecimento de faces, é possível que as testemunhas oculares em situações reais cometam erros no reconhecimento do autor, visto que o mesmo mecanismo básico de memória revelado nas pesquisas pode também levar a erros em uma situação real (KERSTEN; EARLES, 2010). O reconhecimento visual é a principal causa de erros em condenações nos Estados Unidos,
p n n a mai 75% a vi p p j “Inn n ”,
que visa corrigir erros judiciais pela análise do ácido desoxirribonucleico (DNA) de amostras relacionadas a casos julgados cujos réus foram condenados com base em provas não científicas (WELLS; OLSON, 2003; CLARK; GODFREY, 2009).
A análise de moléculas de ácido desoxirribonucleico (ADN ou DNA, em inglês: deoxyribonucleic acid) de amostras relacionadas a crimes vem trazer cientificidade ao processo de determinação de autoria em delitos cujos autores deixam vestígios biológicos, especialmente, nos crimes sexuais, que comumente envolvem a liberação de fluidos biológicos do autor durante o ato delituoso. A análise genética não se permite distorcer por quaisquer costumes ou experiências anteriores, apenas revela o padrão alélico do indivíduo que produziu a amostra biológica encontrada no local de crime ou no próprio corpo da vítima. O DNA representa, portanto, a testemunha genética do fato delituoso (GILL et al. 1985; BENECKE, 1997; EVETT; WEIR, 1998).
1.3. O DNA EM GENÉTICA FORENSE
acabara de decifrar um método de identificação humana por meio da análise da molécula de DNA (JEFFREYS et al. 1985), fora chamado para resolver um problema de conflito entre uma família e as autoridades britânicas que impediam a entrada de um jovem inglês, filho de pai Ganense, alegando que o garoto havia falsificado um passaporte e seria sobrinho e não filho da sua verdadeira mãe, Christiana Sarbah. Pelo exame genético, Jeffreys conseguiu provar que o garoto não só era filho de Sarbah, como também compartilhava a mesma origem paterna de suas irmãs (JEFFREYS et al. 1985; LEWIN, 1986).
O ácido desoxirribonucleico (DNA) armazena as informações hereditárias que definem características dos seres vivos e são transmitidas de uma geração a outra. Os ácidos nucléicos são moléculas poliméricas formadas por uma unidade básica, o nucleotídeo. Cada nucleotídeo do DNA é formado por um grupo fosfato, um açúcar de cinco carbonos (2-desoxirribose) e um composto cíclico denominado base nitrogenada, que pode ser uma purina (adenina (A) e guanina(G)) ou uma pirimidina (citosina (C) e timina (T)). Embora o alfabeto genético seja constituído por apenas quatro letras, uma enorme quantidade de informações pode ser armazenada devido às elevadas extensões das moléculas de DNA. Uma cópia completa do genoma humano contém aproximadamente 3 bilhões de pares de nucleotídeos. A grande capacidade de estocar informação do genoma humano assegura a enorme variabilidade de características da espécie humana. O DNA é encontrado em todas as células nucleadas do ser humano, bem como nas organelas denominadas mitocôndrias (COOPER, 2000; SNUSTAD; SIMMONS, 2001).
menores. No cromossomo 1 estão armazenados 8% do DNA total de cada célula, cerca de 250 milhões de pares de base (WATSON; BERRY, 2005).
O cromossomo Y, constituído por 50 Mb, terceiro menor cromossomo humano, é encontrado apenas em indivíduos do sexo masculino. A maior parte deste cromossomo, cerca de 95%, não sofre recombinação e é transmitida diretamente do pai para os filhos homens. As mutações espontâneas são o único mecanismo de variação (COOPER, 2000; BUTLER, 2005; BALLARD et al. 2005).
A identificação genômica ou DNA fingerprinting, foi descrita inicialmente em 1985 pelo geneticista Alec Jeffreys, durante estudos com o gene da mioglobina, quando observou um pequeno trecho de DNA que se repetia continuamente. Jeffreys constatou que este DNA repetitivo estava espalhado em todo o genoma e que o número de repetições presentes em um genoma poderia diferenciar um indivíduo de outro (Jeffreys, Wilson et al. 1985). A variabilidade é gerada por alterações no número de cópias da sequência-motivo presente em um determinado loco do cromossomo. Este polimorfismo foi denominado VNTR (do inglês, Variable Number of Tandem Repeats) (GILL et al. 1985; WEBER, 1990).
Para a análise desses polimorfismos foram utilizadas inicialmente enzimas de restrição que atuam em sítios de clivagem do DNA localizados em regiões próximas às VNTRs, gerando um polimorfismo de comprimento dos fragmentos de restrição, RFLP (do inglês, Restriction Fragment Length Polymorphism) (JEFFREYS et al. 1985; GUSELLA, 1986; BUDOWLE et al. 1995).
Após a primeira utilização, em 1985, na resolução de um caso de imigração na Inglaterra (JEFFREYS; BROOKFIELD et al. 1985; JEFFREYS; WILSON et al. 1985), a técnica mostrou-se eficaz na análise de manchas de sangue, sêmen e pelos, vestígios comumente encontrados em cenas de crime. Desde então o teste de DNA tem sido utilizado nas investigações criminais, na identificação de pessoas, nos casos de investigação de paternidade e em estudos evolutivos e de história da ocupação humana do planeta (JEFFREYS et al. 1991; BENECKE, 1997; JEFFREYS, 2005; VERMEULEN et al. 2009).
limitações tais como o longo tempo de realização do exame, a necessidade de uma quantidade de DNA da ordem de 50 a 500 nanogramas, a dificuldade na análise de misturas (comum em amostras provenientes de cenas de crime) e a dificuldade de automação (BUTLER, 2005). Por este motivo, a utilização de sondas multi-locus foi substituída pelas sondas single-locus e na análise forense o método dos RFLPs foi substituído pela técnica de reação em cadeia da polimerase (PCR, do inglês Polymerase Chain Reaction) (JEFFREYS; WILSON et al. 1988; WEBER, 1990; ERLICH; ARNHEIM, 1992; KORETH et al. 1996).
Atualmente, a técnica mais utilizada para identificação humana analisa regiões microssatélites constituídas por repetições curtas, de 2 a 6 nucleotídeos, que se repetem em bloco em uma determinada região do DNA, conhecidas pela sigla STR (do inglês, Short Tandem Repeats) (EDWARDS et al. 1991; HOCHMEISTER, 1995; FAN; CHU, 2007). As sequências-motivo são específicas para cada loco, e o polimorfismo é dado pela diversidade no número de repetições dessas sequências (WEBER, 1990; EDWARDS et al. 1991; KORETH et al. 1996; THOMSONet al. 1999; ELLEGREN, 2000). A maior parte dos STRs está localizada em regiões não-codificantes, com apenas 8% localizados em regiões codificantes (ELLEGREN, 2000). Um loco STR ocorre, em média, a cada 2kb no genoma humano (LANDER et al. 2001). A diversidade alélica é gerada no momento da duplicação do material genético, quando pode ocorrer a derrapagem da fita de DNA recém-formada sobre a fita molde, ou vice-versa, gerando um novo alelo, com uma ou mais unidades de repetição da sequência-motivo a mais ou a menos em relação ao alelo original, presente na fita molde (KORNBERGet al. 1964; FAN; CHU, 2007; LECLERCQ et al. 2010). Ao longo das gerações, novos alelos surgem por esse mecanismo, originando os alelos que caracterizam o alto grau de variabilidade observado atualmente para estes microssatélites dentro da espécie humana (JEFFREYS, ROYLE et al. 1988; WEBER; WONG, 1993; JEFFREYS, 2005). Os fragmentos de DNA contendo STRs podem ser analisados por meio da amplificação dessas regiões específicas pela técnica de PCR (WEBER, 1990; ERLICH; ARNHEIM, 1992; BUTLER, 2007).
necessária para análise, além de aumentar o poder de discriminação e de permitir a utilização de amostras de DNA degradadas e a automação dos laboratórios forenses (WEBER, 1990; KORETH et al. 1996; THOMSON et al. 1999; GILL, 2002).
Sistemas para a amplificação de STRs por PCR são disponibilizados comercialmente, contendo uma mistura de iniciadores para a amplificação de várias regiões genômicas pré-estabelecidas e uma mistura com a enzima DNA
p im a m áv , um ampã ap p ia NT ’ . A utilização destes kits comerciais favorece a padronização dos resultados obtidos, permitindo o compartilhamento inter laboratorial de informações genéticas (THOMSON et al. 1999; BUTLER, 2007; VALLONE et al. 2008).
Na área forense, a determinação do perfil genético de uma amostra criminal questionada pode solucionar ou direcionar uma investigação criminal. Este perfil genético somente terá utilidade forense se comparado com um perfil genético de referência (da vítima ou do suspeito). Se os perfis submetidos à comparação são diferentes, está excluída a possibilidade de as amostras terem se originado da mesma pessoa. Se forem coincidentes, de acordo com o número de marcadores genéticos utilizados e as frequências populacionais dos alelos identificados, pode-se determinar a probabilidade de se encontrar ao acaso na população uma pessoa apresentando o mesmo perfil genético, estabelecendo a força da evidência genética (EVETT; WEIR, 1998; PRINZ et al. 2007). Se entre os marcadores utilizados há condição de independência, utiliza-se o princípio de Hardy-Weinberg para estimar as proporções genotípicas a partir das proporções fenotípicas (as frequências dos alelos na população analisada) (HOLT et al. 2000).
mesmo perfil de DNA (BENECKE, 1997; HOLT et al. 2000; WATSON; BERRY, 2005; PRINZ et al. 2007). Perante o Tribunal, o Cientista Forense fornece uma análise estatística que mensura o poder dos resultados apresentados. O valor da probabilidade é uma medida da incerteza, com base em dados populacionais (EVETT WEIR, 1998; TARONI et al. 2002).
Apesar do altíssimo poder de discriminação e do grande potencial de esclarecimento, para que as provas genéticas sejam consideradas válidas, os procedimentos de coleta, guarda, análise e retenção de contraprova devem ser bem estabelecidos (SCHNEIDER; MARTIN, 2001; PRINZ et al. 2007). A manutenção da cadeia de custódia do material biológico proveniente de um local de crime é um procedimento adotado pela Polícia Civil do Distrito Federal. No IPDNA (Instituto de Pesquisa de DNA Forense) toda a documentação referente ao vestígio material é mantida em um protocolo próprio, relacionado à ocorrência policial. A coleta do material, o armazenamento dos vestígios, os exames genéticos e as análises estatísticas são realizados conforme métodos validados por organizações internacionais.
Na abordagem dos crimes relativos à esfera sexual, a análise de material biológico coletado do corpo da vítima constitui-se em um item fundamental para o esclarecimento do fato (COLLINS et al. 1994; ROA et al. 1995). Na Polícia Civil do Distrito Federal, o Instituto de Medicina Legal (IML) e o Instituto de Criminalística (IC) participam com a constatação da materialidade em crimes sexuais, pela pesquisa de espermatozoides em esfregaços coletados da vítima e de vestígios provenientes de locais de crime, respectivamente, enquanto o IPDNA permite a vinculação do vestígio ao autor, mediante a comparação do genótipo de origem masculina obtido do material biológico coletado da vítima ou do local do crime com o perfil genético observado na amostra coletada do suspeito apresentado. Os exames microscópicos para a detecção de espermatozoides realizados pelos Institutos de Medicina Legal (IML) e de Criminalística (IC) podem apresentar resultados negativos ou positivos, com raros, frequentes ou numerosos espermatozoides.
extração diferencial, que permite a separação entre o DNA proveniente das células outras que não espermatozoides ("Fração Não-Espermatozoide", FNE) e aquele proveniente dos espermatozoides ("Fração Espermatozoide", FE) (GILL et al. 1985; YOSHIDA et al. 1995).
A identificação de espermatozoides em uma amostra coletada de uma vítima de crime sexual confirma a ocorrência do ato sexual, enquanto a sua ausência normalmente encerraria a investigação biológica no crime em questão, deixando uma lacuna quanto à determinação da autoria do delito e até mesmo quanto à tipificação do crime. A ausência de espermatozoides nas amostras coletadas de vítimas de estupro do sexo feminino, no entanto, não exclui a presença de células de origem masculina, como células epiteliais ou leucócitos, presentes no líquido seminal (COLLINS et al. 1994; SIBILLE et al. 2002; DELFIN et al. 2005; MURRAY et al. 2007). Nos casos de crimes sexuais, existe a possibilidade de que o material vaginal coletado não apresente espermatozoides do agressor (por exemplo, em quadro clínico de azoospermia, utilização de preservativo, prática de coito interrompido, etc.). Segundo estudos realizados, mesmo quando há presença de sêmen, se o número de células estiver abaixo de um limite mínimo não ocorre a amplificação do DNA, impossibilitando a detecção do perfil genético (COMEY, 1994; HANSON; BALLANTYNE, 2005).
1.4. Y-STRS
Técnicas moleculares utilizando STRs do cromossomo Y representam as novas ferramentas para a identificação dos perfis genéticos de estupradores, pois na amplificação para esses microssatélites, encontrados apenas em amostras provenientes de indivíduos do sexo masculino, não há competição com o DNA feminino, presente em muito maior quantidade na amostra de conteúdo vaginal da vítima (HONDA et al. 1999; ROEWER, 2009). Muitos trabalhos têm sido publicados com a análise de Y-STRs em amostras de crimes sexuais coletadas de vítimas do sexo feminino nas quais não foi detectada a presença de espermatozoides ( HONDA et al. 1999; SIBILLE et al. 2002; HALL; BALLANTYNE, 2003). Sibille et al. (2002), trabalhando com 104 amostras coletadas de vítimas de estupro, cujos exames citológicos não detectaram a presença de espermatozoides, observaram a presença de material genético de origem masculina em 28% das amostras, evidenciando a ocorrência de penetração. Em um estudo semelhante, pesquisadores relataram um sucesso de 48% com haplótipos de Y-STRs, trabalhando com amostras com resultado positivo para PSA (antígeno prostático específico), cuja análise com STRs autossômicos após extração diferencial resultou infrutífera (DEKAIRELLE; HOSTE, 2001).
O ponto fraco da análise de Y-STRs para identificação humana, no entanto, é que, se o haplótipo de Y-STRs de um suspeito coincide com o padrão obtido da amostra coletada na cena de crime, parentes da linhagem patrilinear do suspeito não podem ser excluídos como produtores da referida amostra. Devido à ausência de recombinação nas regiões do cromossomo Y em que estão localizados os Y-STRs, muitos indivíduos em uma população podem compartilhar o haplótipo com outros homens que são provenientes da mesma linhagem patrilinear, ainda que separados por mais de uma geração (KAYSER et al. 2000; GILL et al. 2001). Esses indivíduos não podem ser distinguidos pela análise de Y-STRs, a não ser que tenham ocorrido mutações no período de dispersão (GUSMAO et al. 2006; VERMEULEN et al. 2009).
contribuído para a produção da amostra, mas também pode ter sido um irmão, o pai, um primo da linhagem paterna, ou qualquer outro indivíduo do sexo masculino pertencente à mesma linhagem patrilinear (HANSON; BALLANTYNE, 2006). A inclusão de um suspeito apenas com o uso de STRs do cromossomo Y, portanto, não é tão determinante quanto aquelas obtidas com os STRs autossômicos (GUSMAO et al. 2006). Entretanto, isso não pode ser impedimento para a constituição da prova material, visto que, se o suspeito nesse caso for inocente, a prova genética indica que o perpetrador é um parente da linhagem paterna e a investigação deve acrescentar provas não genéticas para encontrar o verdadeiro culpado (GILL et al. 2001; ROEWER, 2009).
Segundo Roewer (2009), há duas formas de apresentar os resultados obtidos com polimorfismos de marcadores Y-STRs, podendo ser relatado o número de observações do referido haplótipo em um banco de dados relevante ou a frequência do haplótipo na população (IRANI et al. 1997; ROEWER et al. 2001; GUSMAO et al. 2006). A abordagem bayesiana que estima uma frequência de distribuição posterior do haplótipo, a qual é baseada em estudos de genética de populações, pode ser aplicada tanto em marcadores do cromossomo Y quanto de DNA mitocondrial e tem sido utilizada para Y-STRs (ROEWER, 2009). A maioria dos Y STRs estão localizados dentro de regiões não recombinantes do cromossomo Y e são transmitidos de pai para filho sem recombinação. Assim, todos os STRs do cromossomo Y se comportam como um único loco e a regra do produto não pode ser aplicada para os diferentes marcadores Y-STRs (GILL et al. 2001; SCHOSKE et al. 2003; PANG; CHEUNG, 2007).
A análise de STRs do cromossomo Y é muito útil nos casos em que as análises com o DNA autossômico são limitadas pela pequena quantidade de DNA masculino em uma mistura com presença de DNA feminino em abundância e, particularmente, nos crimes sexuais com vítimas femininas, que envolvem um ou mais indivíduos do sexo masculino como autores (GUSMAO, et al. 2006; PARSON et al. 2008). O método de análise de Y-STRs foi validado por vários laboratórios e tem sido largamente utilizado em aplicações forenses (KAYSER et al. 2001; KRENKE et al. 2005; MULERO et al. 2006). A análise de haplótipos do cromossomo Y não substitui os marcadores autossômicos, mas fornece uma ferramenta poderosa na identificação de perfis masculinos de forma inequívoca, quando os STRs autossômicos são ineficientes, em um grande número de situações, tais como: amostras com mistura de DNA em que o material genético de origem feminina (da vítima) está presente em quantidade muito maior que o de origem masculina (do agressor); casos de suposta agressão sexual em que há ausência de espermatozoides; casos de crimes sexuais com quantidade de sêmen reduzida, em que não é possível visualizar o perfil masculino com os marcadores autossômicos; casos de crimes sexuais em que a evidência em questão contém saliva e pode ter mistura de material genético feminino/masculino; casos de crimes sexuais em que a mancha é antiga e a extração diferencial pode ser infrutífera ou arriscada; casos em que a quantidade de doadores do sexo masculino necessita ser determinada; casos em que há expectativa de se encontrar traços de material genético de origem masculina na evidência em questão, como a análise de material coletado sob as unhas de uma vítima de crime sexual (MALSOM et al. 2009); casos em que a linhagem patrilinear do produtor da amostra em questão necessita ser determinada ou que a população de origem do produtor da amostra em questão necessite ser estimada (KAYSER et al. 2001; WETTON et al. 2005; ROEWER, 2009; VERMEULEN et al. 2009).
SAJANTILA, 2001; ROLF et al. 2001; ROEWERet al. 2005; VERMEULEN et al. 2009).
O número de locos Y-STRs disponíveis para testes de identificação humana aumentou desde a virada do século e novos sistemas Y-STRs multilocos são atualmente desenvolvidos (BUTLER et al. 2002; SCHOSKE et al. 2003; KRENKE et al. 2005; D'AMATO; BAJIC; DAVISON, 2011). Um haplótipo ideal de Y-STRs com fins forenses deve conter o máximo possível de locos, para obter um maior poder de discriminação e aumentar a chance de exclusão de todos os suspeitos ou linhagens não relacionadas ao caso. Foram mapeados 389 locos STRs diferentes no cromossomo Y (HANSON; BALLANTYNE, 2006) e de acordo com publicação da DNA Commission of the International Society of Forensic Genetics (ISFG), atualmente já foram estudados 220 Y-STRs diferentes que são potencialmente úteis para análise genética, embora Y-STRs novos, sem bancos de dados robustos não sejam recomendados para análise forense (GUSMAO et al. 2006).
1.5. QUANTIFICAÇÃO DO MATERIAL GENÉTICO
A quantificação de DNA nas amostras forenses é uma etapa importante para a obtenção de perfis genéticos precisos e confiáveis com a tecnologia de PCR. O método de quantificação por PCR em tempo real tem se mostrado eficiente para este fim, aumentando a rapidez e a precisão no processo de quantificação de DNA de amostras forenses (DUEWER et al. 2001; DUEWER et al. 2004).
homólogas, dos cromossomos X e Y (ANDREASSON; ALLEN, 2003; ALONSO et al. 2004).
Os kits Quantifiler Humano e Quantifiler Y Masculino detectam, respectivamente, o locus da transcriptase reversa da Telomerase Humana (hTERT), localizado no cromossomo 5 e o locus de "reversão sexual" (SRY) no cromossomo Y (BRYCE et al. 2000; SHAY; WRIGHT, 2000; QUINTANA-MURCI; FELLOUS, 2001). O primeiro detecta DNA genômico humano total (masculino e feminino) e o segundo detecta apenas DNA humano de origem masculina.
O kit Humano é destinado ao uso geral como passo preliminar para a realização de análises de rotina com STRs, enquanto o kit Y Humano Masculino é projetado para ser de uso particular em amostras com DNA de mistura de material genético de homens e mulheres, como evidência de agressão sexual, onde ele pode ser útil para detectar e quantificar separadamente DNA do sexo masculino inserido em uma mistura com presença de DNA de origem feminina em quantidade elevada.
Além dos reagentes específicos para amplificação das regiões alvo, os kits Quantifiler contêm um sistema de controle de amplificação denominado IPC (do inglês, Internal PCR Control), que funciona como uma verificação de controle de qualidade interno, confirmando a função de todos os componentes do sistema, bem como a capacidade de amplificação do material genético presente nas amostras. Na prática, esse sistema indica se há na amostra testada algum componente inibidor que impeça ou dificulte a amplificação do DNA eventualmente presente. Em caso positivo, a amostra deve ser submetida a algum procedimento de purificação disponível no laboratório, após o que um novo procedimento de quantificação deve ser realizado.
A tecnologia de PCR em tempo real para a detecção de DNA por meio de amplificação da sequência alvo baseia-se em um conjunto de dois primers específicos para a sequência do DNA alvo ou amplicon e uma sonda TaqMan®, homóloga a uma sequência inserida no amplicon situado entre os primers de PCR. Esta sonda contém um fluoróforo repórter (R) na giã 5’
PCR é realizada utilizando um master mix que inclui uma enzima DNA polimerase termo-estável, ativada por alta temperatura (hot-start), com
a ivi a x nu á i a 5’ →3’.
Nos ciclos iniciais da PCR, todas as sondas TaqMan® estão intactas, e a proximidade física entre as moléculas de fluoróforos repórter (R) e quencher (Q) suprime a fluorescência das moléculas de repórter mediante transferência de energia por ressonância, que consiste na inibição de um corante por outro, sem a emissão de prótons (HAUSTEIN; SCHWILLE, 2007). Após a desnaturação das fitas de DNA, com a diminuição da temperatura da reação, a sonda TaqMan® liga-se à região alvo e os primers anelam-se ao DNA. Na fase de extensão, a enzima Taq Polimerase inicia a adição de nucleotídeos e quebra a sonda TaqMan® que se encontra ligada à região alvo do DNA, por meio de sua ação exonucleásica 5’ → 3’. Esta ação separa o quencher do repórter e permite que este passe a emitir fluorescência (LEE et al. 1993; LIVAK et al. 1995). Esta emissão luminosa emitida pelo corante em seu estado excitado é capturada por um computador e mostrada em um gráfico, plotado em ciclos de PCR versus intensidade da emissão luminosa. Quanto mais ciclos ocorrem, mais fluorescência é emitida e quanto mais DNA molde houver no início da reação, menos ciclos serão necessários para que essa fluorescência seja detectada.
1.6. PROVÁVEIS CAUSAS PARA A AUSÊNCIA DE ESPERMATOZOIDES EM AMOSTRAS DE CRIMES SEXUAIS
A ausência de espermatozoides em amostras coletadas de vítimas de estupro pode ser explicada por numerosos fatores, incluindo intervalo prolongado entre a ocorrência de estupro e a coleta do material vaginal, ausência de penetração peniana, utilização de preservativo, penetração sem ejaculação, autor oligospérmico ou azoospérmico.
Se durante a ocorrência de estupro não houve penetração peniana, é provável que não haja células masculinas no interior dos canais vaginal ou anal da vítima. O mesmo resultado pode ser esperado se o agressor fez uso de preservativo durante o ato sexual.
Embora seja possível obter o perfil de DNA com STRs autossômicos do doador de sêmen em amostras de conteúdo vaginal coletadas dentro do intervalo de 24 a 36 horas após a ocorrência de estupro, comumente isso não é factível após o intervalo de 48 horas, embora existam relatos de exceção cuja persistência de espermatozoides no interior da vagina foi detectada após um intervalo de seis dias (DAVIES; WILSON, 1974; WILLOTT; ALLARD, 1982). Com o passar do tempo, parte do esperma depositado na vagina pode ser perdida devido a processos de lavagem e drenagem vaginais, ocorrência de menstruação e degradação de espermatozoides no trato cervicovaginal. A manipulação requerida durante o processo de extração diferencial também gera perda de células (GILL et al. 1985). No entanto, a dificuldade em se obter o perfil masculino não se deve à ausência de células masculinas e sim à limitação da tecnologia empregada. Material genético proveniente de espermatozoides rompidos prematuramente, presente na fração não espermatozoide juntamente com células epiteliais, podem não ser detectados pelo processo de análise com STRs autossômicos (FINDLAY et al. 1995; HOLT et al. 2002; CERRI et al. 2003).
A azoospermia também pode ser provocada por um processo cirúrgico, denominado vasectomia. A vasectomia moderna ou vasectomia chinesa foi desenvolvida em 1988 pelo Dr. Li Shunqiang e desde esta época ela vem sendo cada vez mais utilizada, uma vez que se acredita ser a técnica menos invasiva e que traz melhores benefícios aos pacientes (SHIH et al. 2011). Em virtude de sua alta confiabilidade e segurança, a contracepção cirúrgica masculina é um dos métodos de planejamento familiar que vem ganhando mais adeptos e usuários, na atualidade. As técnicas microcirúrgicas de reversão da vasectomia, o material especializado e os fios de sutura têm sido constantemente refinados e melhorados, proporcionando resultados bastante confiáveis, embora a aceitação da vasectomia pareça independer destes fatos. O que atrai o candidato à vasectomia é a sua alta eficácia, simplicidade e sua característica de método contraceptivo definitivo (AGUIAR, 2010).
Com todas as vantagens citadas, é cada vez maior o número de homens vasectomizados (WILLOTT, 1982). O número de vasectomias feitas pelo Sistema Único de Saúde (SUS) no Brasil cresceu de 19,1 mil em 2003 para 34,1 mil em 2009, um aumento de 78,7% em seis anos – o dado refere-se a cirurgias feitas em hospitais públicos ou em instituições privadas que têm leitos pagos com dinheiro do governo. De acordo com o Ministério da Saúd , “
números refletem o aumento da participação do homem no planejamento
fami ia ”. n ên ia é a qu , a a v z mai , h m n ubm am a
1.7. PROCEDIMENTOS UTILIZADOS NOS LABORATÓRIOS FORENSES PARA A DETECÇÃO DE SÊMEN EM AMOSTRAS DE CRIMES SEXUAIS
1.7.1. MÉTODOS DE DETECÇÃO DE SÊMEN EM AMOSTRAS DE CRIMES SEXUAIS
O procedimento mais utilizado para a detecção de sêmen em amostras forenses é a análise microscópica para a visualização de espermatozoides (SHORT et al. 1978; EVERS et al. 2009).
A realização de exames de DNA ainda apresenta custos elevados e uma triagem dos casos com resultado negativo para a presença de espermatozoides a serem analisados é realizada em muitos casos, por meio dos exames presuntivos de presença de sêmen. Na ausência de espermatozoides, a detecção da enzima fosfatase ácida e métodos imunocromatográficos para a detecção do antígeno prostático específico (PSA) são os testes mais comumente empregados (GRAVES et al. 1985).
O antígeno prostático específico ou PSA (do inglês: prostatic specific antigen), detectado em um dos testes mais utilizados para identificar a presença de fluido seminal, é uma glicoproteína, também conhecida como p30, produzida pelas células da glândula prostática e secretada no líquido seminal (GRAVES et al. 1985; HOCHMEISTER et al. 1999). A técnica de ELISA, extremamente sensível, pode detectar a presença de PSA em concentrações de até 4 ng/mL. Entretanto, devido ao pequeno número de amostras analisadas nos laboratórios forenses, os testes de membrana são mais utilizados (KAMENEV; LECLERCQ; FRANÇOIS-GERARD, 1989).
de 2 a 30 anos, apresentaram resultado positivo. Algumas amostras de urina de indivíduos do sexo masculino apresentaram resultado positivo, enquanto outras resultaram negativas, o que pode ser explicado pela presença de pequena quantidade de fluido prostático nessas amostras, resultantes de possíveis processos inflamatórios na próstata ou hiperplasia prostática (IRANI et al. 1997).
Trabalhos desenvolvidos com amostras de crimes sexuais com até 24 horas após o coito constataram maior sensibilidade do método de detecção da fosfatase ácida em relação à observação de espermatozoides (RICCI; HOFFMAN, 1982). Estudos realizados encontraram uma correlação de 98,1% entre testes negativos para a detecção de fosfatase ácida e exames microscópicos negativos para espermatozoides (EVERS et al. 2009). Este resultado implica uma alta especificidade deste teste, embora em casos forenses não seja aceitável uma porcentagem de 1,9% de exames com resultados falsos negativos.
1.7.2. PROCEDIMENTOS UTILIZADOS PARA A DETECÇÃO
DE SÊMEN EM LABORATÓRIOS FORENSES
BRASILEIROS
2 OBJETIVOS
2.1. OBJETIVO GERAL
Verificar a validade de se implantar na rotina de um laboratório de genética forense a análise molecular de amostras coletadas de vítimas de estupro, nas quais não foi detectada a presença de espermatozoides.
2.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Verificar a presença de material genético de origem masculina em amostras com ausência de espermatozoides coletadas de vítimas de estupro no Distrito Federal e quantificar o DNA eventualmente presente.
Avaliar a amplificação efetiva de sistemas de microssatélites autossômicos e do cromossomo Y em amostras com presença de DNA masculino e relacionar os resultados obtidos com as proporções de material genético masculino/feminino, verificando em que casos é possível a identificação do padrão alélico de origem masculina nesses dois tipos de marcadores.
Relacionar os resultados obtidos com o histórico de cada caso, desde o momento do crime, as circunstâncias descritas no depoimento da vítima, quando fornecido, até o momento da coleta, visando definir uma estratégia de ação em casos semelhantes no futuro.
3 MATERIAL E MÉTODOS
3.1. AMOSTRAS
3.1.1. PROCESSO DE SELEÇÃO
Para a realização deste trabalho foram realizadas análises em um total de seiscentas ocorrências de estupro ocorridas entre os anos de 2003 e 2010, cujas amostras de conteúdo vaginal analisadas pelo IML apresentaram resultado negativo para a pesquisa de espermatozoides no exame citológico. Considerando que a ausência de espermatozoides do agressor no corpo da vítima é esperada em alguns casos de estupro, tais como, situações em que: o agressor não chegou a ejacular ou não houve penetração peniana no corpo da vítima; o agressor utilizou preservativo; o tempo transcorrido entre o fato e a coleta da amostra foi superior a quatro dias (DAVIES; WILSON, 1974; WILLOTT; ALLARD, 1982) e, considerando que a ausência de espermatozoides não corresponde necessariamente à ausência de material genético de origem masculina no corpo da vítima (DEKAIRELLE; HOSTE, 2001; SIBILLE et al. 2002; ROEWER, 2009), passou-se à análise dos históricos das ocorrências criminais, buscando identificar indícios da ocorrência de penetração peniana, cuja coleta do material biológico tenha sido realizada dentro do prazo ideal para a detecção de material genético de origem masculina, com vistas a identificar possíveis vítimas de estupradores azoospérmicos ou oligospérmicos, com possibilidade de serem identificados pela tipagem de STRs do cromossomo Y. Foram então selecionados 150 casos de vítimas femininas, nos quais o histórico apontava para a ocorrência de estupro com possível penetração e/ou ejaculação, cuja comunicação do fato fora realizada até quatro dias após a ocorrência do evento delituoso.
Além dos casos selecionados, um conjunto aleatório de 10 casos que não seriam eleitos para o exame foi submetido à análise genética, constituindo um grupo controle para o método de seleção de amostras a serem analisadas.
no processo de quantificação, para serem amplificadas para STRs do cromossomo Y, a fim de atuarem como controle do processo de quantificação.
3.2. EXTRAÇÃO DO MATERIAL GENÉTICO
Quando da análise de material contendo fluido vaginal ou esperma, em função da natureza do evento sexo-relacionado, podem estar presentes espermatozoides e outros tipos de células, frequentemente células epiteliais. Em tais casos, recomenda-se a utilização de uma metodologia de extração diferencial (GILL et al. 1985; YOSHIDA et al. 1995), a qual permite a separação entre o DNA proveniente de espermatozoides daquele proveniente de outros tipos celulares (não espermatozoides). No entanto, devido à especificidade dos casos selecionados, todos com ausência de espermatozoides, as amostras foram submetidas ao procedimento de extração pelo protocolo modificado de extração orgânica de DNA para manchas de amostras biológicas, segundo os procedimentos utilizados pelo "Federal Bureau of Investigation" (FBI) (BUDOWLE et al. 1995).
3.3. QUANTIFICAÇÃO DO DNA DE ORIGEM HUMANA E MASCULINA
As amostras extraídas foram quantificadas com o emprego do sistema de revelação por fluorescência fabricado pela Applied Biosystems, Quantifiler
Du Human Ma ™ DN Quan ifi a i n Ki (GREEN et al. 2005). As reações
f am a iza a m um v um fina 25 μL m 12,5 μL R a i n Mix,
10,5 μL im S 2 μL a uçã aqu a m DN x aí (Anexo A, item 2). A curva padrão de DNA foi preparada, por meio de diluição seriada, a partir de uma solução de DN qu m uma n n açã 200 ng/μL, sendo gerados 8 (oito) controles com n n açõ n 50 a 0,023 ng/μL, os quais foram aplicados em duplicata, conforme recomendação do fabricante (GREEN et al. 2005).
O processo de quantificação foi realizado utilizando-se o equipamento 7500 Real Time PCR System da Applied Biosystems. A análise, realizada por meio do programa 7.500 System (Applied Biosystems), determinou a quantificação absoluta de DNA presente na amostra.
O método de quantificação por PCR em tempo real mensura a quantidade de ciclos de PCR necessários para a detecção do produto de amplificação em cada amostra. Os dados são coletados durante a fase exponencial, quando a quantidade do produto da PCR é diretamente proporcional à quantidade do DNA molde utilizado (GREEN et al. 2005).
Todas as amostras em que não se detectou a presença de DNA masculino foram submetidas a um novo processo de quantificação, para minimizar possíveis resultados falsamente negativos devido à ocorrência de erros de pipetagem.
Após a quantificação, as amostras em que não se detectou a presença de DNA masculino foram arquivadas e as demais, submetidas à amplificação para marcadores autossômicos e do cromossomo Y.
3.4. AMPLIFICAÇÃO DO DNA
amplificação utilizados, de 0,5 a 1,25 ng/μL na açã , quan p ív .
amostras foram submetidas à amplificação pelo método de reação em cadeia da polimerase (PCR), para amelogenina, para 15 (quinze) STRs autossômicos (D19S433, D2S1338, D18S51, D21S11, TH01, D3S1358, FGA, TPOX, D8S1179, vWA, D16S539, D7S820, D13S317, D5S818 e CSF1PO) e para 16 (dezesseis) STRs do cromossomo Y (DYS456, DYS389 I, DYS389 II, DYS392, DYS393, DYS438, DYS390, DYS458, DYS19, DYS385, DYS391, DYS439, DYS635, Y_GATA_H4, DYS437 e DYS448), com o emprego de 2 (dois) sistemas de revelação por fluorescência fabricados pela Applied Biosystems, o
i ma mpF STR® I n ifi ™ Ki CR R ag n (MORETTI et al. 2001; COLLINS et al. 2004) mpF STR® Yfi ™ Ki CR R ag n (MULERO et al. 2006).
As reações de PCR foram realizadas com volume final de 25 μL m 4,5
μL água mi iQ, 0,5 μL Taq DN G ( pp i Bi ystems), 10,0 μL
Reaction Mix, 5,0 μL im , em ub m 5 μL DN em solução aquosa, para o sistema Identifiler e com 5 μL água mi iQ, 0,8 μL Taq
DNA Gold (Applied Biosystems), 9,2 μL R a i n Mix, 5,0 μL im ,
em tubo com 5,0 μL DN em solução aquosa, para o sistema Y-filer (Anexo A, item 3). As amplificações foram realizadas em termocicladores GeneAmp PCR System 9700 (Applied Biosystems) ou GeneAmp PCR System 9600 (Perkin Elmer), empregando as seguintes condições: desnaturação inicial a 95ºC/11 min.; 28 ciclos de: desnaturação a 94°C/1min., anelamento a 59ºC/1 min. e extensão a 72ºC/1 min.; extensão final a 60ºC/60 min, para o Identifiler e, para o Y-filer, desnaturação inicial a 95ºC/11 min.; 30 ciclos de: desnaturação a 94°C/1min., anelamento a 61ºC/1 min., extensão a 72ºC/1 min. e extensão final a 60ºC/80 min (COLLINS et al. 2004; MULERO et al. 2006). Para visualização dos programas de amplificação, veja Anexo A, item 4).
3.5. DETECÇÃO DOS PRODUTOS DE PCR
Os procedimentos de separação e detecção dos produtos de PCR foram realizados em sequenciadores automáticos de DNA 3130 Genetic Analyzer e 3130XL Genetic Analyzer (Applied Biosystems), de acordo com o protocolo do
(azu ), VIC™ (v ) LIZ™ ( a anja), p mi in a aná i imu ân a a
as regiões genômicas analisadas (BUTLER et al. 2004; KOUMI et al. 2004). Os produtos de amplificação foram p pa a m 8,7 μL
formamida Hi-Di™ ( pp i Bi y m ); 0,3 μL GS 500 LIZ iz an a ( pp i Bi y m ) 1,0 μL p u amp ifi a CR. E ma ia f i
submetido a injeção no sequenciador por um período de 10 segundos e posterior eletroforese a 15 Kvolts com duração de 40 min.
O processo de eletroforese foi realizado com a utilização do polímero
O 4™ ( pp i Bi y m ), ampã G n i na yz Buff m EDT
(Applied Biosystems), e capilar de 36 cm (Applied Biosystems). Após a coleta de dados, as amostras foram analisadas com o programa Data Collection® versão 3.0 (Applied Biosystems), que capta a emissão fluorescente e a transfere para um conversor que reproduz a posição dos produtos de amplificação, e os alelos foram designados utilizando o programa GeneMapper® versão 3.2 (Applied Biosystems), pela identificação do tamanho de cada fragmento de fita simples (em pares de bases) e correlação dos fragmentos com os alelos da escada alélica (CHATTERJI; PACHTER, 2006).
3.6. ANÁLISE DOS HAPLÓTIPOS
Após a obtenção dos haplótipos de Y-STRs, estes foram analisados e classificados quanto ao número de locos amplificados com sucesso, verificando a possibilidade de identificação dos suspeitos, quando apresentados pelas respectivas Delegacias responsáveis pelas investigações criminais. Os resultados foram organizados de acordo com o número de locos Y-STRs amplificados, sendo consideradas as seguintes faixas de variação: 0 a 5 locos amplificados (haplótipo insuficiente para definição de uma possível linhagem), 6 a 10 locos amplificados (haplótipo parcial), 11 a 15 locos amplificados (haplótipo incompleto) e 16 locos amplificados (haplótipo completo).
3.7. DETECÇÃO DO ANTÍGENO PROSTÁTICO ESPECÍFICO (PSA)
O procedimento de detecção do Antígeno Prostático Específico (PSA) foi realizado com a utilização do kit para detecção qualitativa por método
-Diagnóstica, com sensibilidade de 2,5 ng/ml. O método baseia-se no princípio de que o PSA presente na amostra liga-se ao anticorpo anti-PSA conjugado ao ouro-coloidal. A mistura migra por capilaridade pela membrana, ligando-se aos anticorpos anti-PSA fixos na membrana, gerando uma banda colorida na área
“T”. Na au ên ia S nã a f mação da banda. Um reagente de controle imobilizado na membrana determinará o aparecimento de uma
gun a ban a i a na á a n “C”, m n an qu ag n
estão funcionando normalmente (YOKOTA et al. 2001).
4 RESULTADOS
4.1. DETECÇÃO DE DNA MASCULINO PRESENTE NAS AMOSTRAS
Após a execução dos procedimentos de quantificação das amostras, verificou-se que em 65 das 150 amostras selecionadas foi detectada a presença de DNA de origem masculina, o que corresponde a 43% dos casos (Figura 1).
Figura 1: Mostra a representação gráfica da porcentagem de amostras com resultado positivo para a presença de DNA de origem masculina nas amostras sem espermatozoides selecionadas, coletadas de vítimas de estupro.
4.2. PRODUTOS DE AMPLIFICAÇÃO OBTIDOS COM STRS AUTOSSÔMICOS E AMELOGENINA
Figura 2: Mostra um eletroferograma com locos STRs autossômicos e amelogenina, obtido após amplificação de uma das amostras selecionadas. A proporção de DNA feminino em relação à quantidade de DNA masculino nessa amostra é de 250:1.
4.3. PRODUTOS DE AMPLIFICAÇÃO OBTIDOS COM Y-STRS
haplótipo parcial (produto de amplificação observado em 6 a 10 locos STRs), obtido em 16,92% das amostras com presença de material genético de origem masculina; haplótipo insuficiente (produto de amplificação observado em 1 a 5 locos STRs), obtido em 4,62% das amostras com presença de material genético de origem masculina. Não foram obtidos produtos de amplificação em 6,15% das amostras com presença de material genético de origem masculina.
4.3.1. HAPLÓTIPO Y-STR COMPLETO
Em 50,77% das amostras com presença de material genético de origem masculina, foi possível identificar o haplótipo completo, com produto de amplificação em 16 locos Y-STRs (Figura 3).
4.3.2. HAPLÓTIPO Y-STR INCOMPLETO
Em 21,54% das amostras com presença de material genético de origem masculina, foi possível identificar o haplótipo incompleto, com produtos de amplificação detectados em 11 a 15 locos Y-STRs (Figura 4).
4.3.3. HAPLÓTIPO Y-STR PARCIAL
Em 16,92% das amostras com presença de material genético de origem masculina, foi possível identificar o haplótipo parcial, com produtos de amplificação identificados em 6 a 10 locos Y-STRs (Figura 5).
Figura 5: Mostra um eletroferograma com o haplótipo Y-STR parcial. A amostra
4.3.4. HAPLÓTIPO Y-STR INSUFICIENTE
Em 4,62% das amostras com presença de material genético de origem masculina foi obtido um haplótipo de Y-STRs insuficiente, com produtos de amplificação observados em 1 a 5 locos STRs. A denominação de haplótipo insuficiente deve-se ao fato de que a obtenção de produtos de amplificação em um número reduzido de locos dificulta a definição sobre a origem da amostra. No entanto, em muitos casos é possível excluir um suspeito falsamente acusado ou, em caso de coincidência de perfis, inferir um possível compartilhamento de linhagem patrilinear entre os doadores das amostras.
Figura 6: Mostra um eletroferograma com haplótipo Y-STR insuficiente. A amostra
4.4. DISTRIBUIÇÃO DAS AMOSTRAS QUANTO AO NÚMERO DE LOCOS Y-STRS AMPLIFICADOS EM RELAÇÃO À QUANTIDADE DE DNA
A partir da análise quantitativa do DNA masculino detectado, observou-se que nas amostras cuja quantidade de DNA adicionado à reação de PCR, após o processo de normalização, foi próxima da concentração ideal recomendada pelo fabricante, houve uma maior chance de sucesso na amplificação em relação às demais amostras, observando-se que em 91,3% das amostras com concentração de DNA masculino ideal (0,5 a 1,25 ng) o sucesso na amplificação foi de 100%. (Figura 7).
Figura 7: Mostra a distribuição das amostras quanto ao número de locos Y-STRs amplificados em relação à quantidade de DNA masculino adicionada à reação. As quantidades de DNA na reação são apresentadas em nanogramas.
4.5. DISTRIBUIÇÃO DAS AMOSTRAS QUANTO AO NÚMERO DE LOCOS Y-STRS AMPLIFICADOS EM RELAÇÃO AO TEMPO DECORRIDO ATÉ A COLETA DO MATERIAL
retenção de material biológico de origem masculina dentro do corpo da vítima, não sendo este um ponto de variação importante neste caso (Figura 8).
Figura 8: Mostra a distribuição das amostras quanto ao número de Y-STRs amplificados, em relação ao tempo decorrido entre a ocorrência do delito e a coleta da amostra para exame. Apenas as amostras em que foram observados produtos de amplificação são apresentadas.
4.6. ANÁLISE DE EFICIÊNCIA DOS Y-STRS
O loco Y-STR mais sensível foi o DYS391, com produto de amplificação em 61 das 65 amostras em que foi detectada a presença de material genético de origem masculina (93,85%). Em quatro amostras, nenhum produto de amplificação foi detectado. O segundo lugar em sensibilidade ficou com os locos STR DYS393 e DYS389I, com amplificação em 60/65 (92,31%). Os Y-STRs DYS458 e DYS437 produziram amplificação em 59/65 (90,77%) e os locos de menor eficiência foram os Y-STRs DYS392 e DYS439, com amplificação em 39/65 (60%) e 38/65 (58,46%), respectivamente.
4.7. DETECÇÃO DO ANTÍGENO PROSTÁTICO ESPECÍFICO (PSA)
DNA masculino, o teste de PSA apresentou resultado positivo e em 27,3% das amostras com presença de DNA masculino, o teste de PSA apresentou resultado negativo. (Figura 9).
Figura 9: Mostra a distribuição das amostras quanto à detecção de PSA em relação à presença de DNA masculino.
4.8. QUANTIFICAÇÃO DAS AMOSTRAS CONTROLE
Nas dez amostras constituintes do grupo controle, que não seriam selecionadas para exame, de acordo com os critérios de seleção, não foi detectada a presença de DNA de origem masculina, corroborando a hipótese de que o método escolhido para a seleção de amostras a serem analisadas mostrou-se confiável.
4.9. AMPLIFICAÇÃO DE AMOSTRAS COM RESULTADO NEGATIVO NA QUANTIFICAÇÃO DE DNA MASCULINO
produtos de amplificação, foi detectada a presença de DNA de origem masculina. Estes resultados reforçam orientações dos fornecedores dos kits de quantificação, que recomendam a realização do processo de quantificação em duplicata, para evitar possíveis erros de pipetagem.
4.10. CARACTERÍSTICAS DAS AMOSTRAS SELECIONADAS
