Caracterização da Invenção

2.1 –Descrever de forma sucinta a solução técnica proposta pela invenção.

A presente invenção é referente a método de prospecção de candidatos vacinais para vacinas contra doenças infecciosas e um ou mais epítopos de proteínas micobacterianas reconhecidos por moléculas HLA-II humana frequentes na população brasileira, que poderão ser utilizados em combinação ou separadamente para confecção de vacinas profiláticas contra tuberculose e/ou em métodos de avaliação da eficácia de novas vacinas profiláticas e/ou terapêuticas contra esta doença. A abordagem aqui utilizada difere da literatura por terem sido selecionados alvos moleculares imunorreativos especialmente para indivíduos da população brasileira e também para outras populações onde a tuberculose é altamente endêmica, relacionados com produção alta e persistente de mediador importante para a imunidade contra a doença tuberculosa, produzido em resposta à vacina contra a tuberculose Bacilo de Calmette-Guérin, cuja eficácia é conhecida em nossa população.

2.2-Anexar material que descreva a solução técnica proposta pela invenção, incluindo dados experimentais obtidos.

Introdução: A tuberculose é um sério agravo, responsável por cerca de um milhão de mortes por ano em todo o mundo. Considera-se que imunidade protetora contra o bacilo pode ser atingida pela grande maioria dos indivíduos, uma vez que apenas 10% de infectados desenvolve a doença durante toda a vida (AXELSSON-ROBERTSON et al., 2012). Há uma vacina contra a tuberculose, o Bacilo de Calmette-Guérin (BCG), que está entre as vacinas de maior cobertura em todo o mundo. No entanto, a eficácia demonstrada da

vacina é muito variável, sendo maior contra formas graves e menos frequentes da doença (MCSHANE et al., 2012), porém podendo chegar a zero contra a forma mais frequente e maior responsável pela disseminação do bacilo, a tuberculose pulmonar (COLDITZ et al., 1994). Por esta razão, vários grupos em todo o mundo buscam uma vacina alternativa para a tuberculose, especialmente que apresente maior eficácia do que a BCG nos países responsáveis pela maior carga da doença, situados na América Latina, África e Ásia (WORLD HEALTH ORGANIZATION, 2012). Espera-se que com uma vacina eficaz se possa controlar a transmissão, diminuir a infecção latente, evitar a manifestação da doença, abreviar o tratamento, evitar ou abreviar o internamento e evitar o óbito (BRENNAN; THOLE, 2012).

Candidatos vacinais têm sido propostos com base nos resultados de estudos realizados em camundongos e outros animais e na comparação da resposta de indivíduos com infecção tuberculosa latente com a de indivíduos com tuberculose ativa (BRENNAN; STONE; EVANS, 2012). Apesar do uso de animais em diversos estágios de pesquisa como desenvolvimento, produção e controle de qualidade das vacinas cabe ressaltar que a resposta humana à doença difere muito da encontrada em camundongos, os quais não são infectados com micobactérias na natureza (ACOSTA et al., 2011; OTTENHOFF; KAUFMANN, 2012). Um ensaio clínico recente mostrou Por outro lado, em indivíduos infectados com a micobactéria tuberculosa, mesmo na ausência de doença ativa, a resposta imune é modulada pelo bacilo para facilitar a sua sobrevivência no hospedeiro (GUPTA et al., 2012). Por esta razão, explorar a resposta induzida contra micobactérias em um modelo humano na ausência de infecção latente e em que o grau de proteção conferido é conhecido torna-se uma oportunidade ímpar para a proposição de novos candidatos vacinais e biomarcadores de proteção que possam auxiliar na avaliação de novas vacinas contra a tuberculose.

Em Salvador, Bahia, Brasil um grande estudo epidemiológico objetivando a estimativa da eficácia de administração de uma segunda dose de BCG a crianças em idade escolar permitiu conhecer não apenas a eficácia da BCG contra a tuberculose quando administrada em uma segunda dose na idade de 7 a 15 anos (BARRETO et al., 2011; RODRIGUES et al., 2005), mas também aquela conferida por administração no início da vida (PEREIRA et al., 2012). A

eficácia da BCG nesta população contra a tuberculose, quando administrada a neonatos, foi estimada em 34% (8-53%, intervalo de confiança a 95%), e a eficácia da segunda dose de BCG em idade escolar foi estimada em 19% (3- 33%, intervalo de confiança a 95%). Neste contexto, o estudo da resposta imune à vacina BCG é capaz de fornecer biomarcadores candidatos, os quais, sendo heterogeneamente induzidos pela (re)vacinação, podem ser associados ao desfecho de proteção contra a infecção e/ou doença tuberculosa. Nosso grupo utilizou este modelo de proteção moderada para investigar biomarcadores candidatos para a avaliação de novas estratégias vacinais, e para a proposição de novos alvos para vacinas contra a TB.

Avaliamos crianças revacinadas com uma segunda dose de BCG entre 7 e 15 anos na mesma população do ensaio clínico randomizado controlado descrito acima (BARRETO et al., 2002) e observamos aumento da capacidade de produzir a citocina interferon-gama (IFN-γ) dois meses após a vacinação apenas em uma parte dos indivíduos vacinados (BARBOSA et al., 2003), os quais pertenciam em sua maioria à faixa etária entre 12 e 15 anos de idade. Com base neste resultado, uma nova coorte foi montada com voluntários mais velhos (em sua maioria entre 18 e 22 anos de idade) e negativos para infecção tuberculosa latente que foram randomizados para receber ou não a revacinação com BCG (ensaio clínico randomizado controlado) e que foram monitorados nos intervalos de 2 e 12 meses após a revacinação (respectivamente, T2 e T12) quanto à resposta a antígenos micobacterianos e infecção in vitro com a BCG. Nesta coorte novamente o IFN-γ foi a citocina que se apresentou consistentemente aumentada no desafio in vitro com os antígenos micobacterianos em amostras de indivíduos revacinados nos dois tempos de avaliação, superando os níveis basais tanto em T2 como em T12 e superando a resposta de indivíduos controles (não revacinados) em T2 (OLIVEIRA, 2008). Além disso, indivíduos cuja produção de IFN-γ dois meses após a revacinação superou em pelo menos 3,3 vezes a sua resposta inicial apresentaram produção consistentemente aumentada de IFN-γ em T12 e também outros marcadores reconhecidos de uma resposta protetora contra micobactérias, nomeadamente a expansão de células com marcadores específicos (CD4+ e CD8+) produtoras de citocinas (IFN-γ sozinho ou IFN-γ associado ao TNF) (Oliveira et al., submetido para publicação). Cabe ressaltar

o papel fundamental da citocina IFN-γ, considerada a principal citocina responsável pela defesa contra a micobactéria tuberculosa (ACOSTA et al., 2011; OTTENHOFF; KAUFMANN, 2012).

Avaliamos a resposta imune humoral desses voluntários doravante denominados de alta resposta vacinal utilizando a tecnologia proteômica a fim de determinar o perfil de reconhecimento humoral, empregando para tal, proteínas extracelulares de M. bovis BCG Moreau (ativamentre secretadas para o meio extracelular e não covalentemente associadas a superfície celular) (PEREIRA, 2009). Verificamos que houve reconhecimento preferencial de proteínas pelo soro dos voluntários com alta resposta vacinal, as quais não foram reconhecidas pelo soro de indivíduos controles nem pelo soro de indivíduos que apesar de revacinados não atingiram um aumento de produção de IFN-γ de pelo menos 3,3 vezes após a administração da vacina. Com base nestes resultados propomos que há uma relação entre o reconhecimento preferencial de proteínas pela resposta humoral e a produção de mediadores importantes para a ativação da resposta imunológica, o que serve de base para a proposição do método aqui reivindicado de prospecção científica e tecnológica de novos candidatos vacinais para vacinas contra agentes infecciosos.

A presente invenção utiliza a associação entre o reconhecimento de proteínas específicas e a produção de mediadores no modelo humano de proteção conhecida contra o patógeno, exemplificados por, porém não limitados a citocinas como o IFN-γ, que são produzidos por células relevantes da resposta imune adaptativa, para a prospecção de epítopos capazes de induzir a resposta adaptativa selecionada que servirão como candidatos para i) novas estratégias vacinais, exemplificadas por, porém não limitadas a vacinas de DNA, proteínas de fusão com ou sem combinação de epítopos, etc., e ii) para biomarcadores da resposta de novas vacinas, com a avaliação da razão de aumento da produção dos mediadores relevantes para estabelecimento do ponto de corte para a indicação de indivíduos potencialmente protegidos. Esta nova estratégia constitui uma proposta que se encaixa no conceito de prospecção de candidatos de nova geração para vacinas contra a tuberculose baseadas na indução de anticorpos, para a qual existe atualmente uma ausência de racional conforme explicitado na literatura (BRENNAN; STONE;

EVANS, 2012).

Seguindo este modelo proposto, propõe-se também como objeto desta invenção epítopos aqui descritos (sequências SEQ. 1 a SEQ. 19) obtidos a partir do emprego de técnicas de bioinformática que são encontrados nas proteínas reconhecidas especificamente em soros de indivíduos de alta resposta vacinal frente à revacinação com BCG em Salvador, Bahia, Brasil (PEREIRA, 2009) onde esta estratégia confere proteção moderada contra a tuberculose (BARRETO et al., 2011). Os epítopos identificados correspondem a sequências reconhecíveis por moléculas de HLA-II mais presentes em nossa população e que podem sinalizar e estimular a produção de elevadas quantidades de IFN-γ em estratégias vacinais. Os epítopos selecionados poderão ser utilizados em combinação ou separadamente para confecção de novas vacinas contra tuberculose e como marcadores da eficácia de novas estratégias vacinais, especialmente aquelas desenhadas como booster ou como melhoramento genético da atual vacina BCG. Já existem discussões sobre o desenvolvimento de vacina de forma inversa utilizando informações imunológicas e genômicas na identificação de proteínas ou peptídeos relevantes em propostas vacinais (LEMAIRE; BARBOSA; RIHET, 2012). A utilização da bioinformática na predição dos epítopos como possíveis antígenos imunogênicos reconhecidos por moléculas de HLA para posterior utilização in vitro é apontada na literatura como chave para diminuir o tempo e custo dos experimentos (SEIB; ZHAO; RAPPUOLI, 2012).

Os testes utilizando os epítopos aqui apresentados poderão ser benéficos e superiores aos atualmente descritos e/ou em uso por algumas razões:

- vacina capaz de gerar resposta imunológica celular e humoral o que pode resultar numa resposta mais intensa;

- resposta aos epítopos pode indicar a potencial utilidade de outras vacinas já em testes clínicos ou a serem propostas, especialmente formuladas como booster ou como recombinantes da vacina BCG;

- os epítopos e a fusão destes são facilmente confeccionados, rápidos e com baixo custo;

- como as seqüências foram previamente obtidas através de programas de bioinformática, pode resultar em experimentos e testes de validação com

resultados mais rápidos. Materiais e métodos:

- Desenho experimental: Análise in vitro do aumento de produção de mediador da resposta adaptativa protetora (IFN-γ) face ao estímulo antigênico do patógeno (micobactéria) em ensaio clínico randomizado controlado, utilizando uma coorte de indivíduos TST negativos revacinados (com BCG) de uma população com proteção moderada contra a doença (tuberculose) conferida pela primeira e proteção moderada adicional conferida pela segunda administração da vacina, ambas documentadas na literatura, e associação desta resposta com o reconhecimento específico de proteínas da vacina (BCG) a partir das quais foram obtidos epítopos potencialmente indutores da produção de IFN-γ e capazes de se ligar a HLA de populações relevantes atingidas pela doença.

Seleção da população de estudo: Indivíduos de Salvador, Bahia, Brasil acima de 18 anos de idade cursando o primeiro ano de cursos de graduação da área de saúde, com cicatriz indicativa de vacinação BCG e negativos em dupla testagem ao teste tuberculínico (TST) (DA ROCHA et al., 2011). Critérios de exclusão: ausência de cicatriz vacinal indicativa de administração prévia da BCG; positividade ao TST ou falha na leitura ou aplicação de alguma etapa do teste; positividade ao teste de ELISA para HIV 1/2.

Randomização para administração da vacina e coleta de amostras: os indivíduos foram informados sobre os procedimentos a serem realizados e objetivos do estudo. O TST foi oferecido e os candidatos elegíveis foram randomizados entre grupo controle e grupo a ser revacinado e convidados a participar do estudo. Após assinatura do Termo de Consentimento Livre e Esclarecido, os voluntários foram submetidos a coleta de sangue (T0) seguida ou não por revacinação com BCG utilizada pelo Ministério da Saúde para a vacinação regular (Mycobacterium bovis BCG cepa Moreau-RJ, fornecida pela Fundação Ataulpho de Paiva) consoante o grupo de randomização. Os voluntários foram contatados posteriormente para comparecimento a uma visita de acompanhamento clínico (um mês após a intervenção) e duas coletas de sangue (dois – T2 e doze –T12 meses após a intervenção).

de sangue venoso heparinizado 1:10 em meio de cultura RPMI 1640 com antibióticos e mantidas por 72 h na presença ou ausência de estímulo com 10 µg/ml de antígeno micobacteriano de lisado total de cultura de M. tuberculosis virulento H37Rv (Mtb). O sobrenadante destas culturas foi utilizado para a avaliação da produção de citocinas, entre elas o IFN-γ, utilizando um sistema citométrico multi-ensaio. Culturas de células mononucleares separadas do sangue venoso por gradiente de ficoll foram realizadas em meio RPMI 1640 suplementado com soro humano AB e antibióticos, na ausência de estímulo, ou estimuladas com 10 µg/ml de Mtb, ou estimuladas com fitohemaglutinina 5µg/ml, ou estimuladas com bacilos viáveis de BCG à proporção de 10:1 monócito com meio RPMI 1640 suplementado com soro, porém sem antibióticos. O sobrenadante destas culturas foi avaliado após 48 h quanto à produção de citocinas, bem como a fração celular foi avaliada após 48h quanto à expansão de células positivas para a presença de IFN-γ ou fator de necrose tumoral (TNF) ou ambos por imunomarcação com anticorpos fluorescentes e citometria de fluxo.

Estabelecimento do ponto de corte para seleção de indivíduos de alta resposta vacinal: Os níveis de IFN-γ em culturas de sangue total estimuladas com Mtb em T2 foram divididos pelos valores obtidos para as culturas pareadas realizadas em T0 e utilizados em uma curva Receiver Operating Characteristics (ROC) para obtenção do ponto de melhor sensibilidade x especificidade em prever dois desfechos após 12 meses: i) capacidade de produção de IFN-γ acima da mediana do grupo revacinado e ii) capacidade de produção de IFN-γ acima do valor médio mais dois desvios-padrão no grupo controle. Os indivíduos com alta resposta vacinal foram definidos como os indivíduos com valor de razão superior ao ponto de corte assim obtido.

Identificação de proteínas para seleção de sequências-alvo: Soro foi obtido de sangue sem anticoagulantes e utilizado para imunoproteômica conforme descrito a seguir. Pools de soros de indivíduos controles (14 soros em T0, 14 soros em T2 e 12 soros em T12) ou revacinados com alta resposta (12 soros em T0, 12 soros em T2 e 3 soros em T12) ou revacinados com baixa resposta (12 soros em T0, 12 soros em T2 e 3 soros em T12) foram diluídos 1:10 para obtenção das imunoglobulinas G totais com kit comercial de purificação. As proteínas presentes no filtrado de cultura e associadas à superfície de BCG

Moreau-RJ foram precipitadas e separadas bidimensionalmente quanto ao ponto isoelétrico e ao peso molecular, em géis SDS-PAGE (BERRÊDO-PINHO et al., 2011). As proteínas resolvidas nos géis foram transferidas para membranas de nitrocelulose, visualizadas por coloração reversível utilizando kit comercial, e a imagem capturada por densitômetro. As membranas descoradas foram bloqueadas com albumina bovina sérica a 5% a seguir incubadas com pool de soros constituídos conforme descrito acima à diluição de 1:5000. A revelação do Western Blotting foi realizada utilizando- anticorpo secundário anti-IgG humana conjugado à peroxidase e substrato cromogênico disponível comercialmente. A imagem final (filme radiográfico) foi capturada no mesmo densitômetro Os spots proteicos de interesse foram identificados através da comparação das imagens digitalizadas da membrana de nitrocelulose, do filme radiográfico e um gel de referência corado com coomassie blue G-coloidal. Estes spots proteicos foram excisados dos géis de referência, processados e a mistura de peptídeos trípticos analisada no espectrômetro de massas MALDI- TOF TOF (4700 Proteomics Analyser, Applied Biosystems) na Plataforma de Espectrometria de Massas PDTIS/FIOCRUZ (Laboratório de Toxinologia, IOC). Para a identificação das proteínas, os arquivos gerados através de software integrado ao equipamento, o 4000 Series Explorer TM Remote Client (versão 3.0 Applied Biosystems) foram analisados em bancos de dados disponíveis publicamente como o NCBInr. O programa de busca utilizado foram Mascot

(http://www.matrixscience.com/cgi/search_form.pl?FORMVER=2&SEARCH=MI S). Os resultados positivos foram comparados com banco de dados do Tuberculist (http://genolist.pasteur.fr/TubercuList), BoviList (http://genolist.pasteur.fr/BoviList/) e com o banco de dados proteômicos do Instituto Max Planck, (http://www.mpiib-berlin.mpg.de/2D-PAGE), o que forneceu uma maior consistência na interpretação e validação dos dados obtidos por esta análise

Foram considerados relevantes os antígenos reconhecidos apenas pelo pool de soros de indivíduos com elevada resposta vacinal em ambos T2 e T12, nas duas frações protéicas avaliadas (filtrado de cultura e/ou de proteínas da superfície de BCG).

proteínas identificadas na etapa anterior foram obtidas no banco Mundial de Sequências (GenBank) disponível no website do National Center for Biotechnology Information (NCBI) acessado pelo endereço eletrônico http://ncbi.nlm.nih.gov. Foi realizada busca por moléculas de HLA mais frequentes nas populações em que a tuberculose possui alta incidência, com especial ênfase em moléculas de HLA ubíquas e em moléculas de HLA frequentes na população brasileira. As sequências das proteínas foram analisadas quanto aos epítopos com comprimento de 15 aminoácidos possivelmente reconhecidos por células T quando associados a moléculas HLA utilizando o programa Immune Epitope Database and Analysis Resource (IEDB) disponível no endereço http://immuneepitope.org. Foram selecionados os epítopos com escore de afinidade inferior a 10 a pelo menos um dos alelos de HLA classe II selecionados.

Resultados e Discussão

A citocina IFN-γ foi a única testada que apresentou aumento consistente no grupo revacinado, tanto em comparação com os níveis basais antes da revacinação como em comparação com o grupo controle, nos dois tempos pós- revacinação avaliados (Figura 1A).

FIGURA 1.

Houve heterogeneidade na resposta de IFN-γ entre os voluntários, o que coincide com o fato de que a vacina confere proteção limitada a esta população, estimada em 19%, com intervalo de confiança (IC) a 95% de 3-33% (P=0.022) contra todas as formas de tuberculose em adolescentes de 7 a 15 anos (BARRETO et al., 2011). Os voluntários que apresentaram resposta de IFN-γ mais elevada no tempo de avaliação de 2 meses tenderam a manter uma resposta mais elevada 12 meses após a revacinação. Esta relação ficou clara a partir da avaliação da curva roc, que mostra que um aumento da produção de IFN-γ após a revacinação em pelo menos 3,3 vezes neste ponto de avaliação é capaz de prever os voluntários que tiveram produção de IFN-γ em doze meses entre as maiores do grupo revacinado e significativamente mais altas do que as do grupo controle (Figuras 1B e 1C). Verifica-se também em outros estudos

que aumentos da produção de IFN-γ após a vacinação com BCG superiores a três vezes são observados em populações onde a vacina apresenta elevada eficácia contra a tuberculose, enquanto que indivíduos de populações onde a vacina não confere proteção apresentam aumento limitado ou nulo da produção desta citocina após a administração da vacina (BLACK et al., 2002).

Outro parâmetro avaliado nestes indivíduos foi a expansão de populações celulares que têm funções importantes na proteção contra a doença tuberculosa em trabalhos experimentais (DU et al., 2010; KAVEH et al., 2011), quando desafiadas in vitro com micobactérias vivas (Figura 2).

FIGURA 2.

Verificamos expansão de células T com marcador CD4+ _{que eram produtoras}

de IFN-γ (Figura 2C), além de expansão de células T CD8+ _{produtoras apenas}

de IFN-γ, produtoras de TNF ou produtoras de ambas as citocinas simultaneamente (Figura 2D). Vale ressaltar que a expansão de células produtoras de IFN-γ é encontrada em outros modelos de avaliação da imunidade protetora contra a tuberculose (HOFT et al., 2008; SCRIBA et al., 2011), apesar de não ter sido ainda estabelecida uma relação direta entre a expansão destas populações celulares e proteção contra a doença (KAGINA et

al., 2010).

Caracterizamos a resposta humoral adaptativa associada à alta resposta vacinal demonstrada por parte dos indivíduos revacinados. A avaliação da imunoproteômica da resposta humoral frente às frações proteicas da micobactéria vacinal resolvidas em géis bidimensionais, revelou um perfil de reconhecimento antigênico distinto entre os grupos envolvidos no estudo, padrão este que se manteve nos tempos de avaliação, dois meses e um ano após revacinação.

Estas proteínas foram posteriormente identificadas por espectrômetro de massas MALDI-TOF TOF e identificadas por similaridade com sequências depositadas em bancos de dados públicos. Para a presente invenção, portanto, foram utilizadas as proteínas identificadas como diferencialmente reconhecidas pela resposta humoral de indivíduos revacinados selecionados com base na sua resposta relativa à resposta basal de IFN-γ como base para a prospecção de epítopos que fossem potencialmente relacionados à indução da resposta observada nos voluntários com alta resposta vacinal, utilizando uma abordagem inovadora (requerida como objeto deste pedido de invenção para a prospecção de novas vacinas em doenças infecciosas) para a proposição destes epítopos combinados (requeridos como objetos deste pedido de invenção) para a composição (em todo ou em parte) como potenciais candidatos para a avaliação de novas estratégias vacinais ou para a confecção de novas vacinas (contra a tuberculose e doenças infecciosas afins incluindo,