Entre os exemplares analisados, o comprimento do encéfalo variou entre 16,1 e 21,5mm, com um valor médio de 17,65mm, do polo frontal do córtex cerebral ao limite bulbo-espinal. A análise das secções coronais do encéfalo do A. planirostris coradas pelo método de Nissl revelaram que o CC estende-se desde a porção média da ponte até o nível mais rostral do bulbo ao longo do eixo rostrocaudal. O CC destaca-se como um conjunto celular heterogêneo citoarquitetônicamente, disposto látero-inferiormente ao pedúnculo cerebelar inferior (icp) e lateralmente ao nervo vestibulococlear (8n), tracto espinal do trigêmio (sp5) e corpo trapezoide (tz) ao longo da maior parte de sua extensão (Figura 9). Adicionalmente, é possível verificar que o CC em A. planirostris aparentemente sofre um aumento em seu tamanho ao longo do eixo rostrocaudal, ocupando toda a porção lateral do bulbo nos níveis médios e finalmente apresentando uma aparente redução em seu tamanho, assumindo uma posição mais dorsal nas secções caudais. Assim, verificamos quanto à topografia, uma dorsalização do complexo em relação à parede lateral do tronco encefálico ao longo de sua extensão rostrocaudal (Figura 9A, B e C).
34 Figura 9. Esquemas de secções coronais, baseadas no método do Nissl, do encéfalo de Artibeus planirostris mostrando as delimitações do CC nos níveis rostral, médio e caudal. As linhas pontilhadas demarcam a estrutura de interesse. Barra: 1000 μm.
35 O método de Nissl permitiu identificar todas as subdivisões clássicas descritas até o presente (Figura 10, 11 e 12). O núcleo coclear ventral porção anterior (VCA) surge nas secções rostrais como um pequeno aglomerado de células predominantemente arredondadas (Figura 10A e B). Nas secções médias, o CC sofre um pequeno aumento no seu tamanho, sendo possível verificar a presença do núcleo coclear ventral porção posterior (VCP) com células fusiformes mais esparsamente distribuídas em posição mais inferior (Figura 11A e C). Neste mesmo nível é possível verificar a presença de uma fina camada celular densamente corada pelo método de Nissl, lateral e dorsalmente posicionada ao VCP, a qual denominamos de núcleo coclear ventral anterior porção granular (VCAGr) (Figura 11A e B). A sequência rostrocaudal do CC de A. planirostris apontou o surgimento do núcleo coclear dorsal (DC), superiormente ao VCP nos níveis médios do complexo (Figura 11A).
Figura 10. Fotomicrografias em campo claro de secções coronais, coradas pelo método do Nissl, do encéfalo de Artibeus planirostris mostrando a citoarquitetura do CC em A. Ampliação da caixa em A, mostrando em detalhe a morfologia arredondada das células do VCA (B). Barra: 500 μm em A e 50 μm em B.
36 Adicionalmente, foi possível verificar a gradativa diminuição no tamanho relativo do VCA ao longo da extensão rostrocaudal (Figura 11A). O DC foi caracterizado por subpopulações celulares distintas citoarquitetonicamente, sendo possível identificar a presença de três lâminas celulares dispostas obliquamente em relação ao plano mediano, tendo sido essas classificadas do plano mais profundo ao superficial tanto nas secções médias quanto nas secções caudais: núcleo coclear dorsal profundo (DCDp) (Figura 12A e D); núcleo coclear dorsal fusiforme (DCFu) (Figura 12A e C) e núcleo coclear dorsal molecular (DCMo) (Figura 12A e C). Nas secções em nível caudal do CC, o icp delimita-o medialmente em quase todo o seu eixo dorsoventral, bem como, foi possível verificar a manutenção da laminação celular do DC (Figuras 9C e 12A).
Figura 11. Fotomicrografias em campo claro de secções coronais, coradas pelo método do Nissl, do encéfalo de Artibeus planirostris mostrando a citoarquitetura do CC em A. Ampliação da caixa em A, mostrando em detalhe a morfologia ovóide e pequena (seta) das células do VCAGr (B) e a morfologia fusiforme e espaçada das células do VCP (C). Barra: 500 μm em A e 50 μm em B e C.
37 Figura 12. Fotomicrografias em campo claro de secções coronais, coradas pelo método do Nissl, do encéfalo de Artibeus planirostris mostrando a citoarquitetura do CC em A. Ampliações das caixas em A, mostrando em detalhe a morfologia pequena e granular das células do DCMo (B), a morfologia fusiforme (seta) das células do DCFu (C) e a morfologia arredondada e maior das células do DCDp (D). Barra: 500 μm em A e 50 μm em B, C e D.
A análise morfométrica permitiu caracterizar os perfis celulares do CC, onde observamos a predominância de células arredondadas distribuídas heterogeneamente por toda a extensão do complexo. A morfometria viabilizou a organização do CC em distintas subdivisões. A subdivisão ventral (VC) e dorsal (DC) do complexo foram caracterizadas por células arredondadas e ovóides, apresentando média de área de 127,4±6,7 μm2
e 115,6±8,8 μm2 respectivamente. Em geral, os neurônios no VC apresentaram-se distribuídos de forma difusa dentro dos limites citoarquitetônicos do núcleo comparadas à distribuição neuronal no DC.
38 Em conjunto, foi observada diferença significativa entre as médias das áreas celulares do VC e do DC (p<0,05). Os dados por animais encontram-se descritos na Tabela 2.
Tabela 2. Análise morfométrica. Valores expressos como média ± desvio padrão da área celular em casos investigados por subdivisão no CC.
CC VC DC Animalm / Peso (g) Média ± DP (μm2 ) Média ± DP (μm2) M1 / 45,50 127 ± 22 126 ± 33 M2 / 46,00 122 ± 16 108 ± 37 M3 / 47,00 132 ± 22 115 ± 49 M4 / 39,50 120 ± 15 123 ± 36 M5 / 43,00 136 ± 18 106 ± 38 Média 127,4 ± 6,7a 115,6 ± 8,8a
Legenda: a VC vs DC p < 0.05; teste t; m morcego.
A análise citoarquitetônica confirmou a existência da subdivisão do VC em uma porção anterior denominada VCA caracterizada por formas celulares arredondadas e média de área celular de 138,2±8,2 μm2
. Além disso, identificamos a porção posterior denominada de VCP caracteristicamente com formatos neuronais fusiformes e distribuídos mais difusamente em relação ao VCA. As médias de área celular no VCP foi de 138,2±8,9 μm2, não havendo diferenças significativas entre essas duas subdivisões do complexo por esse parâmetro. Por fim, foi possível identificar VCAGr com células pequenas e ovóides. A média da área celular na porção citada equivale a 27±5,8 μm2. Em conjunto, quando analisados os dados observou-se uma diferença significativa do VCAGr entre as duas outras porções, VCA e VCP (p<0,001). Os valores individuais por animais podem ser observados na Tabela 3.
39 Tabela 3. Análise morfométrica. Valores expressos como média ± desvio padrão da área celular em casos investigados por subdivisão do CN.
Legenda: a DCMo vs DCFu p < 0.001; b DCMo vs DCDp p < 0.001; c DCFu vs DCDp p < 0.001; d VCAGr vs VCA p < 0.001;
e
VCAGr vs VCP p < 0.001; ANOVA + Bonferroni post hoc; m morcego.
DC VC
DCMo DCFu DCDp VCA VCAGr VCP
Animalm / Peso (g) Média ± DP (μm2 ) Média ± DP (μm2 ) Média ± DP (μm2 ) Média ± DP (μm2 ) Média ± DP (μm2 ) Média ± DP (μm2 ) M1 / 45,50 23 ± 8 79 ± 40 121 ± 42 141 ± 25 24 ± 10 138 ± 32 M2 / 46,00 27 ± 10 62 ± 25 120 ± 52 130 ± 4 37 ± 19 133 ± 23 M3 / 47,00 28 ± 11 92 ± 34 134 ± 46 139 ± 5 24 ± 10 150 ± 20 M4 / 39,50 28 ± 9 91 ± 30 110 ± 32 131 ± 20 23 ± 8 127 ± 19 M5 / 43,00 24 ± 10 97 ± 32 123 ± 43 150 ± 22 27 ± 11 143 ± 25 Média 26,0 ± 2,3a, b 84,2 ± 14,1a, c 121,6 ± 8,6 b, c 138,2 ± 8,2d 27 ± 5,8 d, e 138,2 ± 8,9 e
40 Quando analisadas as laminações do DC, observou-se da camada mais profunda à superficial, diferenças na morfologia celular. O DCDp apresentou uma morfologia de células maiores e mais espaçadas entre si, esta porção possui média de área celular de 121,6±8,6 μm2. O DCFu localizado entre as duas laminações, apresentou uma fina camada de células achatadas súpero-inferiormente. A média da área celular desta porção foi de 84,2±14,1 μm2. Por conseguinte, o DCMo é a laminação mais superficial do núcleo, apresentando morfologia de células pequenas, ovóides e granulares. A média da área celular desta porção foi de 26,0±2,3 μm2
. Em conjunto, observou-se diferenças entre as três laminações quando comparadas entre si, sendo a camada do DCDp a que apresentou maiores áreas celulares (p<0,001). Maiores detalhes podem ser observados na Tabela 3.
A partir da análise estereológica, foi possível calcular a estimativa de volume total para o CC, onde a média do volume para o CC direito foi de 1,84±0,29 mm³ e a média do volume para o CC esquerdo foi de 1,98±0,20 mm³. Os antímeros apresentaram volumes semelhantes não havendo diferença significativa entre eles (p=0,4). O volume do CC foi dado a partir da média entre os dois antímeros, totalizando o valor de 1,91±0,10 mm³. Posteriormente foi calculado o coeficiente de erro para a estimativa do volume, apresentando média geral de 2%. Também foi realizado o cálculo do comprimento rostrocaudal do CC, sendo este 7,2 mm. Análise por animal descrita completamente na Tabela 4.
41 Tabela 4. Análise estereológica. Valores brutos seguidos da expressão destes valores como média ± desvio padrão do volume do CC em casos investigados por antímero.
CC
Esquerdo Direito Animalm / Peso (g)
Volume (mm³) Volume (mm³) Média ± DP (mm³)
M1 / 45,50 2,27 1,86 2,06 ± 0,29 M2 / 46,00 2,04 2,20 2,12 ± 0,11 M3 / 47,00 1,98 1,65 1,81 ± 0,23 M4 / 39,50 1,75 1,48 1,61 ± 0,19 M5 / 43,00 1,85 2,01 1,93 ± 0,11 Média 1,98 ± 0,20 1,84 ± 0,29 1,91 ± 0,10 (CE: 2%) Teste t relativo aos
antímeros
NS NS
Legenda: m: morcego; NS: não significativo; CE: coeficiente de erro.
4.2. ANÁLISE DA DISTRIBUIÇÃO DAS PROTEÍNAS LIGANTES DE CÁLCIO NO