UNIVERSIDADE FEDERAL DA BAHIA
INSTITUTO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM IMUNOLOGIA
ÉVELIN SANTOS OLIVEIRA
Avaliação da modulação da resposta imune de voluntários
sadios sem infecção tuberculosa pela revacinação com
Mycobacterium bovis
Bacilo de Calmette-Guérin: uma
estratégia para a prospecção de biomarcadores de
proteção vacinal e novos candidatos a vacinas contra a
tuberculose.
Salvador, BA 2014
ÉVELIN SANTOS OLIVEIRA
Avaliação da modulação da resposta imune de voluntários
sadios sem infecção tuberculosa pela revacinação com
Mycobacterium bovis
Bacilo de Calmette-Guérin: uma
estratégia para a prospecção de biomarcadores de
proteção vacinal e novos candidatos a vacinas contra a
tuberculose.
Tese apresentada ao Programa de Pós-graduação em Imunologia, da Universidade Federal da Bahia como requisito parcial para obtenção do título de Doutor em Imunologia. Orientador: Profa. Dra. Theolis Costa Barbosa Bessa
Salvador, BA 2014
Ficha Catalográfica elaborada pela BUS – Biblioteca Universitária de Saúde da UFBA O48 Oliveira, Évelin Santos
Avaliação da modulação da resposta imune de voluntários sadios sem infecção tuberculosa pela revacinação com Mycobacterium bovis Bacilo de Calmette-Guérin : uma estra- tégia para a prospecção de biomarcadores de proteção vacinal e novos candidatos a vacinas contra a tuberculose / Évelin San- tos Oliveira. – Salvador, 2014.
86 f. : il.
Orientadora: Profª Drª Theolis Costa Barbosa Bessa.
Tese (doutorado) – Universidade Federal da Bahia. Institu- to de Ciências da Saúde, 2014.
1. BCG. 2. Ensaio clínico. 3. Resposta imunológica. 4. Tu- berculose - Salvador,BA. 5. Profilaxia. I.Universidade Fede- ral da Bahia. Instituto de Ciências da Saúde. II. Bessa, Theolis Costa Barbosa . III. Título.
Dedico este trabalho ao meu filho Lucas Sátiro que trouxe mais alegria a minha vida e me transforma numa pessoa melhor a cada dia.
AGRADECIMENTOS
À orientadora Dra. Theolis Barbosa Bessa pelo apoio e ensinamentos ao longo desses oito anos de colaboração.
Ao Dr. Luiz Alcântara e Dra. Aline Miranda pelos ensinamentos envolvendo estudo in silico das proteínas.
Ao grupo BCG, estudantes, pesquisadores e técnicos dos laboratórios LIMI e LIP - FIOCRUZ/BA, pelos bons momentos de descontração, auxílio nos experimentos e aprendizado nas sessões científicas.
Ao Dr. Daniel Abanades pelos ensinamentos sobre clonagem, expressão e purificação de proteínas. A Elaine Soligo e Leonardo Arruda pelo apoio nos experimentos.
Ao Laboratório de Genômica Funcional e Bioinformática do Instituto Oswaldo Cruz, RJ e a colaboração da Dra. Leila Mendonça e Dra. Melissa Pontes.
Ao Programa de pós-graduação em Imunologia, em especial à secretária do curso Dilceia Reis.
Ao meu esposo Carlos Eduardo e ao meu filho Lucas Sátiro pelo aconchego do ninho tão necessário para o desenvolvimento de um bom trabalho.
E por fim, à minha família e amigos pelo carinho e torcida por cada conquista na minha vida.
RESUMO
A vacina Bacilo Calmette-Guérin (BCG) é a única vacina disponível para prevenir a tuberculose. Na infância apresenta ação protetora principalmente contra formas disseminadas da doença, porém a proteção contra a forma pulmonar, responsável pela transmissão, é variável. Novas estratégias vacinais buscam maior eficácia, e a descoberta de biomarcadores que avaliem a resposta imune pós vacinação pode auxiliar no desenvolvimento de novas vacinas. A modulação de parâmetros imunológicos em resposta aos antígenos de Mycobacterium tuberculosis em adultos jovens revacinados com BCG foi investigada para estudar os padrões imunológicos associados a uma boa resposta versus uma resposta ineficaz contra micobactérias. Avaliou-se a expansão de células produtoras de citocinas e os níveis de citocinas em culturas de sangue total. Dois meses após a revacinação, alguns indivíduos apresentaram aumento expressivo da produção de interferon-gama (IFN-γ) por estímulo com antígenos micobacterianos e aumento de linfócitos T produtores de IFN-γ, fator de necrose tumoral (TNF) e linfócitos polifuncionais. Esses indivíduos mantiveram produção aumentada de IFN-γ após um ano. Soros de voluntários que apresentaram altos níveis de IFN-γ foram capazes de reconhecer diferencialmente proteínas da cepa vacinal BCG Moreau-RJ. As proteínas identificadas foram analisadas in silico quanto aos epítopos potencialmente passíveis de reconhecimento específico por moléculas do complexo principal de histocompatibilidade humanas. Dessa forma, a produção de IFN-γ pode ser um biomarcador para a avaliação da eficácia de vacinas contra a tuberculose, e a estratégia utilizada pode apontar candidatos a uma nova vacina contra a tuberculose com melhor eficácia do que a BCG em populações humanas.
Palavras-chave: BCG. Ensaio clínico. Resposta imunológica. Salvador, Bahia, Brasil. Tuberculose. Profilaxia.
ABSTRACT
Bacille of Calmette-Guérin (BCG) vaccine is the only one available known to prevent tuberculosis. It protects children especially against the disseminated forms of the disease. However, its efficacy against the pulmonary form that is responsible for disease transmission is variable. New vaccine strategies should have better efficacy and the discovery of biomarkers to evaluate the immune response after vaccination can help in the development of new vaccines. We investigated the modulation of immune parameters in response to Mycobacterium tuberculosis antigens in young adults revaccinated with BCG to study immunologic patterns associated with an efficient response versus an inefficient response against mycobacteria. The expansion of cytokine-producing cells as well as cytokine levels were evaluated in whole blood cultures. Two months after revaccination, some volunteers presented a significant increase on the production of interferon-gamma upon stimulation with mycobacterial antigens as well as increased expansion of T lymphocytes producing IFN-γ, tumor necrosis factor (TNF) and polyfunctional cells. These subjects maintained increased production of IFN-γ after one year. The sera of the volunteers that presented high levels of IFN-γ were able to recognize uniquely proteins of the vaccine strain BCG Moreau-RJ. The proteins identified were analyzed in silico as to the epitopes that could be recognized specifically by molecules of the human main histocompatibility complex. IFN-γ production can be a biomarker useful for the evaluation of tuberculosis vaccines efficacy, and the strategy used may lead to candidates for a new vaccine against tuberculosis with better efficacy than BCG in human populations.
Keywords: BCG. Clinical Trial. Immune response. Salvador, Bahia, Brazil. Tuberculosis. Prophylaxis.
LISTA DE ABREVIATURA APC Célula apresentadoras de antígeno BCG Bacilo Calmette-Guérin
HIV Human immunodeficiency vírus HLA Human leukocyte antigen
IFN-γ Interferon gama
IGRA Interferon gamma realease assay IL-2 Interleucina 2
NIH National Institutes of Health LUMC Leiden University Medical Center MHC Major histocompatibility complex Mtb Mycobacterium tuberculosis OMS Organização Mundial de Saúde PPD Derivado protéico purificado
LISTA DE FIGURAS
FIGURA 1 Estimativa da incidência de tuberculose, 2012. 15 FIGURA 2 Incidência de tuberculose no Brasil, 2010. 16
LISTA DE TABELAS
TABELA 1 Ensaios clínicos randomizados para estimativa da eficácia da revacinação com BCG contra tuberculose. 20 TABELA 2 Estudos de coorte para estimativa da eficácia da
revacinação com BCG contra tuberculose. 21 TABELA 3 Candidatos vacinais contra tuberculose 28
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO 12
2 REVISÃO DE LITERATURA 15
2.1 Tuberculose: necessidade de uma vacina mais eficaz. 15
2.2 Estudos sobre a eficácia da vacina BCG. 17
2.3 Resposta imune à vacina BCG. 22
2.4 IFN-γ como biomarcador promissor para auxiliar na busca de vacinas
substitutas ou complementares à BCG. 24
2.5 Novos candidatos vacinais contra tuberculose. 27
3 HIPÓTESE 32
4. OBJETIVOS 33
4.1 Objetivo geral 33
4.2 Objetivos específicos 33
4.3 Objetivo secundário 33
5. Interferon-gamma production by mononuclear cells in Bacille Calmette-Guérin-revaccinated healthy volunteers predicted long-term antimycobacterial responses in a randomized controlled trial. Artigo Científico publicado em 2013 na Revista Vaccine.
34
6. Utilização de epítopos e suas combinações para a identificação de indivíduos protegidos contra a tuberculose e métodos para o tratamento ou prevenção, vacinas profiláticas e/ou terapêuticas e método de prospecção de candidatos vacinais em doenças infecciosas. Notificação interna de invenção para pleito de patente de invenção junto ao Sistema Fiocruz de Gestão Tecnológica e Inovação / Núcleos de Inovação Tecnológica (GESTEC/NIT)
40
7. DISCUSSÃO 62
8. CONCLUSÃO GERAL 66
9. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 67
1 INTRODUÇÃO
No século 19, a tuberculose (TB) era idealizada nas obras literárias e artísticas, sendo causa de morte de grandes poetas românticos como Castro Alves e Álvares de Azevedo, no Brasil e Lord Byron, na Europa. Nesta época foi destacada como a doença dos poetas e boêmios e obrigou centenas de pessoas a se exilar por anos em sanatórios ou tratamento em cidades denominadas “de bom clima”. Alguns fatores como baixa renda, vícios relacionados ao álcool e/ou drogas, além da precariedade na higiene pessoal e comunitária foram aliados da grande endemia na época (Pôrto 2007). Porém, o desenvolvimento de testes diagnósticos, medicamentos para tratamento e investimentos em medidas preventivas não foram suficientes para erradicar a tuberculose. Segundo a Organização Mundial de Saúde (OMS), estima-se que um terço da população mundial encontra-se infectada pelo
Mycobacterium tuberculosis (Mtb), agente causador da doença, e que 1,3 milhão de pessoas morram a cada ano (WHO, 2014).
O diagnóstico e tratamento precoces podem auxiliar no controle da doença por permitir interferir na transmissão do bacilo, que ocorre através da expectoração. O diagnóstico da doença baseia-se principalmente em testes laboratoriais: a observação do bacilo em amostras coradas de escarro (baciloscopia) e a cultura do escarro para identificação do crescimento do bacilo. Porém, a sensibilidade da baciloscopia é baixa e o crescimento da micobactéria tuberculosa em cultura é lento. O resultado da cultura do escarro demanda um prazo de aproximadamente 10 a 45 dias, a depender do método utilizado (Colditz et al. 1994; Pitt et al. 2013) . A prova tuberculínica ou PPD (Derivado Protéico Purificado) é um teste intradérmico, composto por antígenos micobacterianos que causam reação local nos indivíduos expostos ao bacilo. Porém é um método auxiliar no diagnóstico da tuberculose. Apresentando-se positivo, indica apenas infecção e não é suficiente para diagnosticar a doença. O método apresenta vantagem de ser economicamente acessível, mas é pouco específico, apresentando reação cruzada em indivíduos vacinados e naqueles em contato com micobactérias não tuberculosas do ambiente. Por outro lado, também demanda pessoal técnico treinado para a correta aplicação e leitura do teste. Os testes de liberação do IFN-γ (IGRA- interferon gamma release
Consistem na avaliação da produção do IFN-γ por linfócitos em resposta aos antígenos específicos do Mtb. Os exames radiológicos também são utilizados no diagnóstico, mas as imagens podem sugerir tuberculose ou outras patologias, sendo indispensável a realização de exames bacteriológicos adicionais. Além disso, acusam a doença em estágio tardio. Já o tratamento da tuberculose é considerado eficaz na maioria dos casos, porém o uso descontinuado dos medicamentos pode levar a resistência do bacilo e o tratamento torna-se ineficaz até que seja diagnosticada a forma resistente do bacilo (Colditz et al. 1994; Pitt et al. 2013).
Portanto, a profilaxia pode ser a estratégia mais eficaz para reduzir os casos da doença. A prevenção pode ser feita através do uso da vacina Bacilo Calmette – Guérin (BCG), que apesar de apresentar eficácia protetora na infância nas formas mais graves da doença (miliar e meningite), ainda possui falhas que levam a falta de proteção para população jovem e principalmente contra a forma mais comum da doença: a tuberculose pulmonar. Uma nova vacina capaz de induzir proteção superior à atual BCG contra várias formas de tuberculose, principalmente pulmonar em adolescentes e adultos, pode diminuir os casos de tuberculose no mundo e auxiliar nos programas de controle e prevenção da doença. O desenvolvimento de vacina mais eficaz é uma das estratégias consideradas promissoras para o futuro do controle da doença (Colditz et al. 1994; Pitt et al. 2013). A falta de um correlato de proteção que sirva como parâmetro de eficácia vacinal, a grande variação encontrada na resposta imune dos indivíduos aos antígenos vacinais, os altos custos dos ensaios clínicos e os ensaios experimentais em animais são alguns dos problemas encontrados nas pesquisas em desenvolvimento.
Para compreender as razões da limitada eficácia vacinal é importante avaliar a resposta imunológica dos indivíduos que receberam a vacina. Os ensaios clínicos de avaliação da eficácia da BCG contra a tuberculose têm como desfecho a ocorrência ou não de doença, pelo que exigem o arrolamento de um elevado número de indivíduos e frequentemente não avaliam parâmetros da resposta imune nos voluntários.
Por outro lado, a tuberculose experimental e os efeitos da vacina em modelos animais têm grandes diferenças em relação à doença humana. Modelos murinos, os principais adotados na literatura pelo seu baixo custo, não refletem a infecção pulmonar natural, já que nestes não se reproduz o estágio latente de infecção, a infecção crônica normalmente leva à morte dos camundongos e os
resultados histopatológicos são diferentes, com aparecimento de granulomas não caseosos (Barbosa et al. 2003; Barreto et al. 2002; WHO, 2014; Jr et al. 2004; Brennan et al. 2012; Brennan e Evans 2012). Os mecanismos imunológicos elicitados na resposta protetora em camundongos também não são os mesmos envolvidos na resposta em humanos (Leung et al. 2013; Cooper et al. 1993; Acosta et al. 2011).
Diante das limitações e dificuldades encontradas, verifica-se urgência no desenvolvimento de pesquisas envolvendo a busca por biomarcadores capazes de predizer se a vacina estimula o sistema imune para proteção a uma infecção micobacteriana. Nosso estudo avaliou a resposta imune à vacinação com BCG, numa população onde sabe-se que existe eficácia moderada com efeito protetor conhecido. Desta forma, observou-se a resposta à vacina BCG em indivíduos adultos revacinados, já que existem pesquisas que demonstram eficácia moderada e o efeito da vacinação e revacinação é conhecido em nosso meio em crianças e adolescentes (Barreto et al. 2011; Barbosa et al. 2003; Barreto et al. 2002). Dessa forma, demonstramos que a produção de IFN-γ distingue grupos de indivíduos quanto a resposta à vacina a longo prazo, o que pode sinalizar o potencial desta medida como biomarcador de eficácia vacinal. Além disso, identificamos proteínas micobacterianas sendo reconhecidas diferencialmente entre os indivíduos com resposta de produção aumentada de IFN-γ a longo prazo, apresentadas como promissores candidatos vacinais.
2 REVISÃO DE LITERATURA
2.1 TUBERCULOSE: NECESSIDADE DE UMA VACINA MAIS EFICAZ.
A tuberculose permanece como um sério problema de saúde publica e segundo dados da Organização Mundial de Saúde é a segunda causa de morte por doença infecciosa em todo mundo, depois da infecção pelo HIV (WHO, 2014). Estima-se 8.6 milhões de novos casos em 2012 e 1.3 milhão de mortes causadas pela tuberculose (WHO, 2014). Vinte e dois países situados na América Latina, África e Ásia (WHO, 2012) são responsáveis por 80% dos casos em todo o mundo (WHO, 2013). (Figura 1)
FIGURA 1. Estimativa da incidência de tuberculose, 2012. WHO, 2013.
No Brasil estima-se que cerca de 57 milhões de pessoas estejam infectadas pelo agente etiológico da doença, o M. tuberculosis. Em 2012, foram registrados aproximadamente 85 mil novos casos de tuberculose, correspondendo a uma incidência de 122 casos por 100 mil habitantes, afetando principalmente a faixa etária de 20 a 49 anos. A Bahia apresentou incidência de 32/100 mil habitantes em 2011 (Diretoria de Vigilância Epidemiológica, 2014). Salvador apresentou incidência de tuberculose de 70/100 mil habitantes em 2010, índice superior à média nacional (Figura 2).
Figura 2. Incidência da tuberculose no Brasil, 2010. Fonte: Ministério da Saúde. Apesar da queda nos índices de prevalência e incidência da doença em escala global, o número de doentes tem crescido com o aumento da população (WHO, 2013). A proposição de novas vacinas constitui uma das ferramentas consideradas estratégicas para atingir as metas de controle da tuberculose (Brennan, 2012). Espera-se que com uma vacina eficaz se possa controlar a transmissão, diminuir a infecção latente, evitar a manifestação da doença, abreviar o tratamento, evitar o internamento e, consequentemente, o óbito (Brennan e Evans 2012).
A única vacina disponível contra tuberculose é a vacina Bacilo de Calmette-Guérin (BCG) que está entre as vacinas de maior cobertura em todo o mundo. A vacina BCG foi desenvolvida, ao longo de um período de 13 anos, pelos cientistas Albert León Charles Calmette e Jean Marie Camille Guérin através da atenuação do
Mycobacterium bovis virulento após 230 passagens ao longo de um período de 13 anos (McShane 2011; Fortin et al. 2007). Apesar da utilização ampla da vacina BCG pelo mundo, os casos da doença ainda permanecem elevados. Por isso, para reduzir ou eliminar os casos de tuberculose, os estudos para o desenvolvimento de nova vacina podem ser uma estratégia promissora para a redução da doença (Andersen e Doherty 2005).
2.2 ESTUDOS SOBRE EFICÁCIA DA VACINA BCG.
A vacina BCG foi primeiramente administrada como uma vacina oral em recém-nascidos em 1921 e tem sido parte do Programa de Imunização preconizado pela Organização Mundial da Saúde desde 1974. A BCG é aplicada no primeiro ano de vida nos países em que a doença tem elevada prevalência (Fine 1988; McShane 2011; Kaufmann 2013; Ottenhoff e Kaufmann 2012). Cerca de cem milhões de doses da vacina BCG são administradas a cada ano no mundo e as complicações decorrentes da vacinação são raras (El Ouazzani et al. 2007; WHO, 2014).
Fatores que levam a diminuição da eficácia vacinal nos programas de vacinação incluem a localização geográfica, que determina diferenças na exposição a micobactérias ambientais, o que pode afetar a resposta imune induzida pela vacina BCG e possivelmente também a novos modelos vacinais (Young e Hershfield 1986; Camargos et al. 1988). Infecções por helmintos também podem comprometer a eficácia vacinal devido ao tipo de resposta imunológica predominante nestas infecções (Pitt et al. 2013; Trunz et al. 2006). Outros fatores podem estar envolvidos na eficácia vacinal: heterogeneidade genética (Tala-Heikkilä et al. 1998; Camargos et al. 2006; Dye 2013), estado nutricional (Karonga Prevention Trial Group, 1996; Rodrigues et al. 2005), condições sócioeconômicas (Roth et al. 2010; Barreto et al. 2006; Leung et al. 2001; Dantas et al. 2006) e idade da administração da vacina (Barbosa et al. 2003; Barreto et al. 2002; Wünsch-Filho et al. 1993; Fjällbrant et al. 2007; WHO, 2004). A tabela 1 sumariza os resultados de alguns estudos clínicos randomizados realizados sobre a eficácia vacinal.
Estudos de caso-controle que avaliaram a primeira dose da vacina BCG contra todas as formas de TB mostram variação do efeito protetor entre 16 a 73%. Alguns fatores avaliados diferem entre os estudos, como a faixa etária, formas clínicas da tuberculose, seleção dos controles e tamanho da amostra (Sirinavin et al. 1991; Young e Hershfield 1986; Patel et al. 1991; Shapiro et al. 1985; Camargos et al. 1988; Wünsch-Filho et al. 1993; Clemens et al. 1983). Na infância, a vacinação BCG apresenta proteção acima de 70% contra formas graves (meningite tuberculosa e tuberculose miliar) (Shapiro et al. 1985; Wünsch-Filho et al. 1993; Flynn et al. 2001). A eficácia protetora contra a forma mais frequente e maior responsável pela disseminação do bacilo, a tuberculose pulmonar, variou entre 0 a 90%, havendo taxas mais altas de proteção na América do Norte e Europa e nenhuma ou pouca
proteção nas áreas tropicais. Nesta meta-análise estimou-se 50% de proteção conferida pela vacinação com a BCG (Colditz et al. 1994). Para formas meníngeas e miliares o efeito estimado por meta-análise foi superior a 50% (Trunz et al. 2006). Há registro de efeito protetor por 10 anos (Li et al. 2012), entre 15 – 20 anos em estudos no Brasil (Barreto et al. 2011; Dantas et al. 2006) e cerca de 50-60 anos em nativos do Alaska e índios americanos (Aronson et al. 2004). No Brasil, a eficácia da BCG quando administrada a neonatos foi estimada em 34% (8-53%, intervalo de confiança a 95%).
Estudos de meta-análise avaliando a população do Malawi mostraram que a revacinação com BCG reduziu em 50% o risco de hanseníase, porém não conferiu proteção adicional contra a tuberculose. Devido ao baixo efeito protetor a estratégia de revacinação foi desaconselhada na população estudada (Fine et al. 1996; Weir et al. 2006) . No Brasil, Barreto e colaboradores avaliaram adolescentes das cidades de Salvador e Manaus, revacinados com a BCG entre 7-14 anos de idade (após vacinação no período neonatal). O estudo acompanhou os voluntários por 9 anos através do Programa de Vigilância Epidemiológica e demonstrou eficácia adicional em relação à primo-vacinação apenas na população de Salvador (19%, 3 a 33%) (Barreto et al. 2011). Em ensaio clínico randomizado controlado o efeito da revacinação contra tuberculose pulmonar (Barreto et al. 2011) não registrou diferença significativa entre grupo controle e de intervenção [razão da taxa de 0.91 (0.79- 1.05)], e em estudo de coorte também não houve diferença significativa entre ambos grupos [risco relativo de 0.59 (0.14-2.47)] (Tala-Heikkilä et al. 1998).
A política da revacinação foi descontinuada em alguns países, incluindo o Brasil (Tala-Heikkilä et al. 1998; Camargos et al. 2006). Questiona-se se a revacinação com a BCG não poderia ser oferecida nos programas de imunização para proteção de adolescentes, já que poderia servir de plataforma para introdução de futuras vacinas contra TB, sugerindo que o efeito protetor da revacinação deve ser mais estudado e apoiado em ensaios clínicos (Dye 2013). Neste contexto, o estudo da resposta imune à vacina BCG é capaz de fornecer candidatos biomarcadores, os quais, sendo heterogeneamente induzidos pela (re)vacinação, podem ser associados ao desfecho de proteção contra a infecção e/ou doença tuberculosa. As pesquisas envolvendo a vacinação e revacinação com a BCG são importantes fontes de avaliação da resposta imune capaz de proteger o indivíduo,
bem como na observação das possíveis falhas que podem ser solucionadas em
Tabela 1. Ensaios clínicos randomizados para estimativa da eficácia da revacinação com BCG contra tuberculose. País Características dos
participantes Idade da vacinação Casos de TB no grupo controle (N) Casos de TB no grupo revacinado (N) RP ou RR1
Desfecho avaliado Referência
Malawi Todos participantes foram vacinados na infância. Foram excluídos voluntários com evidência de tuberculose, desnutridas ou com doença grave. Não especi-ficado. 14501 14742 0.51 (0.26– 0.99) Avaliação da tuberculose pulmonar e extrapulmonar através de avaliações clinicas e bacteriológicas (Fine et al. 1996)
Brasil Todos os participantes foram vacinados na infância. 7–14 anos TB pulmonar: 98 TB extra-pulmonar: 37 TB pulmonar: 117 TB extra pulmonar:27 0.97 (0.76-1.28) Incidência da tuberculose (pulmonar e extrapulmonar) (Rodrigues et al. 2005) Guinea – Bissau
Todos os participantes foram vacinados na infância.
18-19 meses 1434 1437 1.20 (0.77-1.89)
Nenhuma morte dos 18 meses até 5 anos de idade.
(Roth et al. 2010) Brasil Todos os participantes foram
vacinados na infância. 7 – 14 anos 97087 103718 0.91 (0.79-1.05) Incidência da tuberculose (Barreto et al. 2006)
Tabela 2. Estudos de coorte para estimativa da eficácia da revacinação com BCG contra tuberculose. País Características dos
participantes Idade da vacinação Casos de TB no grupo controle (N) Casos de TB no grupo revacinado (N)
RP ou RR1 Desfecho avaliado Referência
Finlândia Todos os participantes foram vacinados após o nascimento. Crianças com 11-13 anos 388089 371199 RR:0.59 (95%-CI: 0.14-2.47) Tuberculose confir-mada a partir de exames bacterioló-gicos e clínicos. (Tala-Heikkilä et al. 1998) Hong Kong Todos os participantes foram vacinados na infância
Crianças em idade escolar com 6–9 anos entre 1984 e 1991 183 119 RR: 0.39 (0.31-0.49) Tuberculose confir-mada a partir de exames bacterioló-gicos, clínicos, radio-lógicos e historadio-lógicos.
(C. C. Leung et al. 2001)
2.3. RESPOSTA IMUNE À VACINA BCG.
A vacina BCG é comercializada liofilizada e por recomendação da Organização Mundial de Saúde, aplicada por via intradérmica na região deltóide do braço (WHO, 2004). Após a aplicação, a micobactéria é capturada pelas células de Langerhans que migram para os linfonodos, local onde os antígenos serão apresentados aos linfócitos T. O perfil Th1, caracterizado pela produção de citocinas relacionadas principalmente com a defesa mediada por fagocitose contra agentes infecciosos intracelulares, é estimulado, assim como a produção de citocinas pró-inflamatórias IFN-γ, IL-2 e TNF (Flynn et al. 2001; Kaufmann et al. 2013). Na resposta à vacina há também a participação do perfil Th17 com a produção da interleucina 17 (Li et al. 2012; Kozakiewicz et al. 2013, 1717; Ling et al. 2013, -17). Essas citocinas atuam na ativação e proliferação celular, com participação de quimiocinas que recrutam células para o local da infecção (Flynn et al. 2001). O papel destas citocinas são avaliados em estudos com indivíduos portadores de mutações nos genes do receptor IL-12 e IFN-γ e nos pacientes tratados com bloqueadores do TNF (Fortin et al. 2007; Keane et al. 2001). O TNF está associado com o risco de ter a forma ativa da tuberculose (Flynn et al. 1995), como observado em macacos tratados com agentes neutralizantes de TNF e infectados com Mtb, o que desencadeou nestes animais, a disseminação do bacilo e redução da produção de IFN-γ após a diminuição da produção do TNF (Lin et al. 2010). A alta taxa de tuberculose entre pessoas infectadas com HIV ou com defeitos na via de sinalização IFN-γ ou ainda nos indivíduos que receberam terapia imunosupressiva (esteróides ou antagonistas do TNF ou drogas citotóxicas) indicam indiretamente o importante papel da resposta imune celular com a produção de citocinas. Contudo, a via efetora da resposta e os mecanismos de proteção permanecem incertos (Yao et al. 2014). Em estudos murinos, a depleção do IFN-γ nos animais levou a destruição tecidual e necrose associado com grande número de bacilos indicando que o IFN-γ tem papel fundamental para resolução da infecção (Leung et al. 2013; Cooper et al. 1993; Ozeki et al. 2011) Em humanos, polimorfismos no gene que codifica o receptor 1 do IFN-γ (IFNyR1) aumentam a suscetibilidade a infecções micobacterianas e agravamento das lesões, além das complicações oriundas da vacinação com BCG, como por exemplo, a disseminação da cepa vacinal que leva a doença provocada pela vacina (Mansouri et al. 2005; Deng et al. 2013; Junqueira-Kipnis et al. 2013).
As modificações imunológicas que ocorrem na tuberculose ativa ou latente e avaliadas nos modelos experimentais através da produção de citocinas e outras moléculas (Ling et al. 2013; Lin et al. 2010; Lin et al. 2010; Iljine et al. 2013), ativação e proliferação celular (Arkhipov et al. 2013; Chen et al. 2009, 4; Helke et al. 2006) e tempo de duração da vacina (Ozeki et al. 2011) auxiliam na compreensão da ação da vacina BCG no organismo humano. A comparação entre modelos murinos infectados com cepas da BCG ou com outras cepas do M.bovis demonstrou diferenças no perfil de citocinas e diferenciação celular, sugerindo que a vacinação é capaz de promover uma resposta diferenciada que pode ser a chave para indicar o que deve ser evidenciado em futuras estratégias vacinais (Zhang et al. 2013). O tempo de duração da vacina também foi avaliado em modelos murinos vacinados com BCG e posteriormente desafiados com o Mycobacterium tuberculosis, mostrando que neste modelo a perda da eficácia não depende da idade do camundongo, mas do período da vacinação (Ozeki et al. 2011). A indução da imunidade celular com participação de células TCD4+, TCD8+ e outros tipos celulares foi evidenciada em estudos com voluntários vacinados/revacinados e em doentes com a tuberculose ativa (Ottenhoff et al. 2012; McShane 2011; Du et al. 2010; Maglione et al. 2009). A ação dos mecanismos imunológicos na tuberculose ou na resposta profilática indica qual a melhor estratégia de ativação de uma resposta imune protetora. A escolha de uma vacina ideal torna-se difícil quando estudos imunológicos não apresentam respostas conclusivas acerca dos mecanismos imunopatogênicos envolvidos na infecção micobacteriana. Não sabemos ao certo se uma resposta pró- ou antiinflamatória é a mais eficaz, ou qual a participação de outros fatores associados como, por exemplo, a virulência de cepas do M.tuberculosis. Neste sentido, determinar o papel das células B, a produção de anticorpos, a resposta celular e a liberação de citocinas são alvos para entender melhor os mecanismos do sistema imune frente a TB (Vekemans et al. 2001; Abebe 2012). Alguns trabalhos vêm descrevendo alguns mecanismos tais como anticorpos neutralizantes, IgG e IgA presente na mucosa e no soro (Iljine et al. 2013, Casanova 2000; Galal et al. 2012; Karaca et al. 2012; Mansouri et al. 2005) , a proliferação de células especializadas e análise da produção de citocinas (Stenger 2001; Weir et al. 2008; Casanova 2000; Mansouri et al. 2005). Porém, ainda não foi identificado biomarcador efetivo capaz de avaliar a eficácia da resposta à vacina contra tuberculose.
2.4 IFN-γ COMO BIOMARCADOR PROMISSOR PARA AUXILIAR NA BUSCA DE VACINAS SUBSTITUTAS OU COMPLEMENTARES À ATUAL BCG.
Marcadores biológicos ou biomarcadores são células, moléculas ou conjunto de análises que podem indicar processo biológico patológico, resposta farmacológica a uma intervenção terapêutica, ou a resposta imunológica gerada pós-vacinação, fornecendo importantes informações sobre o estágio da doença, risco de progressão, toxicidade da droga, resposta ao tratamento e imunidade protetora pós vacinação (Walzl et al. 2011). As dificuldades encontradas na avaliação da eficácia de candidatos vacinais devido a falhas na validação em humanos dos achados em modelos animais demonstram a importância de encontrar biomarcadores que avaliam a eficácia de novas vacinas. Biomarcadores podem ser a base para ensaios clínicos, avaliações do prognóstico da doença ou ainda predição de que indivíduos podem ser beneficiados ou não pela vacina (Montañés et al. 2011; McShane et al. 2004). Na tuberculose, a busca por biomarcadores é relevante, pois a tuberculose é uma doença crônica, na qual dos indivíduos com a forma latente, apenas 10% revertem para a forma ativa da doença.
Marcadores não específicos de inflamação, como a proteína C reativa, isoladamente não possuem valores preditivos para uso clínico (Wallis et al. 2010). Quimiocinas e citocinas são moléculas chave para regulação da resposta imunológica e têm sido amplamente estudadas devido ao seu potencial como biomarcadores de diagnóstico e prognóstico da tuberculose. As quimiocinas e citocinas participam da regulação e ativação celular envolvidos na imunidade e inflamação (Flynn et al. 2001). Marcadores de exaustão celular também são alvos de pesquisas de biomarcadores de resposta celular, como por exemplo, as proteínas de morte celular programada-1 (PD-1) (Wallis et al. 2010). Na tuberculose, a resposta celular está relacionada ao mecanismo imunológico de proteção e por isso, os potenciais biomarcadores investigados estão relacionados às células ou moléculas que participam desta resposta. As células TCD4+ e TCD8+ estão relacionadas ao mecanismo de contenção do bacilo pela produção de citocinas ou ação citotóxica e isso desperta o interesse em avaliá-las como marcadores biológicos de proteção vacinal (Chen et al. 2009, 8; Stenger 2001; Stenger et al. 1999). A participação das células TCD8+ foi evidenciada em estudos realizados em macacos rhesus depletados de células TCD8+ e vacinados com BCG. Após exposição ao Mtb houve
diminuição da resposta imune induzida pela vacina e aumento da carga bacilar nos controles não vacinados.(Chen et al. 2009). Na ausência de células TCD4+, os
macacos depletados de CD4+ e expostos ao M.tuberculosis apresentaram
disseminação do bacilo. Mesmo com a compensação de maior proliferação de células TCD8+, estas não foram capazes de evitar o agravamento da doença (Yao et al. 2014). Na tuberculose humana, a frequência das células TCD4+ e TCD8+ polifuncionais produtoras de IFN-γ e TNF é maior em indivíduos com tuberculose ativa do que nos indivíduos com tuberculose latente. Estas citocinas estão envolvidas na contenção do bacilo no organismo (Yao et al. 2014). Alguns estudos analisaram o papel de citocinas e a participação de células TCD4+ e TCD8+ na resposta à primo vacinação com BCG, evidenciando a capacidade da vacina estimular a produção de citocinas e proliferação celular (Lalor et al. 2010; Weir et al. 2008; Vekemans et al. 2001). Os estudos com novos candidatos vacinais que têm sido propostos têm avaliado a resposta vacinal através do aumento da frequência de células T e do perfil de citocinas, porém a resposta de células T polifuncionais apresentou correlação com proteção contra tuberculose após vacinação com a BCG (Kaufmann et al. 2010). A produção de IFN-γ e outras citocinas tem sido avaliada em populações vacinadas com a BCG e considerada um marcador promissor de avaliação da resposta imune na tuberculose (Li et al. 2012).
Dentre as citocinas, o IFN-γ é potencial biomarcador da resposta imune na tuberculose na avaliação da doença e da resposta pós vacinação BCG (Abebe 2012). A produção de IFN-γ é bastante estudada na tuberculose devido a participação celular intensa na contenção do bacilo observada nos modelos murinos e avaliações in vitro em humanos. Alguns estudos que avaliaram indivíduos com deficiências genéticas nos receptores do IFN-γ, mostraram a falha na defesa imunológica contra micobactérias. Os voluntários com alteração na estrutura do receptor de IFN-γ e vacinados com a BCG apresentaram infecções disseminadas causadas pela cepa vacinal. A suscetibilidade também ocorre frente a exposição a micobactérias ambientais causando infecções graves nos indivíduos com predisposição genética a infecções micobacterianas demonstrando o importante papel do IFN-γ na resposta contra o bacilo (Casanova 2000; Galal et al. 2012; Karaca et al. 2012; Mansouri et al. 2005).
Estudos em murinos apontam a associação da resposta Th1 e produção de IFN-γ com a resposta imune protetora contra a tuberculose (Deng et al. 2013).
Utiilizando estratégia de prime-boost com a vacina BCG recombinante (rBCG), camundongos vacinados com rBCG e desafiados com Mtb apresentaram maior proteção com aumento dos níveis do IFN-γ quando comparados aos controles não vacinados (Junqueira-Kipnis et al. 2013). Em humanos os resultados foram semelhantes. Voluntários primo-vacinados com BCG e revacinados com a nova vacina composta por fusão das proteínas Ag85B-ESAT-6 mais adjuvante, apresentaram forte resposta protetora associada a proliferação celular e produção de citocinas, entre elas, o interferon gama. A resposta foi persistente nas 32 semanas de acompanhamento indicando indução de resposta imune de memória (van Dissel et al. 2011). Porém, Deng e colaboradores (2013) utilizando modelos murinos vacinados com rBCG expressando Ag85B-ESAT-6 e desafiados com Mtb não observaram associação com a produção do IFN-γ nas resposta imune contra o bacilo. Alguns estudos não correlacionam a frequência de células TCD4 e TCD8 produtoras de IFN-γ como parâmetro de avaliação da eficácia vacinal. Ocorre ativação celular e produção de citocinas, mas não há relação com imunidade protetora eficiente (Tameris et al. 2014; Kagina et al. 2010).
A identificação de biomarcadores que avaliam a resposta da vacina pode auxiliar nas pesquisas sobre as novas vacinas em desenvolvimento reduzindo o número de voluntários, o tempo das triagens clínicas além de permitir a proteção conferida pela vacinação (Brennan et al. 2012).
2.5 NOVOS CANDIDATOS VACINAIS CONTRA A TB.
Pesquisas relacionadas ao desenvolvimento de candidatos vacinais focam em moléculas que possam aumentar a efetividade da vacina atual utilizando duas estratégias principais: aumentar imunidade através de vacinas de subunidades como reforço da atual BCG e vacinas que possam substituir a atual BCG (Montañés et al. 2011). Atualmente são aproximadamente 12 candidatos vacinais em estudos clínicos. Dez são vacinas pré-exposição ou profiláticas que podem ser efetivas na infecção primária, latente ou na reativação da doença. Já as outras duas vacinas são terapêuticas ou pós-exposição, importantes no curso da doença, intensificando a resposta imune e a quimioterapia (Kaufmann et al. 2010; Kaufmann 2013; Brennan et al. 2012).
Os candidatos vacinais contra tuberculose em estudo incluem estratégias variadas de indução da resposta imune, como a utilização de micobactérias não patogênicas (M.vaccae) (Vilaplana et al. 2010; Sweeney et al. 2011; von Reyn et al. 2010), vetores virais (MVA85A, AERAS-402 e AdAg85A) (Hawkridge et al. 2008; Verreck et al. 2009; Abel et al. 2010; McShane et al. 2004; Xing et al. 2009), proteínas de fusão com adjuvantes indutores da resposta Th1 (M72/AS01; M72/AS02, Hybrid1 e HyVac4) e BCG recombinantes (Aeras422, rBCG30) (Grode et al. 2005; Hoft et al. 2008; Kaufmann et al. 2012). A tabela 3 exemplifica candidatos vacinais contra tuberculose.
Outro fator a ser considerado na proposição de novos candidatos vacinais é a alta taxa de co-infecção HIV-TB. Sabe-se que um patógeno auxilia na propagação do outro. O HIV apresenta tropismo por linfócitos TCD4+ e utiliza estas células para
produção das proteínas que irão formar a cápsula viral e seu material genético. As células TCD4+ que albergam o HIV tornam-se inativas e por isso não atuam na defesa imunológica nos indivíduos co-infectados HIV/TB. Na tuberculose, os linfócitos TCD4+ têm importante papel na produção de citocinas pró-infamatórias, como IFN-γ, pois ativam macrófagos infectados pela micobactéria a produzir enzimas e intermediários reativos de oxigênio e nitrogênio e assim conseguir destruir o bacilo. Neste sentido, indivíduos HIV positivos que apresentam diminuição de linfócitos TCD4 ou inativação destas células apresentam maior risco de reverter o
estado latente da TB em doença ativa (Evans et al. 2013; Guimarães et al. 2012; Pawlowski et al. 2012).
Tabela 3. Candidatos vacinais contra tuberculose. Fonte: Adaptado de Evans et al. 2013
Tipo de vacina Fundações responsáveis
Estágio de
desenvolvi-mento
Descrição Vacinas que utilizam micobactérias atenuadas.
rBCG30 (Hoft et al. 2008)
UCLA/INH/ AERAS
Fase I BCG cepa Tice recombinante expressando antígeno 85B do Mtb.
VPM1002 (Grode et al. 2013)
Max Planck/TBVI Fase I BCG cepa Prague recombinante expressando listeriolisina. MTBVAC (Arbues et al. 2013) Universidade de Zaragoza/Institut Pasteur
Fase II Cepas vivas atenuadas do
M.tuberculosis com os genes
inativos phoP e fadD26. rBCG∆UriC:Hly
(Farinacci et al. 2012)
Max Planck Institut
Fase I Cepa BCG atenuada com mecanismo de escape através do endossoma.
RUTI (Vilaplana et al. 2010)
Archivel Farma Fase I Cepa M.tuberculosis fragmentada inseridas em lipossomas.
M.vaccae
(Butov et al. 2013)
Tabela 3 (cont.). Candidatos vacinais contra tuberculose. Fonte: Adaptado de Evans et al. 2013
Vacinas que utilizam proteínas micobacterianas
HyVac4
(AERAS-404) + IC31 (Billeskov et al. 2012)
AERAS Fase I Proteínas recombinantes
compostas pela fusão de antígenos Ag85B, TB10.4 + adjuvantes. Mtb72f+AS02 Mtb72f+AS01 (Spertini et al. 2013, 72)
Glaxo Smith Kline Biologicals/ AERAS
Fase I/II Proteínas recombinantes compostas pela fusão de antígenos Rv1196 e Rv0125 do Mtb + adjuvantes. Ag85B-TB10.4 (Dietrich et al. 2005) University of Oxford
Fase I Proteínas recombinantes compostas pela fusão de antígenos TB10.4; eAg85B + adjuvantes. Ag85B-ESAT6 + IC31 (van Dissel et al. 2011)
LUMC Fase I Proteínas recombinantes
compostas pela fusão de antígenos ESAT-6 e Ag85B + adjuvantes.
Vacinas que utilizam vetores virais
MVA85A
(Tameris et al. 2014)
University of Oxford
Fase II Vetor viral vaccinia ankara modificado expressando antígeno 85A do Mtb.
Crucell Ad35 Crucell/AERAS Fase II/III Vetor viral adenovírus 35 modificado expressando antígenos 85A, 85B e TB10.4. AdAg85A (Wang et al. 2004) McMaster University
Fase I Adenovírus expressando Ag85A do Mtb.
A busca de novas vacinas contra tuberculose levam em consideração a utilização da atual BCG na primo-vacinação, já que na infância apresenta efeito protetor. Umas das estratégias adotadas nos modelos de novas vacinas contra tuberculose consiste na utilização da estratégia prime-booster heterólogo, no qual
aplica-se a atual BCG na primo-vacinação e faz-se uma ou mais doses de reforço com a vacina a ser testada (Dey et al. 2011; Rahman et al. 2012). Por esta razão é tão importante conhecer a resposta do sistema imunológico após a vacinação BCG para que o reforço seja efetivamente capaz de promover proteção.
As vacinas de subunidades utilizam esta estratégia de reforço. São empregadas proteínas recombinantes adicionadas a adjuvantes ou produzidas por vetores virais atenuados (Olsen et al. 2001; Ocampo et al. 2013). Nesse modelo vacinal, são utilizadas poliproteínas com adição de adjuvantes capazes de induzir resposta imune potente e duradoura. Um exemplo é a vacina M72/MTB72F que consiste numa poliproteína de 72κDa com adição de adjuvantes, atualmente em Fase II de avaliação. O candidato vacinal M72F foi produzido pela fusão de proteínas recombinantes baseadas na serina protease Mtb32A e Mtb39A, selecionadas por sua capacidade de induzir produção de IFN-γ por células TCD4+ e TCD8+ em voluntários sadios, com infecção tuberculosa latente. A formulação conta com a introdução dos adjuvantes AS01 ou AS02, que têm sido demonstrados como potencializadores da resposta protetora na tuberculose em modelos animais. Estes adjuvantes são lipossomas (AS01) ou emulsão em água e óleo (AS02) capazes de induzir resposta imune potente e duradoura (Karaca et al. 2012).
Outras vacinas em teste utilizam fusão de proteínas micobacterianas imunogênicas em modelos animais, como a combinação dos antígenos 85B e ESAT-6. A vacina Hybrid I/HγVAC IV é capaz de induzir intensa resposta imune celular via receptor Toll-like 9/via de sinalização MyD88 e ativa proliferação de células TCD4+ (Olsen et al. 2001). O candidato vacinal AERAS
402/Ad35-85B-TB10.4 utiliza vetores virais com replicação deficiente do adenovírus, sorotipo 35, capazes de expressar proteínas produzidas a partir das sequências dos antígenos Ag85A, Ag85 B e TB10.4 do M. tuberculosis. A vacina mostrou ser imunogênica e protetora em murinos e primatas não humanos (Abel et al. 2010).
Atualmente, existem diversas maneiras de identificar proteínas que podem ser importantes alvos na apresentação de antígenos ao complexo de histocompatibilidade principal (MHC) classe I e II das células apresentadoras de antígenos (APC’s) às células TCD4+ e TCD8+. A identificação de proteínas ou epítopos imunogênicos de proteínas micobacterianas tem sido útil nas pesquisas sobre a imunologia da tuberculose e na vacinologia, através de modelos de novos candidatos vacinais, diagnósticos e marcadores de resposta a terapia (Duarte et al.
2011; Figueiredo et al. 2008; Geluk et al. 2012). A utilização de ferramentas que analisam a ligação entre as células e as proteínas pode auxiliar na seleção de epítopos capazes de gerar resposta imune protetora e isto implica na redução do tempo de desenvolvimento de novas vacinas. Essa estratégia aliada à validação de biomarcadores de proteção torna possível identificar indivíduos que podem ser protegidos pela vacinação e melhor planejar estratégias profiláticas que possam beneficiar maior número de indivíduos.
3. HIPÓTESE DO ESTUDO
Hipótese I. O aumento de produção de IFN-γ em resposta a antígenos micobacterianos é capaz de distinguir indivíduos com modificações a longo prazo da resposta após a vacina. Este é um requisito importante para que um parâmetro possa ser utilizado como biomarcador de proteção conferida pela vacina BCG.
Hipótese II. A partir da resposta humoral de indivíduos revacinados que apresentam aumento da produção de IFN-γ a antígenos micobacterianos após a vacina é possível propor candidatos vacinais mais adequados para populações humanas.
4. OBJETIVOS 4.1 Objetivo geral
Investigar a modulação de parâmetros imunológicos in vitro em resposta aos antígenos de Mycobacterium tuberculosis em indivíduos revacinados com BCG, de forma a mapear o perfil de resposta destes indivíduos, reconhecendo os padrões imunológicos associados a uma boa resposta versus uma resposta ineficaz contra micobactérias através de análise multiparamétrica.
4.2 Objetivos específicos
• Avaliar a produção de citocinas no sobrenadante de culturas de sangue total em resposta a antígenos micobacterianos, entre os tempos zero, dois e doze meses após revacinação, em indivíduos revacinados e não revacinados com a vacina BCG.
• Avaliar a expansão in vitro por estímulo micobacteriano de células T de indivíduos revacinados e não revacinados com a vacina BCG, nos tempos zero e dois meses após a revacinação.
• Evidenciar quais fatores são preditivos do aumento da produção de IFN-γ doze meses após a revacinação, de forma a categorizar os voluntários em dois grupos: de alta e de baixa resposta à vacina.
4.3. Objetivo secundário
A partir da identificação por imunoproteômica de alvos diferencialmente reconhecidos por voluntários de alta resposta entre as proteínas do Mycobacterium
bovis BCG, realizar o estudo in silico dos potenciais epítopos imunogênicos presentes nestas proteínas frente a moléculas de HLA humanas.
5. Capítulo 1. Interferon-gamma production by mononuclear cells in Bacille Calmette-Guérin-revaccinated healthy volunteers predicted long-term antimycobacterial responses in a randomized controlled trial. Artigo Científico publicado em 2013 na Revista Vaccine.
Neste trabalho, avaliou-se a produção de citocinas em sobrenadante de culturas de sangue total em resposta a antígenos do Mycobacterium tuberculosis em adultos jovens revacinados com a BCG como potenciais marcadores da resposta vacinal a longo prazo. O estudo realizado foi um ensaio clínico randomizado controlado. Esta avaliação permitiu-nos demonstrar que o aumento da produção de IFN-γ induzido pela revacinação dois meses após a intervenção foi o único parâmetro capaz de distinguir controles de revacinados. Além disso, essa produção aumentada foi mantida após um ano em um grupo de voluntários, aqui considerados de alta resposta. Observamos que nos indivíduos revacinados deste grupo de alta resposta houve expansão in vitro de células consideradas como parte da resposta imune celular protetora contra o bacilo por estímulo micobacteriano, mais pronunciado inclusive quando o estímulo foi realizado com micobactérias vivas. A partir de análise por curva roc, consideramos o aumento da produção do IFN-γ como importante preditivo na seleção de indivíduos que poderiam ser beneficiados pela revacinação com BCG.
6. Capítulo 2. Utilização de epítopos e suas combinações para a identificação de indivíduos protegidos contra a tuberculose e métodos para o tratamento ou prevenção, vacinas profiláticas e/ou terapêuticas e método de prospecção de candidatos vacinais em doenças infecciosas. Notificação interna de invenção para pleito de patente de invenção junto ao Sistema Fiocruz de Gestão Tecnológica e Inovação / Núcleos de Inovação Tecnológica (GESTEC/NIT)
A avaliação sorológica dos indivíduos estudados no ensaio clínico realizado para contemplar os objetivos específicos deste trabalho possibilitou identificarmos proteínas micobacterianas reconhecidas diferencialmente por soros de voluntários sadios, revacinados com a BCG que apresentaram alta produção de IFN-γ após a intervenção. Esta avaliação foi realizada com a colaboração com a Dra. Leila Mendonça, coordenadora do Laboratório de Genômica Funcional e Bioinformática do Instituto Oswaldo Cruz. Avaliamos o reconhecimento sorológico de proteínas extracelulares da cepa vacinal M. bovis BCG cepa Moreau-RJ. Este trabalho, que fez parte da tese de doutorado da Dra.Melissa Pontes (Pereira 2009), demonstrou padrão de reconhecimento distinto entre os indivíduos revacinados com alta e baixa resposta, identificados no ensaio clínico. Em seguimento a esta avaliação, realizamos a avaliação preliminar dos epítopos imunogênicos presentes nas proteínas identificadas reconhecíveis por moléculas HLA humanas.
Esta notificação interna visou informar o Sistema GESTEC/NIT sobre a pesquisa em andamento e consultar quanto ao interesse institucional de interpor pedido de patente para o uso dos epítopos ou fusão dos epítopos identificados na proteção contra tuberculose.
Como nosso trabalho está em sigilo para pedido de patente, as sequências dos epitopos, bem como nomes das proteínas serão suprimidas.
NOTIFICAÇÃO DA INVENÇÃO
1-TÍTULO DA INVENÇÃO:
Utilização de epítopos e suas combinações para a identificação de indivíduos protegidos contra a tuberculose e métodos para o tratamento ou prevenção, vacinas profiláticas e/ou terapêuticas e método de prospecção de candidatos vacinais em doenças infecciosas.
2- Caracterização da Invenção
2.1 –Descrever de forma sucinta a solução técnica proposta pela invenção.
A presente invenção é referente a método de prospecção de candidatos vacinais para vacinas contra doenças infecciosas e um ou mais epítopos de proteínas micobacterianas reconhecidos por moléculas HLA-II humana frequentes na população brasileira, que poderão ser utilizados em combinação ou separadamente para confecção de vacinas profiláticas contra tuberculose e/ou em métodos de avaliação da eficácia de novas vacinas profiláticas e/ou terapêuticas contra esta doença. A abordagem aqui utilizada difere da literatura por terem sido selecionados alvos moleculares imunorreativos especialmente para indivíduos da população brasileira e também para outras populações onde a tuberculose é altamente endêmica, relacionados com produção alta e persistente de mediador importante para a imunidade contra a doença tuberculosa, produzido em resposta à vacina contra a tuberculose Bacilo de Calmette-Guérin, cuja eficácia é conhecida em nossa população.
2.2-Anexar material que descreva a solução técnica proposta pela invenção, incluindo dados experimentais obtidos.
Introdução: A tuberculose é um sério agravo, responsável por cerca de um milhão de mortes por ano em todo o mundo. Considera-se que imunidade protetora contra o bacilo pode ser atingida pela grande maioria dos indivíduos, uma vez que apenas 10% de infectados desenvolve a doença durante toda a vida (AXELSSON-ROBERTSON et al., 2012). Há uma vacina contra a tuberculose, o Bacilo de Calmette-Guérin (BCG), que está entre as vacinas de maior cobertura em todo o mundo. No entanto, a eficácia demonstrada da
vacina é muito variável, sendo maior contra formas graves e menos frequentes da doença (MCSHANE et al., 2012), porém podendo chegar a zero contra a forma mais frequente e maior responsável pela disseminação do bacilo, a tuberculose pulmonar (COLDITZ et al., 1994). Por esta razão, vários grupos em todo o mundo buscam uma vacina alternativa para a tuberculose, especialmente que apresente maior eficácia do que a BCG nos países responsáveis pela maior carga da doença, situados na América Latina, África e Ásia (WORLD HEALTH ORGANIZATION, 2012). Espera-se que com uma vacina eficaz se possa controlar a transmissão, diminuir a infecção latente, evitar a manifestação da doença, abreviar o tratamento, evitar ou abreviar o internamento e evitar o óbito (BRENNAN; THOLE, 2012).
Candidatos vacinais têm sido propostos com base nos resultados de estudos realizados em camundongos e outros animais e na comparação da resposta de indivíduos com infecção tuberculosa latente com a de indivíduos com tuberculose ativa (BRENNAN; STONE; EVANS, 2012). Apesar do uso de animais em diversos estágios de pesquisa como desenvolvimento, produção e controle de qualidade das vacinas cabe ressaltar que a resposta humana à doença difere muito da encontrada em camundongos, os quais não são infectados com micobactérias na natureza (ACOSTA et al., 2011; OTTENHOFF; KAUFMANN, 2012). Um ensaio clínico recente mostrou Por outro lado, em indivíduos infectados com a micobactéria tuberculosa, mesmo na ausência de doença ativa, a resposta imune é modulada pelo bacilo para facilitar a sua sobrevivência no hospedeiro (GUPTA et al., 2012). Por esta razão, explorar a resposta induzida contra micobactérias em um modelo humano na ausência de infecção latente e em que o grau de proteção conferido é conhecido torna-se uma oportunidade ímpar para a proposição de novos candidatos vacinais e biomarcadores de proteção que possam auxiliar na avaliação de novas vacinas contra a tuberculose.
Em Salvador, Bahia, Brasil um grande estudo epidemiológico objetivando a estimativa da eficácia de administração de uma segunda dose de BCG a crianças em idade escolar permitiu conhecer não apenas a eficácia da BCG contra a tuberculose quando administrada em uma segunda dose na idade de 7 a 15 anos (BARRETO et al., 2011; RODRIGUES et al., 2005), mas também aquela conferida por administração no início da vida (PEREIRA et al., 2012). A
eficácia da BCG nesta população contra a tuberculose, quando administrada a neonatos, foi estimada em 34% (8-53%, intervalo de confiança a 95%), e a eficácia da segunda dose de BCG em idade escolar foi estimada em 19% (3-33%, intervalo de confiança a 95%). Neste contexto, o estudo da resposta imune à vacina BCG é capaz de fornecer biomarcadores candidatos, os quais, sendo heterogeneamente induzidos pela (re)vacinação, podem ser associados ao desfecho de proteção contra a infecção e/ou doença tuberculosa. Nosso grupo utilizou este modelo de proteção moderada para investigar biomarcadores candidatos para a avaliação de novas estratégias vacinais, e para a proposição de novos alvos para vacinas contra a TB.
Avaliamos crianças revacinadas com uma segunda dose de BCG entre 7 e 15 anos na mesma população do ensaio clínico randomizado controlado descrito acima (BARRETO et al., 2002) e observamos aumento da capacidade de produzir a citocina interferon-gama (IFN-γ) dois meses após a vacinação apenas em uma parte dos indivíduos vacinados (BARBOSA et al., 2003), os quais pertenciam em sua maioria à faixa etária entre 12 e 15 anos de idade. Com base neste resultado, uma nova coorte foi montada com voluntários mais velhos (em sua maioria entre 18 e 22 anos de idade) e negativos para infecção tuberculosa latente que foram randomizados para receber ou não a revacinação com BCG (ensaio clínico randomizado controlado) e que foram monitorados nos intervalos de 2 e 12 meses após a revacinação (respectivamente, T2 e T12) quanto à resposta a antígenos micobacterianos e infecção in vitro com a BCG. Nesta coorte novamente o IFN-γ foi a citocina que se apresentou consistentemente aumentada no desafio in vitro com os antígenos micobacterianos em amostras de indivíduos revacinados nos dois tempos de avaliação, superando os níveis basais tanto em T2 como em T12 e superando a resposta de indivíduos controles (não revacinados) em T2 (OLIVEIRA, 2008). Além disso, indivíduos cuja produção de IFN-γ dois meses após a revacinação superou em pelo menos 3,3 vezes a sua resposta inicial apresentaram produção consistentemente aumentada de IFN-γ em T12 e também outros marcadores reconhecidos de uma resposta protetora contra micobactérias, nomeadamente a expansão de células com marcadores específicos (CD4+ e CD8+) produtoras de citocinas (IFN-γ sozinho ou IFN-γ associado ao TNF) (Oliveira et al., submetido para publicação). Cabe ressaltar
o papel fundamental da citocina IFN-γ, considerada a principal citocina responsável pela defesa contra a micobactéria tuberculosa (ACOSTA et al., 2011; OTTENHOFF; KAUFMANN, 2012).
Avaliamos a resposta imune humoral desses voluntários doravante denominados de alta resposta vacinal utilizando a tecnologia proteômica a fim de determinar o perfil de reconhecimento humoral, empregando para tal, proteínas extracelulares de M. bovis BCG Moreau (ativamentre secretadas para o meio extracelular e não covalentemente associadas a superfície celular) (PEREIRA, 2009). Verificamos que houve reconhecimento preferencial de proteínas pelo soro dos voluntários com alta resposta vacinal, as quais não foram reconhecidas pelo soro de indivíduos controles nem pelo soro de indivíduos que apesar de revacinados não atingiram um aumento de produção de IFN-γ de pelo menos 3,3 vezes após a administração da vacina. Com base nestes resultados propomos que há uma relação entre o reconhecimento preferencial de proteínas pela resposta humoral e a produção de mediadores importantes para a ativação da resposta imunológica, o que serve de base para a proposição do método aqui reivindicado de prospecção científica e tecnológica de novos candidatos vacinais para vacinas contra agentes infecciosos.
A presente invenção utiliza a associação entre o reconhecimento de proteínas específicas e a produção de mediadores no modelo humano de proteção conhecida contra o patógeno, exemplificados por, porém não limitados a citocinas como o IFN-γ, que são produzidos por células relevantes da resposta imune adaptativa, para a prospecção de epítopos capazes de induzir a resposta adaptativa selecionada que servirão como candidatos para i) novas estratégias vacinais, exemplificadas por, porém não limitadas a vacinas de DNA, proteínas de fusão com ou sem combinação de epítopos, etc., e ii) para biomarcadores da resposta de novas vacinas, com a avaliação da razão de aumento da produção dos mediadores relevantes para estabelecimento do ponto de corte para a indicação de indivíduos potencialmente protegidos. Esta nova estratégia constitui uma proposta que se encaixa no conceito de prospecção de candidatos de nova geração para vacinas contra a tuberculose baseadas na indução de anticorpos, para a qual existe atualmente uma ausência de racional conforme explicitado na literatura (BRENNAN; STONE;
EVANS, 2012).
Seguindo este modelo proposto, propõe-se também como objeto desta invenção epítopos aqui descritos (sequências SEQ. 1 a SEQ. 19) obtidos a partir do emprego de técnicas de bioinformática que são encontrados nas proteínas reconhecidas especificamente em soros de indivíduos de alta resposta vacinal frente à revacinação com BCG em Salvador, Bahia, Brasil (PEREIRA, 2009) onde esta estratégia confere proteção moderada contra a tuberculose (BARRETO et al., 2011). Os epítopos identificados correspondem a sequências reconhecíveis por moléculas de HLA-II mais presentes em nossa população e que podem sinalizar e estimular a produção de elevadas quantidades de IFN-γ em estratégias vacinais. Os epítopos selecionados poderão ser utilizados em combinação ou separadamente para confecção de novas vacinas contra tuberculose e como marcadores da eficácia de novas estratégias vacinais, especialmente aquelas desenhadas como booster ou como melhoramento genético da atual vacina BCG. Já existem discussões sobre o desenvolvimento de vacina de forma inversa utilizando informações imunológicas e genômicas na identificação de proteínas ou peptídeos relevantes em propostas vacinais (LEMAIRE; BARBOSA; RIHET, 2012). A utilização da bioinformática na predição dos epítopos como possíveis antígenos imunogênicos reconhecidos por moléculas de HLA para posterior utilização in vitro é apontada na literatura como chave para diminuir o tempo e custo dos experimentos (SEIB; ZHAO; RAPPUOLI, 2012).
Os testes utilizando os epítopos aqui apresentados poderão ser benéficos e superiores aos atualmente descritos e/ou em uso por algumas razões:
- vacina capaz de gerar resposta imunológica celular e humoral o que pode resultar numa resposta mais intensa;
- resposta aos epítopos pode indicar a potencial utilidade de outras vacinas já em testes clínicos ou a serem propostas, especialmente formuladas como booster ou como recombinantes da vacina BCG;
- os epítopos e a fusão destes são facilmente confeccionados, rápidos e com baixo custo;
- como as seqüências foram previamente obtidas através de programas de bioinformática, pode resultar em experimentos e testes de validação com
resultados mais rápidos. Materiais e métodos:
- Desenho experimental: Análise in vitro do aumento de produção de mediador da resposta adaptativa protetora (IFN-γ) face ao estímulo antigênico do patógeno (micobactéria) em ensaio clínico randomizado controlado, utilizando uma coorte de indivíduos TST negativos revacinados (com BCG) de uma população com proteção moderada contra a doença (tuberculose) conferida pela primeira e proteção moderada adicional conferida pela segunda administração da vacina, ambas documentadas na literatura, e associação desta resposta com o reconhecimento específico de proteínas da vacina (BCG) a partir das quais foram obtidos epítopos potencialmente indutores da produção de IFN-γ e capazes de se ligar a HLA de populações relevantes atingidas pela doença.
Seleção da população de estudo: Indivíduos de Salvador, Bahia, Brasil acima de 18 anos de idade cursando o primeiro ano de cursos de graduação da área de saúde, com cicatriz indicativa de vacinação BCG e negativos em dupla testagem ao teste tuberculínico (TST) (DA ROCHA et al., 2011). Critérios de exclusão: ausência de cicatriz vacinal indicativa de administração prévia da BCG; positividade ao TST ou falha na leitura ou aplicação de alguma etapa do teste; positividade ao teste de ELISA para HIV 1/2.
Randomização para administração da vacina e coleta de amostras: os indivíduos foram informados sobre os procedimentos a serem realizados e objetivos do estudo. O TST foi oferecido e os candidatos elegíveis foram randomizados entre grupo controle e grupo a ser revacinado e convidados a participar do estudo. Após assinatura do Termo de Consentimento Livre e Esclarecido, os voluntários foram submetidos a coleta de sangue (T0) seguida ou não por revacinação com BCG utilizada pelo Ministério da Saúde para a vacinação regular (Mycobacterium bovis BCG cepa Moreau-RJ, fornecida pela Fundação Ataulpho de Paiva) consoante o grupo de randomização. Os voluntários foram contatados posteriormente para comparecimento a uma visita de acompanhamento clínico (um mês após a intervenção) e duas coletas de sangue (dois – T2 e doze –T12 meses após a intervenção).
