Caracterização morfoquantitativa e neuroquímica do complexo coclear no encéfalo de morcego (Artibeus planirostris)

Texto

(1)UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE CENTRO DE BIOCIÊNCIAS DEPARTAMENTO DE MORFOLOGIA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOLOGIA ESTRUTURAL E FUNCIONAL. ERYCK HOLMES ALVES DA SILVA. CARACTERIZAÇÃO MORFOQUANTITATIVA E NEUROQUÍMICA DO COMPLEXO COCLEAR NO ENCÉFALO DE MORCEGO (Artibeus planirostris).. Natal-RN 2018 1.

(2) ERYCK HOLMES ALVES DA SILVA. CARACTERIZAÇÃO MORFOQUANTITATIVA E NEUROQUÍMICA DO COMPLEXO COCLEAR NO ENCÉFALO DE MORCEGO (Artibeus planirostris).. Dissertação de mestrado apresentada ao Programa de Pós-graduação em Biologia Estrutural e Funcional da Universidade Federal do Rio Grande do Norte. Orientador: Prof. Dr. Expedito Silva do Nascimento Júnior. Coorientador: Prof. Dr. Melquisedec Abiaré Dantas Santana.. Natal-RN 2018 2.

(3) Universidade Federal do Rio Grande do Norte - UFRN Sistema de Bibliotecas - SISBI Catalogação de Publicação na Fonte. UFRN - Biblioteca Setorial Prof. Leopoldo Nelson - Centro de Biociências - CB. Silva, Eryck Holmes Alves da. Caracterização morfoquantitativa e neuroquímica do complexo coclear no encéfalo de morcego (Artibeus planirostris) / Eryck Holmes Alves da Silva. - Natal, 2018. 62 f.: il. Dissertação (Mestrado) - Universidade Federal do Rio Grande do Norte. Centro de Biociências. Programa de Pós-Graduação em Biologia Estrutural e Funcional. Orientador: Prof. Dr. Expedito Silva do Nascimento Júnior. Coorientador: Prof. Dr. Melquisedec Abiaré Dantas Santana. 1. Morcegos - Dissertação. 2. Núcleos cocleares Dissertação. 3. Imunofluorescência - Dissertação. I. Nascimento Júnior, Expedito Silva do. II. Santana, Melquisedec Abiaré Dantas. III. Universidade Federal do Rio Grande do Norte. IV. Título. RN/UF/BSE-CB. CDU 599.4. Elaborado por KATIA REJANE DA SILVA - CRB-15/351. 3.

(4) AUTOR: Silva, Eryck Holmes Alves da. TÍTULO: CARACTERIZAÇÃO MORFOQUANTITATIVA E NEUROQUÍMICA DO COMPLEXO COCLEAR NO ENCÉFALO DE MORCEGO (Artibeus planirostris).. Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa de Pós-graduação em Biologia. Estrutural. e. Funcional. da. Universidade Federal do Rio Grande do Norte. DATA DA DEFESA: 28/02/2018 BANCA EXAMINADORA:. ______________________________________________________ Professora Dra Renata Figueiredo Anomal Universidade Federal do Rio Grande do Norte. ______________________________________________________ Professor Drº Melquisedec Abiaré Dantas Santana Fundação Universidade Federal do Vale do São Francisco. ______________________________________________________ Professor Drº Expedito Silva do Nascimento Júnior Universidade Federal do Rio Grande do Norte. 4.

(5) AGRADECIMENTOS. Agradeço primeiramente a Deus por ter me abençoado e me iluminado por todo esse tempo de persistência, me fortalecendo e sempre me mostrando o caminho certo a seguir. Agradeço aos meus avós: Maria da Penha da Silva (in Memorian), Severino Felinto da Silva (in Memorian), Raimundo Alves da Silva e Lindinalva Gomes Alves por todo amor e carinho que têm por mim. Aos meus pais, Edilson Felinto da Silva e Cristiane Alves da Silva que sempre me deram apoio nos momentos difíceis e de indecisões, sempre me incentivando. Essa vitória é de vocês! À minha linda irmã, Raquel Maria que sempre foi minha companheira e faz meus dias mais felizes. Ao meu amigo, Igor Sales que foi de extrema importância nesse processo, me auxiliando a melhorar em cada etapa durante esses dois anos consecutivos. À minha família de coração, que por longos meses e anos, vieram me visitar em Natal ou via Wi-Fi: Hanna Jarine, Heverton Melo, Lucas Bernardo, Matheus Marley, Marcos Vinicius, Gislainy Câmara, Jonatha Gomes e Carlos Andrade todos vocês foram um porto seguro em vários momentos. Ao professor/orientador Expedito Júnior, por abrir o caminho da ciência, e principalmente pelos ensinamentos, contribuições e orientações. Ao professor/coorientador Melquisedec Santana, por ser meu braço direito neste projeto e me ensinar a manter a calma sempre, caro jovem padawan. Aos professores Miriam, Gilberto e Fernando por sempre estarem disponíveis à ajudar. E a Regina que sempre auxiliou no laboratório durante todo o processo. Aos amigos do Labneuro: Dianny, Mayara, Brenna, Naryllene, Nelyane, Alexander, Alane, Klêydson e Raíssa pelo grande apoio, amizade, companheirismo e por me ajudar nos experimentos. Agradeço ao Departamento de Morfologia/UFRN e ao Programa de PósGraduação em Biologia Estrutural e Funcional pela disponibilização da infraestrutura necessária, dando totais condições para a execução da pesquisa. Ao CNPq, FAPERN e a CAPES pelo apoio financeiro.. 5.

(6) LISTA DE FIGURAS. Figura 1. Representação esquemática do sistema auditivo periférico no humano. Figura 2. Representação esquemática das vias auditivas centrais no humano e no rato. Figura 3. Representação esquemática da localização do complexo coclear no humano. Figura 4. Representação das proteínas moduladoras de cálcio EF-hand. Figura 5. Espécime macho de Artibeus planirostris. Figura 6. Distribuição geográfica de Artibeus planirostris. Figura 7. Sistema de ecolocalização de Artibeus planirostris. Figura 8. Árvore molecular das famílias de morcegos descritas. Figura 9. Esquemas de secções coronais, baseadas no método do Nissl, do encéfalo de Artibeus planirostris mostrando as delimitações do complexo coclear nos níveis rostral (A), médio (B) e caudal (C). As linhas pontilhadas demarcam a estrutura de interesse. Barra: 1000 μm. Figura 10. Fotomicrografias em campo claro de secções coronais, coradas pelo método do Nissl, do encéfalo de Artibeus planirostris mostrando a citoarquitetura do CC em A. Ampliação da caixa em A, mostrando em detalhe a morfologia arredondada das células do VCA (B). Barra: 500 μm em A e 50 μm em B. Figura 11. Fotomicrografias em campo claro de secções coronais, coradas pelo método do Nissl, do encéfalo de Artibeus planirostris mostrando a citoarquitetura do CC em A. Ampliação da caixa em A, mostrando em detalhe a morfologia ovóide e pequena (seta) das células do VCAGr (B) e a morfologia fusiforme e espaçada das células do VCP (C). Barra: 500 μm em A e 50 μm em B e C.. 6.

(7) Figura 12. Fotomicrografias em campo claro de secções coronais, coradas pelo método do Nissl, do encéfalo de Artibeus planirostris mostrando a citoarquitetura do CC em A. Ampliações das caixas em A, mostrando em detalhe a morfologia pequena e granular das células do DCMo (B), a morfologia fusiforme (seta) das células do DCFu (C) e a morfologia arredondada e maior das células do DCDp (D). Barra: 500 μm em A e 50 μm em B, C e D. Figura 13. Fotomicrografias da imunofluorescência de secções coronais do encéfalo de Artibeus planirostris mostrando a expressão de CB (vermelho) nos neurônios do CC no sentido rostrocaudal em A, D e G. Expressão de CR (verde) nos neurônios do CC no sentido rostrocaudal em B, E e H. Sobreposição das marcações CB (vermelho) + CR (verde) no CC nos três níveis: rostral, médio e caudal em C, F e I. Os asteriscos representam ampliação da área para melhor visualização dos neurônios. Barra: 100 μm. Figura 14. Fotomicrografias da imunofluorescência de secções coronais do encéfalo de Artibeus planirostris mostrando a expressão de PV (verde) nos neurônios do CC no sentido rostrocaudal em A, D, G e J. Expressão de CR (vermelho) nos neurônios do CC no sentido rostrocaudal em B, E, H e K. Sobreposição das marcações PV (verde) + CR (vermelho) no CC nos três níveis: rostral, médio e caudal em C, F, I e L. Os asteriscos representam ampliação da área para melhor visualização dos neurônios. Barra: 100 μm.. 7.

(8) LISTA DE ABREVIAÇÕES. 4V. Quarto ventrículo. 8n. Nervo vestibulococlear. Cb. Cerebelo. CB. Calbindina. CaBP. Proteínas ligantes de cálcio. CC. Complexo coclear. CN. Núcleo coclear. CR. Calretinina. DC. Núcleo coclear dorsal. DCDp. Núcleo coclear dorsal, camada profunda. DCFu. Núcleo coclear dorsal, camada fusiforme. DCMo. Núcleo coclear dorsal, camada molecular. icp. Pedúnculo cerebelar inferior. mcp. Pedúnculo cerebelar médio. PV. Parvalbumina. s5. Nervo trigêmio, parte sensitiva. sp5. Tracto espinal do trigêmio. SpVe. Núcleo vestibular espinal. tz. Corpo trapezoide. VBC. Complexo vestibular. VC. Núcleo coclear ventral. VCA. Núcleo coclear ventral, parte anterior. VCAGr. Núcleo coclear ventral, camada granular. VCP. Núcleo coclear ventral, parte posterior. 8.

(9) SUMÁRIO RESUMO 1.. INTRODUÇÃO_____________________________________________________. 12. 1.1 Sistema auditivo periférico____________________________________________. 12. 1.2 Sistema auditivo central______________________________________________. 14. 1.3 Proteínas ligantes de cálcio____________________________________________. 16. 1.4 Modelo experimental_________________________________________________. 20. 1.4.1 – Taxonomia e filogenia__________________________________________. 22. 1.5 JUSTIFICATIVA____________________________________________________. 24. 2.. OBJETIVOS_______________________________________________________. 25. 2.1 Geral_____________________________________________________________. 25. 2.2 Específicos________________________________________________________. 25. 3.. METODOLOGIA____________________________________________________. 26. 3.1 Sujeitos___________________________________________________________. 26. 3.2 Métodos de identificação taxonômica____________________________________. 26. 3.3 Procedimentos______________________________________________________. 27. 3.3.1 – Anestesia____________________________________________________. 27. 3.3.2 – Perfusão____________________________________________________. 27. 3.3.3 - Remoção dos encéfalos_________________________________________. 28. 3.3.4 – Microtomia___________________________________________________. 28. 3.3.5 - Método de Nissl_______________________________________________. 29. 3.3.6 – Imunofluorescência____________________________________________. 29. 3.4 Obtenção das imagens_______________________________________________. 31. 3.5 Análise morfométrica_________________________________________________. 31. 3.6 Análise estereológica________________________________________________. 32. 3.7 Análise estatística___________________________________________________. 32. 4.. 33. RESULTADOS_____________________________________________________ 4.1 - Caracterização citoarquitetônica, morfométrica e estereológica do complexo coclear____________________________________________________________. 33. 4.2 - Análise da distribuição das proteínas ligantes de cálcio no complexo coclear____________________________________________________________. 41. 5.. DISCUSSÃO_______________________________________________________. 46. 6.. CONCLUSÃO______________________________________________________. 51. 7.. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS_____________________________________. 52 9.

(10) RESUMO. O sistema auditivo é de extrema importância para a sobrevivência das espécies. Tanto os animais que vivem em seu ambiente natural, bem como aqueles criados em condições controladas de laboratório precisam da audição para detectar perigos, tais como predadores e veículos motorizados e responder a vocalização de animais da mesma ou de outras espécies. A orelha é denominada de órgão vestíbulococlear, por participar diretamente da audição e da manutenção do equilíbrio. A navegação espacial por parte dos quirópteros está amplamente associada ao mecanismo de ecolocalização, o qual consiste na emissão de ondas sonoras pelo aparelho fonador e consequente reflexo em forma de eco, captado pelo aparelho vestíbulococlear. Embora diversos estudos abordem a dinâmica funcional dos sistemas de ecolocalização de quirópteros, poucos trabalhos se dedicam a uma análise morfológica dos centros neurais envolvidos no processamento de tais informações. O presente estudo tem como objetivo descrever a organização morfoquantitativa e neuroquímica do complexo coclear no encéfalo do morcego Artibeus planirostris. Utilizando o método de Nissl foram identificadas todas as subdivisões clássicas descritas até o presente em outras espécies: núcleo coclear ventral (parte anterior, parte posterior e camada granular) e núcleo coclear dorsal (camada profunda, camada fusiforme e camada molecular). A análise neuroquímica das proteínas ligantes de cálcio, através da técnica de imunofluorescência permitiu identificar a presença de terminais e pericários imunorreativos a CB, CR e PV de formas distintas, apresentando especificidades em cada porção do complexo coclear. Traçando um comparativo entre os vertebrados, o presente estudo fornece a primeira descrição detalhada dos aspectos morfoquantitativos do morcego Artibeus planirostris que se mostrou bastante similar às características encontradas nos roedores, especificamente o rato e a chinchila. A neuroquímica se mostra diferente aos primatas humanos e não humanos, podendo ser uma relação direta com a ecolocalização utilizada pelo modelo experimental.. Palavras-chave:. sistema. auditivo,. ecolocalização,. citoarquitetura,. imunofluorescência, morcegos. 10.

(11) ABSTRACT. The auditory system is extremely important for the survival of the species. Those that live in your natural environment, as well as those created under controlled conditions of laboratory need the hearing to detect dangers such as predators and motor vehicles, respond to vocalizations of animals of the same or other species. The ear is called a vestibulocochlear organ, because it participates directly in hearing and in maintaining balance. Spatial navigation by chiroptera is widely associated with the mechanism of echolocation, which consists of the emission of sound waves by the vocal apparatus and consequent echo reflex, captured by the vestibulocochlear apparatus. Although several studies address the functional dynamics of the chiroptera echolocation systems, few papers are dedicate to a morphological analysis of the neural centers involved in the processing of such information. The present study aims to describe the morphoquantitative and neurochemical organization of the cochlear complex in bat Artibeus planirostris brains. Using the Nissl’s method all classical subdivisions described up to the present in other species were identified: ventral cochlear nucleus (anterior part, posterior part and granular layer) and dorsal cochlear nucleus (deep layer, fusiform layer and molecular layer). The neurochemical analysis of the calcium binding proteins by means of the immunofluorescence technique allowed to identify the presence of immunoreactive terminals and pericals to CB, CR and PV in different ways, presenting specificities in each part of the cochlear complex. Comparing vertebrates, the present study provides a first detailed description of the morphoquantitative aspects of the bat Artibeus planirostris, which was very similar to the characteristics found in rodents, specifically the rat and the chinchilla. The neurochemistry is different to human and non-human primates, and may be a direct relation with the echolocation used by the experimental model.. Key words: auditory system, echolocation, cytoarchitecture, immunofluorescence, bats.. 11.

(12) 1. INTRODUÇÃO 1.1 SISTEMA AUDITIVO PERIFÉRICO O sistema auditivo é essencialmente importante na sobrevivência das espécies, pensando nos animais que vivem em seu ambiente natural, bem como aqueles domesticados e criados em ambiente humanizado. Existe a necessidade do auxílio da audição para detectar alguns perigos, tais como predadores e veículos motorizados e responder a vocalização de animais da mesma ou de outras espécies (STRAIN e MYERS, 2006). O sistema auditivo periférico é representado pela orelha, denominada de órgão vestibulococlear, por participar diretamente da audição e da manutenção do equilíbrio (DYCE et al., 2010; LIEBICH e KÖNIG, 2011). Anatomicamente a orelha se divide em externa, média e interna (Figura 1). Caracterizando-as, a orelha externa consiste em aurícula e meato acústico externo. A aurícula (formada de cartilagem articular recoberto por pele) apresenta uma forma tortuosa e tem função de captar os sons e transportar até o meato acústico externo (LIEBICH e KÖNIG, 2011), que é uma espécie de canal que se alonga até a membrana timpânica. Sua função é direcionar o som captado pela aurícula até a membrana, a qual separa o meato acústico externo da orelha média (STRAIN e MYERS, 2006). A orelha média se caracteriza como uma cavidade preenchida por ar no osso temporal, a qual se comunica com a faringe através da tuba auditiva (GETTY, 1986). A tuba auditiva apresenta como função equilibrar a pressão dos dois lados da membrana timpânica (DYCE et al., 2010). A cavidade timpânica encontra-se no interior do osso temporal (porção petrosa) e é onde estão presentes os três ossículos auditivos: martelo, bigorna e estribo, importantes na condução sonora. Estes se comunicam com a janela do vestíbulo, conectando-se assim à orelha interna (LIEBICH e KÖNIG, 2011). A orelha interna consiste de dois labirintos: o membranoso, com a presença de um líquido (endolinfa) e o ósseo. Os dois labirintos estão separados por um espaço, chamado perilinfático, o qual é preenchido por um líquido, a perilinfa (GETTY, 1986). A orelha interna consiste em duas porções: coclear e vestibular, conforme a sua respectiva função. A porção coclear recebe inervação do ramo 12.

(13) coclear do VIII par craniano (nervo vestibulococlear) relacionado ao sentido de audição. A porção vestibular funciona principalmente para o equilíbrio e apresenta inervação pelo ramo vestibular do VIII par craniano (FRANDSON, 1979).. Figura 1. Representação esquemática do sistema auditivo periférico no humano. (Fonte: Anatomy Organ, 2016).. A cóclea é um órgão com característica espiralada que se assemelha a um caracol. Apresenta divisão em três ductos: rampa vestibular, rampa média e rampa timpânica (STRAIN e MYERS, 2006; LIEBICH e KÖNIC, 2011). O número de espirais na cóclea varia entre as espécies. Os seres humanos têm 2,75 espirais, cães 3,25 e equinos 2,5 espirais (STRAIN e MYERS, 2006). O Órgão Espiral é a porção da cóclea sensível ao som. Essa estrutura é encontrada sobre a membrana basilar da rampa média e é dotada de células ciliadas internas, as quais detectam o som e células ciliadas externas, as quais amplificam o som (MOYES e SCHULTE, 2010). Em cada porção espiralada ao longo do eixo da cóclea existe a presença de um gânglio espiral, representação de um aglomerado de células, de onde saem axônios dos neurônios que formam o nervo coclear, o qual se une ao nervo vestibular formando o nervo vestibulococlear (HENKEL, 2006). 13.

(14) 1.2 SISTEMA AUDITIVO CENTRAL A detecção do som começa na cóclea, onde a codificação neural das informações de frequência sonora é relativamente simples (LUO, 2009). Com isso, os nervos vestibulococleares penetram no sistema nervoso central na altura do bulbo (Figura 2), próximos à saída dos nervos facial e trigêmio, e realizam sinapses no complexo coclear (CC) (DEWEY, 2006). O CC, representado pelos núcleos cocleares (CN), recebe a informação auditiva, a qual inicialmente foi processada na cóclea. Com isso apresentam-se importantes em termos de seu papel na decodificação neural das informações de frequência sonora e a transformação dessa informação de forma mais simples até mais complexa. Além disso, devido ao fato de a via de projeção ascendente se originar dos CN e que os CN enviam axônios para núcleos em nível superior de forma tonotópica (RYUGO et al., 1981), o mapa tonotópico do CN representa uma plataforma de trabalho da função auditiva no sistema auditivo central. O CC de mamíferos consiste em duas divisões, isto é, núcleo coclear ventral (VC) subdividido em porção anterior (VCA) e porção posterior (VCP) e núcleo coclear dorsal (DC). A representação neural de frequências de som no CC foi estudada em várias espécies, como gatos (BOURK et al., 1981), morcegos (FENG e VATER, 1985) e ratos (YAJIMA e HAYASHI, 1989; KALTENBACH e LAZOR, 1991; WILLOTT et al., 1982). Os axônios de neurônios do VC cruzam formando o corpo trapezoide e se projetam para o complexo olivar superior na ponte, onde realizam sinapses. A partir desse complexo, são emitidos axônios que formam um feixe chamado de lemnisco lateral (localizado na ponte) e se projetam ao colículo inferior. Os neurônios do DC não fazem sinapse no complexo olivar superior, seguem direto e realizam sinapse no colículo inferior no mesencéfalo (DEWEY, 2006; FERNÁNDEZ et al., 2010; LENT, 2010). O colículo inferior recebe todas as fibras auditivas originadas em níveis mais baixos. As fibras nervosas saem do mesencéfalo para o núcleo geniculado medial, localizado no tálamo, que emite fibras nervosas corticais até o lobo temporal do córtex cerebral, onde se situam as áreas auditivas (DEWEY, 2006; FERNÁNDEZ et al., 2010, LENT, 2010). 14.

(15) O DC, que corresponde ao tubérculo acústico, localiza-se dorso-lateralmente ao pedúnculo cerebelar inferior (icp), e o VC localiza-se ventralmente ao icp (Figura 3). A organização tonotópica que surge na cóclea é preservada tanto no VC quanto no DC, de modo que neurônios localizados na porção dorsal respondam a frequências mais agudas e aqueles localizados mais ventralmente respondam a frequências mais graves (RYUGO e PARKS, 2003; MACHADO, 2003; SNELL, 2003).. Figura 2. Representação esquemática das vias auditivas centrais no humano, lado esquerdo, e no rato, lado direito. (BUTLER e LOMBER, 2013; CASPARY et al., 2008).. 15.

(16) Figura 3. Representação esquemática da localização do complexo coclear no humano. (KOMUNE et al., 2015). Em roedores, o DC apresenta-se estratificado, com a presença de uma camada molecular superficial, caracterizada pelo seu conteúdo em zinco (FÉRES e CAIRASCO, 2003). Os principais neurônios de projeção são as células fusiformes, apresentando orientação radialmente à camada superficial (HUDSPETH, 2000; MACHADO, 2003). Já o VC, apresenta as células estreladas e as células em arbusto (HUDSPETH, 2000) e a marcação por zinco é limitada à periferia do VC (FÉRES e CAIRASCO, 2003). Vale salientar que existem evidências de correlação entre os aspectos morfológicos do neurônio e a sua resposta funcional, sendo assim importante no aspecto da manutenção da tonotopia coclear, resolução temporal, codificação de intensidade e tons complexos (AQUINO e ARAÚJO, 2002). 1.3 PROTEÍNAS LIGANTES DE CÁLCIO O cálcio desempenha um papel decisivo na regulação de uma grande variedade de processos celulares, incluindo metabolismo celular, expressão de genes, dinâmica do citoesqueleto, ciclo celular, morte celular, neurotransmissão e processos de transdução de sinal (BRAUNEWELL e GUNDELFINGER, 1999). Por exemplo, uma elevação descontrolada de cálcio intracelular leva a uma excessiva ativação celular, injúria e até mesmo a morte da célula (CELIO, 1990). 16.

(17) Proteínas ligantes de cálcio (CaBP) servem frequentemente como proteínas efetoras ou moduladoras para traduzir sinais de cálcio em respostas fisiológicas adequadas. Ao longo dos anos um grande número destas moléculas de ligação de cálcio tem sido identificado, refletindo a importância do cálcio e a sua função reguladora na célula (BRAUNEWELL e GUNDELFINGER, 1999). Funcionalmente as proteínas efetoras de cálcio podem ser agrupadas em diferentes famílias, baseandose nas características estruturais distintas dos seus sítios de ligação ao cálcio. As CaBP podem ser subdivididas em três grupos: os domínios C2, as proteínas EFhands e as anexinas (GERKE et al., 2005). O domínio C2 é um motivo de ligação de cálcio que foi reconhecido pela primeira vez como o segundo domínio conservado da proteína cinase C, sendo de onde o termo 'C2' deriva. Acredita-se que o domínio C2 esteja envolvido na ligação fosfolipídica dependente de cálcio (DAVLETOV e SUDHOF, 1993). Desde que os domínios relacionados ao domínio C2 foram encontrados também em proteínas que não se ligam ao cálcio, outras funções putativas para o domínio C2, como por exemplo, ligação a inositol-1,3,4,5-tetrafosfato tem sido sugerido (BRAUNEWELL e GUNDELFINGER, 1999). O segundo grupo é formado pelas CaBP que exibem como característica estrutural o motivo EF-hand. Este é um motivo de ligação de cálcio que contém duas hélices orientadas praticamente perpendiculares uma a outra, flanqueando uma alça que é tipicamente de 12 resíduos de comprimento. O íon Ca2+ ligado é coordenado por sete ligantes de oxigênio em um arranjo de bipirâmide pentagonal (GERKE et al., 2005). Essa estrutura lembra uma mão direita com o polegar e indicador abertos, representando as duas α-hélices e o terceiro dedo fechado, representando a alça (CELIO, 1990) (Figura 4).. 17.

(18) Figura 4. O motivo EF-hand consiste em uma α-hélice (simbolizada pelo dedo indicador), uma alça em torno do íon Ca2+ (representada pelo dedo médio fechado) e uma segunda α-hélice (simbolizada pelo polegar). (YÁÑEZ et al., 2012) As proteínas anexinas, cujos membros interagem com fosfolipídios e membranas celulares na presença de cálcio formam uma família do tipo não EFhand por seu sítio de ligação ao cálcio ser diferente (HEIZMANN e HUNZIKER, 1991). Os sítios de ligação de cálcio das anexinas diferem fundamentalmente do tipo EF-hand porque somente cinco dos sete sítios de ligação são fornecidos por oxigênios e porque nenhuma estrutura EF-hand do tipo hélice-alça-hélice é discernível (GERKE et al., 2005). Algumas proteínas EF-hand possuem papéis regulatórios, interagindo com outras proteínas, sendo comumente denominadas 'proteínas sensores de cálcio', como por exemplo a calmodulina e a troponina C (SCHWALLER, 2010). Outras estão envolvidas com as funções de tamponamento e transporte de cálcio, e são denominadas 'proteínas ligantes de cálcio', como é o caso da parvalbumina (PV), calbidina (CB) e calretinina (CR). Essa classificação foi primeiramente proposta por Silva e Reinach (1991) e promovem uma boa correlação entre suas características estruturais e funcionais. Entretanto, se presente em concentrações suficientemente altas, proteínas sensores podem funcionar como proteínas tampões (SCHWALLER, 2010). As proteínas tampões, como a PV, CB e CR, representam um sistema mais passivo responsável pela diminuição da amplitude dos sinais de cálcio (HOF et al., 1999). Um tampão intracelular, como a CB, precisa somente ligar o cálcio 18.

(19) eficientemente, e não requer mudanças conformacionais e exposição hidrofóbica, como a calmodulina e a troponina C (SKELTON et al., 1994). A PV foi originalmente purificada a partir de músculo de peixes e devido ao seu baixo peso molecular (12 kDa) e uma elevada solubilidade em água, foi chamada de parvalbumina (parvusis em latim significa pequeno), embora ela não tenha nenhuma semelhança funcional com soro de albumina (YÁÑEZ et al., 2012). A primeira estrutura prototípica de um domínio EF-hand foi determinada em PV, que curiosamente é uma proteína EF-hand atípica. PV possui um número ímpar de domínios EF-hand (3), e os sítios de ligação de Ca2+ são sítios mistos para Ca2+ e Mg2+ (SCHWALLER, 2010). Trabalhos com imunoistoquímica já confirmaram que PV além de estar presente no músculo, também está bem distribuído em tecidos não musculares como ossos, dentes, pele, encéfalo, próstata, glândulas seminais, testículos e ovários de ratos (ARIF, 2009). A CB foi extraída a partir do duodeno de aves, onde facilita o transporte do cálcio através da mucosa, e em seguida foi detectada e mapeada no encéfalo (HOF et al., 1999). CB possui 6 domínios EF-hand, quatro dos quais ligam Ca2+ com média ou alta afinidade (SCHWALLER, 2010). A CR foi inicialmente descoberta na retina de aves, de onde surgiu seu nome (ROGERS, 1987). É a proteína ligante de cálcio descrita mais recentemente, sendo abundantemente expressa no sistema nervoso, e possui sequências de aminoácidos homólogas a CB (JACOBOWITZ e WINSKY, 1991). CR tem 6 domínios EF- hands, cinco dos quais são capazes de ligar íons Ca2+ (SCHWALLER, 2010). Essas três CaBP são particularmente interessantes de um ponto de vista morfológico, uma vez que elas ocorrem somente em certas subpopulações de células nervosas no sistema nervoso central e periférico. Assim, elas podem ser usadas. seletivamente. para. visualizar. células,. vias. e. núcleos. encefálicos. (ANDRESSEN et al., 1993).. 19.

(20) 1.4 MODELO EXPERIMENTAL Um. grupo. de. mamíferos,. os. quirópteros,. apresenta. estruturas. caracteristicamente diferenciadas de orientação sensório-motora, através de um sistema sonar, capaz de detectar a presença de barreiras físicas ou até mesmo presas no ambiente (SCHNITZLER e KALKO, 2001). Com isso, este grupo de mamíferos apresenta um sistema auditivo muito mais integrado ao sistema motor quando comparado ao sistema visual. O Artibeus planirostris (Chiroptera, Phyllostomidae) é um morcego que apresenta pelagem de coloração castanho-acinzentada e listras faciais pouco evidentes (Figura 5). É uma espécie de tamanho médio, com comprimento do corpo variando de 7,5 a 11 cm, e massa corporal entre 40 e 69 g (REIS et al., 2013). Apresenta ampla distribuição geográfica, ocorrendo em zonas tropicais de diversos países ao longo da metade norte da América do Sul (HOLLIS, 2005). É um morcego comum em muitas regiões do Brasil (Figura 6) (ZORTÉA, 2007).. Figura 5. Espécime macho de Artibeus planirostris. (Foto: Marília Barros).. 20.

(21) Figura 6. Distribuição geográfica do Artibeus planirostris, destacada em amarelo. (Fonte: The IUCN Red List). Como animais noturnos, os morcegos têm uma menor proporção de cones na retina, uma estrutura responsável pela percepção de cores. No entanto, não são cegos e, utilizam de um processo chamado ecolocalização, ilustrado na figura 7, para se orientar num dado espaço e/ou seu habitat. Por utilizar primariamente do sistema de ecolocalização, os olhos são pequenos, as orelhas são grandes, o tragus bem desenvolvido e na maior família brasileira, Phyllostomidae, a folha nasal proeminente toma parte importante no direcionamento dos ultrassons que saem pelas narinas (NEUWEILER, 2000). Durante este processo, eles transmitem sons de alta frequência pela boca e nariz, os quais refletem por superfícies dos ambientes, indicando. a. direção. e. distância. relativa. dos. objetos. (FENTON,. 1992).. q. Figura 7. Sistema de ecolocalização do Artibeus planirostris. (Baseado em REIS et al., 2013; HOLLIS, 2005). 21.

(22) 1.4.1 TAXONOMIA E FILOGENIA Os morcegos, mamíferos placentários, pertencem à ordem Chiroptera, a qual tem sido tradicionalmente dividida, com base em caracteres morfológicos de espécies fósseis e atuais, em duas subordens monofiléticas: Megachiroptera e Microchiroptera (SIMMONS, 1994; SIMMONS e GEISLER, 1998) e composta por cerca de 1.100 espécies (KUNZ e LUMSDEN, 2003). Os megaquirópteros correspondem a uma única família (Pteropodidae), à qual pertencem as espécies de raposas-voadoras que ocorrem exclusivamente nas zonas tropicais do Velho Mundo (NEUWEILER, 2000). Já os microquirópteros são cosmopolitas e englobam as 17 demais famílias (SIMMONS, 1998), incluindo a família Phyllostomidae à qual pertence A. planirostris. Os microquirópteros desenvolveram um complexo sistema de ecolocalização laringeal ausente nas raposas-voadoras, que apresentam apenas algumas espécies cavernícolas (gênero Rousettus) capazes de utilizar um sistema rudimentar de ecolocalização a partir de estalidos da língua (ALTRINGHAM, 1996). Atualmente, porém, esta classificação tem sido contrariada por estudos filogenéticos baseados em dados moleculares, que indicam que alguns grupos de morcegos com ecolocalização sofisticada compartilham um ancestral comum com as raposas-voadoras (TEELING et al. 2005; TEELING, 2009; VAN DER BUSSCHE e HOOFER, 2004). Dessa forma, a família Pteropodidae e mais cinco famílias de microquirópteros foram agrupados na subordem Yinpterochiroptera, e as famílias restantes, incluindo a Phyllostomidae, na subordem Yangochiroptera (Figura 8) (JONES e TEELING, 2006; TEELING et al., 2012).. 22.

(23) Figura 8. Árvore molecular das famílias de morcegos descritas. Família do modelo experimental em destaque no tracejado em vermelho. (Adaptado de JONES e TEELING, 2006). Dentre os diferentes táxons de morcegos, a família Mormoopidae é a mais filogeneticamente próxima da família Phyllostomidae (DATZMANN et al., 2010; JONES e TEELING, 2006). Muito provavelmente, o ancestral comum de ambas as famílias foi um insetívoro, uma vez que a insetivoria estrita é a estratégia de forrageio adotada pelos mormoopídeos e pela maciça maioria das espécies de morcegos. Morcegos filostomídeos especializados no consumo de frutos, como o gênero Artibeus, representam condições mais derivadas e recentes em relação às espécies insetívoras/onívoras, hematófagas, carnívoras e nectarívoras da família (BAKER et al., 2012). As relações filogenéticas entre as diferentes espécies de Artibeus têm sido amplamente debatidas nos últimos anos (LIM et al., 2004; MARQUES-AGUIAR, 1994; VAN DEN BUSSCHE et al., 1998). Estudos recentes indicam que A. planirostris é espécie irmã de A. amplus e estreitamente relacionada à A. obscurus (REDONDO et al., 2008), porém a filogenia do gênero ainda não é consensual.. 23.

(24) 1.5 JUSTIFICATIVA O sistema auditivo do morcego está envolvido em seu dia a dia devido ao processo chamado ecolocalização, emitindo ondas sonoras as quais refletem e retorna em forma de eco, conectando assim diversas áreas do sistema nervoso, entre elas o complexo coclear. Levando em consideração a importância fisiológica e comportamental do sistema auditivo, como no caso do gênero Artibeus, é fundamental aprofundar o conhecimento acerca da organização desse sistema, uma vez que alguns núcleos do complexo coclear podem apresentar localização, citoarquitetura e neuroquímica distintas de outras espécies já estudadas. Adicionalmente, a ausência de estudos mais detalhados sobre a anatomia quantitativa do complexo coclear em quirópteros impedem uma análise comparativa refinada entre as espécies com o intuito de fornecer maior clareza sobre as rotas evolutivas do sistema auditivo ao longo do tempo. O presente trabalho visa preencher lacunas importantes na compreensão da filogenia do complexo coclear, através da utilização de técnicas para caracterização citoarquitetônica e neuroquímica, associadas a ferramentas de neuroanatomia quantitativa.. 24.

(25) 2. OBJETIVOS 2.1 GERAL Caracterizar a organização morfológica do complexo coclear no encéfalo de morcego A. planirostris.. 2.2 ESPECÍFICOS . Delimitar citoarquitetonicamente e por imunofluorescência para CaBP, os núcleos cocleares no encéfalo do morcego A. planirostris;. . Estimar o volume total do complexo coclear;. . Estimar o comprimento rostrocaudal do complexo coclear;. . Comparar a média das áreas dos corpos neuronais dos núcleos cocleares.. 25.

(26) 3. METODOLOGIA 3.1 SUJEITOS Cinco animais adultos foram utilizados no experimento. Os exemplares de A. planirostris utilizados no estudo foram capturados no campus da Universidade Federal do Rio Grande do Norte - UFRN, Natal (RN), Nordeste do Brasil (Licença SISBIO Nº 25233-2). Os procedimentos de coleta aconteceram em quatro diferentes ocasiões: 18/10/2012, 21/11/2012 e 26/02/2013 em um fragmento de vegetação, no Centro de Biociências (coordenadas em UTM: 25M 256251 / 9353764), e no dia 13/06/2013 num agrupamento arbóreo, nas proximidades da Reitoria da UFRN (coordenadas em UTM: 25M 256226 / 9354214). Em relação às capturas, foram utilizadas de uma a três redes de neblina Ecotone® de nylon, com dimensões 12 x 3 m e tamanho de malha 19 x 19 mm. As redes foram armadas no nível do solo e, em cada noite de captura, foram abertas logo após o pôr do sol e permaneceram expostas por duas horas consecutivas. Cada indivíduo capturado foi analisado quanto ao sexo e à faixa etária. Foram mantidos em sacos de algodão até o término da amostragem e transporte até o laboratório. Os demais indivíduos foram soltos no mesmo local de captura. Todos os animais capturados para o estudo foram perfundidos imediatamente após a coleta no Laboratório de Neuroanatomia – Departamento de Morfologia – DMOR/UFRN. Para o presente estudo, todos os cuidados foram tomados no sentido de evitar dor e sofrimento aos animais durante os procedimentos experimentais, seguindo estritamente às normas e princípios da Lei Arouca, a qual versa sobre o tratamento de animais em pesquisas e atividades científicas e às normas estabelecidas pelo Comitê de Ética para uso de Animais da UFRN (CEUA). O projeto referente a este estudo foi aprovado pelo CEUA (protocolo N.º 009/2012 – anexo). 3.2 MÉTODOS DE IDENTIFICAÇÃO TAXONÔMICA Todos os espécimes capturados e utilizados no estudo foram identificados por uma especialista em quirópteros (Msc. Marília Abero Sá de Barros). Em campo, a 26.

(27) identificação até o nível de espécie foi baseada em um conjunto de características morfológicas externas de acordo com os estudos propostos por Aguirre et al. (2009), Haynes e Lee Jr. (2004), Hollis (2005), Miranda et al. (2011), Reis et al. (2013) e Simmons e Voss (1998). Para diferenciação de espécies do gênero Artibeus, estes estudos levam em consideração, especialmente, padrões da pelagem, das listras faciais e da morfologia da folha nasal. A espécie foi identificada como Artibeus planirostris por apresentar: 1. Pelagem castanho-claro ou cinza-clara, curta, pouco densa e áspera; 2. Listras faciais pouco evidentes; 3. Borda inferior da folha nasal completamente livre; 4. Antebraço com poucos pelos; 5. Pontas das asas esbranquiçadas; 6. Bordas das orelhas e trago de coloração não diferenciada; 7. Ausência de máscara escura ao redor dos olhos. Para confirmação da identificação taxonômica em laboratório, um indivíduo da espécie foi sacrificado para retirada e exame detalhado do crânio. A confirmação da espécie com base na morfometria craniana foi realizada segundo os estudos de Barquez et al. (1999), Haynes e Lee Jr. (2004), Hollis (2005) e Simmons e Voss (1998). Esta análise confirmou a identificação do indivíduo como A. planirostris, devido à ocorrência das seguintes características morfológicas: 1. Constrição pósorbitária ampla (> 7,3 mm); 2. Arco supraorbital pouco acentuado; 3. Processo pósorbital pouco desenvolvido; 4. Presença de terceiro molar superior; 5. Largura do canino (> 8,4 mm); 6. Maior comprimento do crânio (> 29.5 mm). 3.3 PROCEDIMENTOS 3.3.1 ANESTESIA Os animais foram anestesiados com uma injeção intraperitoneal de ketamina (5mg/Kg), xilazina (0,5mg/Kg), diazepam (0,5mg/Kg) e cloridrato de tramadol (5mg/Kg). 3.3.2 PERFUSÃO Depois de anestesiados, cada animal foi submetido à perfusão transcardíaca, compreendendo os seguintes passos:. 27.

(28) I-. Posicionamento do animal em decúbito dorsal sobre tela de arame e sob ponto de água;. II-. Toracotomia, com incisão de pele, músculos e arco costal, sendo estes removidos em bloco, para exposição do coração;. III-. Cardiopunção no ventrículo esquerdo, utilizando uma agulha 16G (1,5 x 10 mm), a qual foi direcionada para a aorta ascendente, seguindo uma incisão no átrio direito. A agulha foi conectada a uma bomba peristáltica (Cole-Parmer), passando-se 150 ml de solução salina a 0,9% em tampão fosfato 0,1M, pH 7,4 com heparina (Parinex, Hipolabor, 2ml/1000ml de solução salina) a um fluxo de 60 ml/min, seguida de 300 ml de solução de paraformaldeido 4% em tampão fosfato 0,1M, pH 7,4, dos quais 150 ml a um fluxo inicial de 60 ml/min e 150 ml o fluxo final de 30 ml/min, durando todo o procedimento de perfusão aproximadamente em média 30 minutos.. 3.3.3 REMOÇÃO DOS ENCÉFALOS Após perfundidos, os encéfalos foram retirados da cavidade craniana, com uso de um osteótomo. Em seguida, foram pós-fixados na mesma solução fixadora utilizada na perfusão por duas horas e então colocados em solução sacarose 30% em tampão fosfato 0,1 M, pH 7,4, a 4 ºC, até serem submetidos à microtomia. 3.3.4 MICROTOMIA Os encéfalos foram congelados através de gelo seco e depois seccionados utilizando um micrótomo de deslizamento (Leica SM 2000R). Foram obtidas secções coronais de 30 μm de espessura, as quais foram distribuídas sequencialmente em 6 compartimentos, em um meio líquido contendo tampão fosfato 0,1M, pH 7,4, de maneira cíclica e sequenciada. A distância entre uma secção e a outra imediatamente seguinte de um mesmo compartimento é de aproximadamente 180 μm. Os cortes de um compartimento foram montados em lâminas de vidro e submetidos à coloração de Nissl, o que permitiu a demarcação das estruturas. Os cortes selecionados dos demais compartimentos restantes (cinco) foram armazenados em solução anticongelante (sacarose, 28.

(29) etileno glicol e tampão fosfato 0,05M pH 7,4) e conservados a -20 ºC para utilização posterior em procedimentos de imunofluorescência.. 3.3.5 MÉTODO DE NISSL Para o estudo da citoarquitetura foi utilizado à coloração pelo método de Nissl, utilizando o corante thionina. Através do método de Nissl, foram corados: o retículo endoplasmático rugoso, o núcleo e o nucléolo das células, podendo ser elas tanto neurônios como células da glia, tornando assim possível a identificação de seu tamanho, forma e localização. A cor da marcação é azularroxeada. Foram montados em lâminas de vidro gelatinizados os cortes de uma das séries de cada encéfalo. Os cortes foram montados em lâminas gelatinizadas e deixados secar por aproximadamente uma semana. Em seguida, foram submetidos à coloração de Nissl, passando inicialmente por uma desidratação dos cortes em concentrações crescentes de alcoóis etílicos (1x 70% por 2h, 2x 95% por 3 minutos cada, 2x 100% por 3 minutos cada) sendo posteriormente diafanizadas em xilol (1x por 3 minutos e 1x por 30 minutos). Os cortes foram reidratados em concentrações decrescentes de alcoóis etílicos por 2 minutos cada, chegando a thionina onde ficou por 40 segundos. Foram então mergulhados 15 vezes em água destilada e novamente desidratados (álcool 50% 1x, 1x 70%, 2x 95%, 3x 100% por 2 minutos cada) e diafanizados (2x em xilol por 2 minutos cada), sendo, ao final, cobertos com lamínula utilizando como meio de montagem o Entellan. 3.3.6 IMUNOFLUORESCÊNCIA As demais séries dos encéfalos dos animais foram submetidas para imunofluorescência com o objetivo de identificar neurônios imunorreativos às proteínas ligantes de cálcio (CaBP): Calbindina (CB), Calretinina (CR) e Parvalbumina (PV). Os anticorpos que foram utilizados nesse estudo foram os mesmos utilizados previamente em outros estudos nesse laboratório, e por não apresentarem nenhuma reação cruzada e por terem sido testados, dispensaram a necessidade de haver um grupo controle.. 29.

(30) As reações da imunofluorescência foram realizadas com os cortes mergulhados em solução e foram utilizados anticorpos contra cada uma das substâncias supracitadas. Utilizamos o protocolo a seguir:. 1- Os cortes foram submetidos a 5 lavagens durante 5 minutos cada, em solução de tampão fosfato 0,1 M, pH 7,4, em agitador orbital. 2- Pré-tratados com boridreto de sódio 1%, durante 20 minutos. 3- Seguiram em 5 lavagens em tampão fosfato 0,1 M, pH 7,4, de 5 minutos cada. 4- Foi realizado o bloqueio com 150µl de albumina de soro bovino (BSA) e 2.850 µl de Triton X-100, durante 1 hora. 5- 5 lavagens em tampão fosfato 0,1 M, pH 7,4, de 5 minutos cada. 6- Incubação do anticorpo primário: 3µl de anticorpo primário diluído em 60µl de BSA e 2.937µl de Triton X-100 a 0,4%, overnight, à temperatura ambiente, em rotor. Diluição 1:1000. 7- 5 lavagens em tampão fosfato 0,1 M, pH 7,4, de 5 minutos cada. 8- Incubação do anticorpo secundário fluorescente: 6µl de anticorpo secundário diluído em 2.994µl de Triton X-100 a 0,4%, durante 120 minutos, à temperatura ambiente, em rotor. Diluição 1:500. 9- 3 lavagens em solução tampão fosfato 0,1 M, pH 7,4, de 5 minutos cada. 10- Montagem. dos. cortes. em. lâminas de. vidro. previamente. gelatinizadas e secagem à temperatura ambiente. 11- Após a secagem, as lâminas foram cobertas com lamínulas utilizando como meio de montagem ERV-Mount (Erviegas Ltda), estando prontas para serem examinadas ao microscópio de fluorescência.. Os anticorpos que foram utilizados com suas respectivas diluições e fabricantes são expostos na tabela a seguir:. 30.

(31) Tabela 1. Substâncias, anticorpos e soro normal com diluições utilizadas:. Substância. Anticorpo primário (diluição). Anticorpo secundário fluorescente (diluição). CR. Rb α CR (1:1000) SIGMA. Gt α Rb 488 (1:500) ABCAM. Ms α CB (1:1000) SIGMA. Dk α Ms 594 (1:500) ABCAM. CR. Rb α CR (1:1000) CHEMICON. Gt α Rb 594 (1:500) ABCAM. PV. Ms α PV (1:1000) SIGMA. Dk α Ms 488 (1:500) ABCAM. CB. 3.4. OBTENÇÃO DAS IMAGENS As secções do encéfalo montados em lâminas histológicas foram analisadas. através de microscópio óptico e de fluorescência (Nikon Ni-U) e então selecionadas. As imagens digitais foram obtidas através de uma câmera de vídeo (Nikon DS-Ri1) acoplada ao microscópio, ajustado com as objetivas de 2X, 4X, 10X, 20X e 40X, e conectada a um computador com o software NIS instalado. As imagens foram analisadas e, com o auxílio do software Canvas 12, transformadas em escala de cinza e ajustadas para brilho, contraste e resolução. O software Canvas 12 também foi utilizado para a construção dos esquemas, tomando como base o atlas estereotáxico do cérebro do rato (PAXINOS e WATSON, 2007) e atlas do morcego Desmodus rotundus murinus (BHATNAGAR, 2008). 3.5. ANÁLISE MORFOMÉTRICA Em relação à mensuração das células, foram utilizadas secções frontais do. encéfalo dos cinco exemplares de A. planirostris submetidos à coloração de Nissl. Todos os cortes que representavam a região de interesse foram amostrados para cada núcleo, a fim de obter o perfil celular em toda a extensão rostrocaudal dos núcleos estudados. Foi utilizado o software NIS ELEMENTS AR para medir a área das células, bem como para selecionar as células que foram mensuradas. As medições foram realizadas nas objetivas de 10X e 20X. 31.

(32) Para seleção das células, o software gerou uma grade com linhas verticais e horizontais distantes em 100µm, onde as células que estavam dentro dos quadrados e que estavam na região de interesse foram selecionadas. Para o CC, foram selecionadas 50 células por corte em cada subdivisão. Ao final de cada sessão de contagem, uma tabela de áreas celulares foi disponibilizada pelo software NIS. Estes dados foram exportados para o Excel e utilizados em posterior análise no software estatístico. Para calcular o comprimento rostrocaudal do complexo coclear, foi utilizado o seguinte cálculo: Nº de cortes por compartimento * distância entre os cortes. Chegando assim ao valor do comprimento da estrutura estudada. 3.6. ANÁLISE ESTEREOLÓGICA Para estimar o volume de ambos os núcleos (direito e esquerdo), foram. selecionados entre 6 a 7 imagens, na coloração de Nissl de cinco espécimes, contendo os núcleos em um aumento de 40 vezes. A amostragem de cada área foi sistemática e uniformemente aleatória (SURS) (GUNDERSEN et al., 1999). Essas imagens foram analisadas com o auxílio do software Canvas 12, utilizando sempre o mesmo computador e o mesmo zoom a fim de evitar equívocos na análise. A partir da imagem, posicionamos um grid de contagem, respeitando os limites da figura a ser analisada, contendo pontos equidistantes e com área conhecida. Para o CC foi utilizado grid de 100 µm com área por ponto de 35.061 µm 2. Em cada imagem, os pontos que tocavam toda a dimensão do CC foram contados. O método para calcular o volume foi o de Cavalieri com o seguinte cálculo: V= Σp * a/p * t * F -1, onde Σp é a soma dos pontos que tocam o núcleo, a/p é a área dos pontos, t é a espessura do corte e F-1 é o inverso da distância entre os cortes (HOWARD e REED, 2010). Para testar a confiabilidade dos dados, foi realizado o teste de coeficiente de erro, onde se observou um valor de 2%, sendo menor do que o limite de 15% (GUNDERSEN et al., 1999). 3.7. ANÁLISE ESTATÍSTICA Para todos os testes, foi realizada previamente a análise de normalidade dos. dados, através do teste de Kolmogorov-Smirnov. Os dados obtidos foram expressos 32.

(33) em média ± desvio padrão (DP). Foi realizado o Test t Student para amostras independentes. Para análise de múltiplas comparações foi utilizado análise de variância (ANOVA) de uma via seguido do pós-teste de Bonferroni. Um valor de p<0,05 foi considerado como estatisticamente significativo. O software estatístico utilizado foi o GraphPad Prism 6.0.. 4. RESULTADOS O presente estudo fornece a primeira descrição detalhada da avaliação citoarquitetônica pelo método de Nissl e imunoistoquímica para CaBP (PV, CR e CB) do CC de morcego Artibeus planirostris. Os dados foram organizados em duas sessões obedecendo à ordem rostrocaudal das secções coronais. 4.1.. CARACTERIZAÇÃO. CITOARQUITETÔNICA,. MORFOMÉTRICA. E. ESTEREOLÓGICA DO COMPLEXO COCLEAR Entre os exemplares analisados, o comprimento do encéfalo variou entre 16,1 e 21,5mm, com um valor médio de 17,65mm, do polo frontal do córtex cerebral ao limite bulbo-espinal. A análise das secções coronais do encéfalo do A. planirostris coradas pelo método de Nissl revelaram que o CC estende-se desde a porção média da ponte até o nível mais rostral do bulbo ao longo do eixo rostrocaudal. O CC destaca-se como um conjunto celular heterogêneo citoarquitetônicamente, disposto látero-inferiormente ao pedúnculo cerebelar inferior (icp) e lateralmente ao nervo vestibulococlear (8n), tracto espinal do trigêmio (sp5) e corpo trapezoide (tz) ao longo da maior parte de sua extensão (Figura 9). Adicionalmente, é possível verificar que o CC em A. planirostris aparentemente sofre um aumento em seu tamanho ao longo do eixo rostrocaudal, ocupando toda a porção lateral do bulbo nos níveis médios e finalmente apresentando uma aparente redução em seu tamanho, assumindo uma posição mais dorsal nas secções caudais. Assim, verificamos quanto à topografia, uma dorsalização do complexo em relação à parede lateral do tronco encefálico ao longo de sua extensão rostrocaudal (Figura 9A, B e C).. 33.

(34) Figura 9. Esquemas de secções coronais, baseadas no método do Nissl, do encéfalo de Artibeus planirostris mostrando as delimitações do CC nos níveis rostral, médio e caudal. As linhas pontilhadas demarcam a estrutura de interesse. Barra: 1000 μm. 34.

(35) O método de Nissl permitiu identificar todas as subdivisões clássicas descritas até o presente (Figura 10, 11 e 12). O núcleo coclear ventral porção anterior (VCA) surge nas secções rostrais como um pequeno aglomerado de células predominantemente arredondadas (Figura 10A e B). Nas secções médias, o CC sofre um pequeno aumento no seu tamanho, sendo possível verificar a presença do núcleo coclear ventral porção posterior (VCP) com células fusiformes mais esparsamente distribuídas em posição mais inferior (Figura 11A e C). Neste mesmo nível é possível verificar a presença de uma fina camada celular densamente corada pelo método de Nissl, lateral e dorsalmente posicionada ao VCP, a qual denominamos de núcleo coclear ventral anterior porção granular (VCAGr) (Figura 11A e B). A sequência rostrocaudal do CC de A. planirostris apontou o surgimento do núcleo coclear dorsal (DC), superiormente ao VCP nos níveis médios do complexo (Figura 11A).. Figura 10. Fotomicrografias em campo claro de secções coronais, coradas pelo método do Nissl, do encéfalo de Artibeus planirostris mostrando a citoarquitetura do CC em A. Ampliação da caixa em A, mostrando em detalhe a morfologia arredondada das células do VCA (B). Barra: 500 μm em A e 50 μm em B.. 35.

(36) Adicionalmente, foi possível verificar a gradativa diminuição no tamanho relativo do VCA ao longo da extensão rostrocaudal (Figura 11A). O DC foi caracterizado por subpopulações celulares distintas citoarquitetonicamente, sendo possível identificar a presença de três lâminas celulares dispostas obliquamente em relação ao plano mediano, tendo sido essas classificadas do plano mais profundo ao superficial tanto nas secções médias quanto nas secções caudais: núcleo coclear dorsal profundo (DCDp) (Figura 12A e D); núcleo coclear dorsal fusiforme (DCFu) (Figura 12A e C) e núcleo coclear dorsal molecular (DCMo) (Figura 12A e C). Nas secções em nível caudal do CC, o icp delimita-o medialmente em quase todo o seu eixo dorsoventral, bem como, foi possível verificar a manutenção da laminação celular do DC (Figuras 9C e 12A).. Figura 11. Fotomicrografias em campo claro de secções coronais, coradas pelo método do Nissl, do encéfalo de Artibeus planirostris mostrando a citoarquitetura do CC em A. Ampliação da caixa em A, mostrando em detalhe a morfologia ovóide e pequena (seta) das células do VCAGr (B) e a morfologia fusiforme e espaçada das células do VCP (C). Barra: 500 μm em A e 50 μm em B e C.. 36.

(37) Figura 12. Fotomicrografias em campo claro de secções coronais, coradas pelo método do Nissl, do encéfalo de Artibeus planirostris mostrando a citoarquitetura do CC em A. Ampliações das caixas em A, mostrando em detalhe a morfologia pequena e granular das células do DCMo (B), a morfologia fusiforme (seta) das células do DCFu (C) e a morfologia arredondada e maior das células do DCDp (D). Barra: 500 μm em A e 50 μm em B, C e D.. A análise morfométrica permitiu caracterizar os perfis celulares do CC, onde observamos. a. predominância. de. células. arredondadas. distribuídas. heterogeneamente por toda a extensão do complexo. A morfometria viabilizou a organização do CC em distintas subdivisões. A subdivisão ventral (VC) e dorsal (DC) do. complexo. foram. caracterizadas. por. células. arredondadas. e. ovóides,. apresentando média de área de 127,4±6,7 μm2 e 115,6±8,8 μm2 respectivamente. Em geral, os neurônios no VC apresentaram-se distribuídos de forma difusa dentro dos limites citoarquitetônicos do núcleo comparadas à distribuição neuronal no DC. 37.

(38) Em conjunto, foi observada diferença significativa entre as médias das áreas celulares do VC e do DC (p<0,05). Os dados por animais encontram-se descritos na Tabela 2. Tabela 2. Análise morfométrica. Valores expressos como média ± desvio padrão da área celular em casos investigados por subdivisão no CC.. CC. Animalm / Peso (g) M1 / 45,50 M2 / 46,00 M3 / 47,00 M4 / 39,50 M5 / 43,00 Média. VC Média ± DP (μm2). DC Média ± DP (μm2). 127 ± 22 122 ± 16 132 ± 22 120 ± 15 136 ± 18. 126 ± 33 108 ± 37 115 ± 49 123 ± 36 106 ± 38. 127,4 ± 6,7a. 115,6 ± 8,8a. Legenda: a VC vs DC p < 0.05; teste t; m morcego.. A análise citoarquitetônica confirmou a existência da subdivisão do VC em uma porção anterior denominada VCA caracterizada por formas celulares arredondadas e média de área celular de 138,2±8,2 μm2. Além disso, identificamos a porção posterior denominada de VCP caracteristicamente com formatos neuronais fusiformes e distribuídos mais difusamente em relação ao VCA. As médias de área celular no VCP foi de 138,2±8,9 μm2, não havendo diferenças significativas entre essas duas subdivisões do complexo por esse parâmetro. Por fim, foi possível identificar VCAGr com células pequenas e ovóides. A média da área celular na porção citada equivale a 27±5,8 μm2. Em conjunto, quando analisados os dados observou-se uma diferença significativa do VCAGr entre as duas outras porções, VCA e VCP (p<0,001). Os valores individuais por animais podem ser observados na Tabela 3.. 38.

(39) Tabela 3. Análise morfométrica. Valores expressos como média ± desvio padrão da área celular em casos investigados por subdivisão do CN.. DC. VC. M1 / 45,50 M2 / 46,00 M3 / 47,00 M4 / 39,50 M5 / 43,00. DCMo Média ± DP (μm2) 23 ± 8 27 ± 10 28 ± 11 28 ± 9 24 ± 10. DCFu Média ± DP (μm2) 79 ± 40 62 ± 25 92 ± 34 91 ± 30 97 ± 32. DCDp Média ± DP (μm2) 121 ± 42 120 ± 52 134 ± 46 110 ± 32 123 ± 43. VCA Média ± DP (μm2) 141 ± 25 130 ± 4 139 ± 5 131 ± 20 150 ± 22. VCAGr Média ± DP (μm2) 24 ± 10 37 ± 19 24 ± 10 23 ± 8 27 ± 11. VCP Média ± DP (μm2) 138 ± 32 133 ± 23 150 ± 20 127 ± 19 143 ± 25. Média. 26,0 ± 2,3a, b. 84,2 ± 14,1a, c. 121,6 ± 8,6 b, c. 138,2 ± 8,2d. 27 ± 5,8 d, e. 138,2 ± 8,9 e. Animalm / Peso (g). Legenda: a DCMo vs DCFu p < 0.001; b DCMo vs DCDp p < 0.001; c DCFu vs DCDp p < 0.001; e VCAGr vs VCP p < 0.001; ANOVA + Bonferroni post hoc; m morcego.. d. VCAGr vs VCA p < 0.001;. 39.

(40) Quando analisadas as laminações do DC, observou-se da camada mais profunda à superficial, diferenças na morfologia celular. O DCDp apresentou uma morfologia de células maiores e mais espaçadas entre si, esta porção possui média de área celular de 121,6±8,6 μm2. O DCFu localizado entre as duas laminações, apresentou uma fina camada de células achatadas súpero-inferiormente. A média da área celular desta porção foi de 84,2±14,1 μm2. Por conseguinte, o DCMo é a laminação mais superficial do núcleo, apresentando morfologia de células pequenas, ovóides e granulares. A média da área celular desta porção foi de 26,0±2,3 μm2. Em conjunto, observou-se diferenças entre as três laminações quando comparadas entre si, sendo a camada do DCDp a que apresentou maiores áreas celulares (p<0,001). Maiores detalhes podem ser observados na Tabela 3. A partir da análise estereológica, foi possível calcular a estimativa de volume total para o CC, onde a média do volume para o CC direito foi de 1,84±0,29 mm³ e a média do volume para o CC esquerdo foi de 1,98±0,20 mm³. Os antímeros apresentaram volumes semelhantes não havendo diferença significativa entre eles (p=0,4). O volume do CC foi dado a partir da média entre os dois antímeros, totalizando o valor de 1,91±0,10 mm³. Posteriormente foi calculado o coeficiente de erro para a estimativa do volume, apresentando média geral de 2%. Também foi realizado o cálculo do comprimento rostrocaudal do CC, sendo este 7,2 mm. Análise por animal descrita completamente na Tabela 4.. 40.

(41) Tabela 4. Análise estereológica. Valores brutos seguidos da expressão destes valores como média ± desvio padrão do volume do CC em casos investigados por antímero.. CC. Animalm / Peso (g) M1 / 45,50 M2 / 46,00 M3 / 47,00 M4 / 39,50 M5 / 43,00 Média Teste t relativo aos antímeros. Esquerdo Volume (mm³). Direito Volume (mm³). Média ± DP (mm³). 2,27 2,04 1,98 1,75 1,85. 1,86 2,20 1,65 1,48 2,01. 2,06 ± 0,29 2,12 ± 0,11 1,81 ± 0,23 1,61 ± 0,19 1,93 ± 0,11. 1,98 ± 0,20 NS. 1,84 ± 0,29 NS. 1,91 ± 0,10 (CE: 2%). Legenda: m: morcego; NS: não significativo; CE: coeficiente de erro.. 4.2. ANÁLISE DA DISTRIBUIÇÃO DAS PROTEÍNAS LIGANTES DE CÁLCIO NO COMPLEXO COCLEAR A análise da distribuição das CaBP no complexo coclear, através da técnica de imunofluorescência permitiu identificar a presença de terminais e pericários imunorreativos a CB em secções médias e caudais do complexo coclear apenas no DCMo (Figura 13D e G). Por outro lado, a distribuição de fibras imunorreativos a CR foi observada no DCDp das secções médias e uma densa imunorreatividade a CR foi observada nas porções VCA e VCP (Figura 13B e E). Nas secções caudais do complexo a imunorreatividade a CR foi caracterizada pela distribuição de pequenos neurônios envolvidos por uma densa neurópila no DCDp e DCFu. Adicionalmente, neurônios imunorreativos a CR aparentemente maiores em relação àqueles observados no DC foram visualizados no VCP (Figura 13H). Embora não tenhamos realizado nenhum tipo de quantificação, a análise preliminar da marcação imunoistoquímica para CB e CR no complexo sugere a presença de neurônios duplamente marcados na porção DCFu (Figura 13I). O conjunto de secções 41.

(42) submetidas à imunofluorescência para PV revelaram uma maciça marcação de neurônios apenas nas porções DCMo e DCFu. O DCDp não apresentou elementos imunocorados para PV (Figura 14D, G e J). Por outro lado, observamos neurônios imunorreativos a PV em ambas as subdivisões do VC (Figura 14A, D e G). Ressaltamos que uma grande proporção de neurônios no VC apresentou dupla marcação para PV e CR (Figura 14C, F e I). Também podemos destacar que a laminação encontrada no DC pôde ser melhor evidenciada pela distribuição das CaBP, onde DCDp apresenta maior imunorreatividade para CR, enquanto que as camadas DCFu e DCMo apresentam uma mistura entre neurônios imunorreativos a CB e PV (Figura 13D e G e Figura 14G e J).. 42.

(43) Figura 13. Fotomicrografias da imunofluorescência de secções coronais do encéfalo de Artibeus planirostris mostrando a expressão de CB (vermelho) nos neurônios do CC no sentido rostrocaudal em A, D e G. Expressão de CR (verde) nos neurônios do CC no sentido rostrocaudal em B, E e H. Sobreposição das marcações CB (vermelho) + CR (verde) no CC nos três níveis: rostral, médio e caudal em C, F e I. Os asteriscos representam ampliação da área para melhor visualização dos neurônios. Barra: 100 μm. 43.

(44) 44.

(45) Figura 14. Fotomicrografias da imunofluorescência de secções coronais do encéfalo de Artibeus planirostris mostrando a expressão de PV (verde) nos neurônios do CC no sentido rostrocaudal em A, D, G e J. Expressão de CR (vermelho) nos neurônios do CC no sentido rostrocaudal em B, E, H e K. Sobreposição das marcações PV (verde) + CR (vermelho) no CC nos três níveis: rostral, médio e caudal em C, F, I e L. Os asteriscos representam ampliação da área para melhor visualização dos neurônios. Barra: 100 μm.. 45.

(46) 5. DISCUSSÃO 5.1 CITOARQUITETURA O CC formado pelo DC e VC recebe entrada da porção coclear do nervo vestibulococlear, oitavo par craniano. A divisão em ventral e dorsal ocorre em todas as espécies estudadas até o presente. Entretanto, os estudos de anatomia e a fisiologia apresentam uma tendência a abordar mais o DC, isso ocorre nas variadas espécies, incluindo o humano (BAIZER et al, 2014), morcego (ZOOK e CASSEDAY,1982), o babuíno (MOORE et al., 1996), o gato (OSEN, 1969), a chinchila (FLECKEISEN et al., 1991), a cobaia (HACKNEY et al., 1990), o hamster (ZHANG e GUAN, 2008), o macaco (RUBIO et al., 2008), o rato (WOUTERLOOD et al., 1984; BAZWINSKY et al., 2008), o coelho (DISTERHOFT et al., 1980), o gambá (RYUGO et al., 1995). Se observarmos, os estudos tendem a seguir a descrição de um núcleo específico do complexo, ao invés de relatar a descrição do complexo total. Com base nisso, o presente estudo se propôs a analisar todas as divisões do complexo de Artibeus planirostris. Os neurônios nos CN os quais diferem em suas propriedades anatômicas e fisiológicas,. originam. diferentes. caminhos. auditivos. paralelos. ascendentes,. relacionados com o processamento de aspectos específicos das informações acústicas, portanto, é essencial para maior compreensão do processamento auditivo do tronco encefálico (TYPLT et al, 2012). Para a subdivisão do VCA, três principais tipos de células morfológicas foram descritas por Osen (1969) no gato: células espessas esféricas, células espinhas globulares e células estreladas, onde é descrito que os tipos celulares encontrados apresentam relação direta com a função da cóclea e suas fibras emitidas até o complexo coclear. Se compararmos aos achados observados em nosso estudo, é possível encontrar semelhanças com as células esféricas e as globulares, sendo encontradas também na porção anterior do VC. As células se apresentam de morfologia semelhante, e principalmente quando se leva em consideração que o VCA recebe os feixes de axônios da cóclea, apresentando assim uma possível morfologia celular associada a sua função. Assim como observado em A. planirostris, as diferenças anatômicas são mais óbvias na laminação celular do DC do que no VC dos CN em mamíferos. De forma 46.