CRIMES SEXUAIS
1.7.1. MÉTODOS DE DETECÇÃO DE SÊMEN EM AMOSTRAS DE CRIMES SEXUAIS
O procedimento mais utilizado para a detecção de sêmen em amostras forenses é a análise microscópica para a visualização de espermatozoides (SHORT et al. 1978; EVERS et al. 2009).
A realização de exames de DNA ainda apresenta custos elevados e uma triagem dos casos com resultado negativo para a presença de espermatozoides a serem analisados é realizada em muitos casos, por meio dos exames presuntivos de presença de sêmen. Na ausência de espermatozoides, a detecção da enzima fosfatase ácida e métodos imunocromatográficos para a detecção do antígeno prostático específico (PSA) são os testes mais comumente empregados (GRAVES et al. 1985).
O antígeno prostático específico ou PSA (do inglês: prostatic specific antigen), detectado em um dos testes mais utilizados para identificar a presença de fluido seminal, é uma glicoproteína, também conhecida como p30, produzida pelas células da glândula prostática e secretada no líquido seminal (GRAVES et al. 1985; HOCHMEISTER et al. 1999). A técnica de ELISA, extremamente sensível, pode detectar a presença de PSA em concentrações de até 4 ng/mL. Entretanto, devido ao pequeno número de amostras analisadas nos laboratórios forenses, os testes de membrana são mais utilizados (KAMENEV; LECLERCQ; FRANÇOIS-GERARD, 1989).
Segundo pesquisa realizada (HOCHMEISTER et al. 1999), o PSA pode ser detectado em amostras de fluido seminal diluído em 1/1,3 milhões. O estudo desenvolvido avaliou testes de membrana em fluido seminal diluído de 1:50.000 a 1:1.000.000, constatando a mesma sensibilidade de detecção de um ensaio baseado em ELISA (HOCHMEISTER et al. 1999; PANG; CHEUNG, 2007). Amostras de seis espécies de microrganismos, fluidos seminais de cinco espécies de mamíferos, fluidos corporais de mulheres, amostras de saliva e de suor de homens e suabes de conteúdo anal foram testados, apresentando resultado negativo. No entanto, todas as amostras com sêmen, impregnadas em recortes de algodão e armazenadas à temperatura ambiente por períodos
de 2 a 30 anos, apresentaram resultado positivo. Algumas amostras de urina de indivíduos do sexo masculino apresentaram resultado positivo, enquanto outras resultaram negativas, o que pode ser explicado pela presença de pequena quantidade de fluido prostático nessas amostras, resultantes de possíveis processos inflamatórios na próstata ou hiperplasia prostática (IRANI et al. 1997).
Trabalhos desenvolvidos com amostras de crimes sexuais com até 24 horas após o coito constataram maior sensibilidade do método de detecção da fosfatase ácida em relação à observação de espermatozoides (RICCI; HOFFMAN, 1982). Estudos realizados encontraram uma correlação de 98,1% entre testes negativos para a detecção de fosfatase ácida e exames microscópicos negativos para espermatozoides (EVERS et al. 2009). Este resultado implica uma alta especificidade deste teste, embora em casos forenses não seja aceitável uma porcentagem de 1,9% de exames com resultados falsos negativos.
Segundo estudos comparativos realizados (GRAVES et al. 1985; MACALUSO et al. 1999), o antígeno PSA pode ser detectado no fluido vaginal até 27 h após o coito, comparado a uma persistência da fosfatase ácida de aproximadamente 14 h. Entretanto, dependendo do volume de esperma depositado na cavidade vaginal, os níveis de PSA podem retornar ao background após intervalos de 24 a 48 horas após a exposição (Macaluso, Lawson et al. 1999). De acordo com estudos realizados, o teste de PSA classifica amostras positivas para sêmen mais acuradamente do que o teste de fosfatase ácida (VAN DIEIJEN-VISSER et al. 1988; CULHANE et al. 2008). Recentemente foram lançados no mercado testes para a detecção das semelogeninas I e II, que são as principais proteínas secretadas no sêmen humano e atuam na coagulação do sêmen após a ejaculação (SATO et al. 2004). Os testes de membrana para a detecção de semelogeninas já estão sendo comercializados e apresentam sensibilidade semelhante aos testes de PSA (PANG; CHEUNG, 2007).
1.7.2. PROCEDIMENTOS UTILIZADOS PARA A DETECÇÃO
DE SÊMEN EM LABORATÓRIOS FORENSES
BRASILEIROS
Baseado em comunicações pessoais com Peritos Criminais que trabalham em laboratórios forenses no Brasil, foi constatado que os exames preliminares realizados na maior parte dos laboratórios periciais brasileiros envolvem a realização de exame microscópico para a pesquisa de espermatozoides e do teste de PSA para a detecção de sêmen. O teste com a fosfatase ácida não é utilizado por nenhum dos peritos que responderam à pesquisa (BA, GO, MS, MT, MA, PA e PR). Em todos os casos, o exame de DNA é feito mediante solicitação da Autoridade Policial, independentemente dos resultados obtidos com os testes realizados.
2 OBJETIVOS
2.1. OBJETIVO GERAL
Verificar a validade de se implantar na rotina de um laboratório de genética forense a análise molecular de amostras coletadas de vítimas de estupro, nas quais não foi detectada a presença de espermatozoides.
2.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Verificar a presença de material genético de origem masculina em amostras com ausência de espermatozoides coletadas de vítimas de estupro no Distrito Federal e quantificar o DNA eventualmente presente.
Avaliar a amplificação efetiva de sistemas de microssatélites autossômicos e do cromossomo Y em amostras com presença de DNA masculino e relacionar os resultados obtidos com as proporções de material genético masculino/feminino, verificando em que casos é possível a identificação do padrão alélico de origem masculina nesses dois tipos de marcadores.
Relacionar os resultados obtidos com o histórico de cada caso, desde o momento do crime, as circunstâncias descritas no depoimento da vítima, quando fornecido, até o momento da coleta, visando definir uma estratégia de ação em casos semelhantes no futuro.
Definir critérios que devem ser utilizados para a seleção de amostras coletadas das vítimas de estupro, nas quais não foi detectada a presença de espermatozoides e que devem ser submetidas à analise genética, estabelecendo uma nova rotina no Instituto de Pesquisa de DNA Forense da Polícia Civil do Distrito Federal.
3 MATERIAL E MÉTODOS 3.1. AMOSTRAS
3.1.1. PROCESSO DE SELEÇÃO
Para a realização deste trabalho foram realizadas análises em um total de seiscentas ocorrências de estupro ocorridas entre os anos de 2003 e 2010, cujas amostras de conteúdo vaginal analisadas pelo IML apresentaram resultado negativo para a pesquisa de espermatozoides no exame citológico. Considerando que a ausência de espermatozoides do agressor no corpo da vítima é esperada em alguns casos de estupro, tais como, situações em que: o agressor não chegou a ejacular ou não houve penetração peniana no corpo da vítima; o agressor utilizou preservativo; o tempo transcorrido entre o fato e a coleta da amostra foi superior a quatro dias (DAVIES; WILSON, 1974; WILLOTT; ALLARD, 1982) e, considerando que a ausência de espermatozoides não corresponde necessariamente à ausência de material genético de origem masculina no corpo da vítima (DEKAIRELLE; HOSTE, 2001; SIBILLE et al. 2002; ROEWER, 2009), passou-se à análise dos históricos das ocorrências criminais, buscando identificar indícios da ocorrência de penetração peniana, cuja coleta do material biológico tenha sido realizada dentro do prazo ideal para a detecção de material genético de origem masculina, com vistas a identificar possíveis vítimas de estupradores azoospérmicos ou oligospérmicos, com possibilidade de serem identificados pela tipagem de STRs do cromossomo Y. Foram então selecionados 150 casos de vítimas femininas, nos quais o histórico apontava para a ocorrência de estupro com possível penetração e/ou ejaculação, cuja comunicação do fato fora realizada até quatro dias após a ocorrência do evento delituoso.
Além dos casos selecionados, um conjunto aleatório de 10 casos que não seriam eleitos para o exame foi submetido à análise genética, constituindo um grupo controle para o método de seleção de amostras a serem analisadas.
Da mesma forma, foram escolhidos aleatoriamente, dentre os 150 casos analisados, 10 casos em que a presença de DNA masculino não fora detectada
no processo de quantificação, para serem amplificadas para STRs do cromossomo Y, a fim de atuarem como controle do processo de quantificação.