Caracterização dos Isolados Obtidos

Após obtenção das culturas puras de BRS, prosseguiram-se os trabalhos com os testes para a identificação do gênero e/ou espécies das mesmas. A identificação foi realizada observando-se as características morfológicas tanto das células (forma, arranjo, entre outras) quanto das colônias (tamanho, cor, entre outras); além das bioquímicas, relacionadas com a capacidade das bactérias de sintetizar enzimas, assimilarem diferentes substratos e gerar produtos metabólicos específicos.

Por fim, procurando resultados mais seguros para a identificação dos isolados e assim inferir mais características sobre os mesmos, foi realizada a sua caracterização molecular.

3.4.1 Caracterização Morfológica

As características de cada colônia foram descritas observando-se macroscopicamente as mesmas após o crescimento dos isolados em meio sólido. Em seguida utilizou-se o Método de Coloração de Gram para a identificação da forma, arranjo celular bacteriano como também sua definição de Gram positivo ou Gram negativo como parâmetros usuais para etapa inicial de classificação taxonômica (RABUS et al., 2006). As observações de morfologia foram reforçadas com a sua visualização por meio de exame à fresco utilizando microscopia de contraste de fase. Todos os testes citados foram realizados com a utilização de Microscópio ótico marca Olympus (Modelo BX41).

Para melhor avaliação morfológica das referidas células dos isolados utilizou-se o Microscópio Eletrônico de Varredura, Marca Jeol, Modelo JSM-5510 (MEV), equipamento do Laboratório de Microscopia e Microanálise (Microlab) do Departamento de Geologia (DEGEO)-UFOP. Para esta análise seguiu-se o protocolo padronizado do Microlab/DEGEO-UFOP (GOLDSTEIN et al., 2003).

3.4.2 Caracterização Bioquímica Visando a Identificação Taxonômica

Para esta caracterização metabólica realizou-se uma série de testes bioquímicos a fim de avaliar a fermentação de glicose e de lactose pela produção de ácido e/ou gás. Também foi utilizado citrato como única fonte de carbono e uréia como única fonte de nitrogênio além da produção de indol e ácido sulfídrico a partir de triptofano e aminoácidos sulfurados, respectivamente. A motilidade foi também avaliada pela visualização do padrão de crescimento em meio semi-sólido, sendo posteriormente confirmada por meio do método da gota pendente em lâmina escavada (MILOSTAN, 2006).

Após a incubação dos tubos a 32ºC, durante 48 horas em condições anóxicas, foi feita a leitura das reações bioquímicas dos testes supracitados. Para certificação foram feitos controles positivos e negativos para os meios.

A verificação da capacidade das culturas puras para a utilização de diversos compostos orgânicos como fontes de carbono e energia foi também realizada utilizando o meio de cultura modificado de Postgate C contendo cada um dos compostos, citados à seguir, como única fonte de carbono, estando todos à uma concentração de 5g/L no meio de cultivo. Como dito anteriormente, este parâmetro é muito importante para uma melhor identificação dos isolados, além de fornecer importantes informações sobre as capacidades metabólicas dos mesmos. Assim, verificou-se o grau de oxidação dos seguintes compostos: acetato, lactose, glicose, lactato, etanol, acetona, benzeno, propionato e butirato, observando-se a formação de precipitado negro de FeS e produção de gás em tubo de Durhan, esta última evidencia uma oxidação completa do composto à CO2. Para realização

deste teste foram utilizados tubos de ensaio herméticos com rosca, contendo o meio dotado de apenas um dos compostos citados como fonte de carbono disponível, para cada composto testado foi feita uma bateria de tubos em duplicatas para maior certeza dos testes. Foram utilizados controles negativos, ou seja, um tubo contendo o meio sem as bactérias e com a fonte de carbono, e outro contendo as bactérias, mas sem a fonte de carbono.

O último teste realizado visando à identificação taxonômica dos isolados, o teste que indica a presença da enzima desulfoviridina, é muito importante uma vez que esta enzima (um tipo de sulfato redutase) está presente em apenas alguns grupos de BRS (RABUS et al., 2006).

Este teste seguiu uma metodologia citada por Silva (1999) pela qual o isolado, após seu crescimento em meio de cultura apropriado, é colocado em uma lâmina e tem sua células lisadas com a utilização de algumas gotas de NaOH 2N, em seguida a lâmina é observada ao microscópio óptico sob luz fluorescente de comprimento de onda de 365nm onde se nota a formação de manchas avermelhadas caso haja a presença da enzima em questão, uma vez que, o cromóforo sirohidroclorina presente na mesma reage desta maneira à este tipo de luz (POSTGATE, 1979). Este teste teve o seu resultado confirmado posteriormente pela metodologia citada por Postgate (1979) onde os isolados tem suas células lisadas ao se adicionar o NaOH 2N em tubos de ensaios fechados hermeticamente contendo os mesmos após incubação, neste caso a formação das manchas avermelhadas é confirmada ao se observar os tubos junto a uma lâmpada teste com luz de comprimento de onda de 365nm. Para as duas metodologias utilizaram-se controles negativos.

3.4.3 Caracterização Bioquímica Visando a Identificação de Processos

Por fim, foram realizados outros 2 testes: a presença da enzima catalase e a capacidade dos isolados em realizar a desnitrificação.

Os testes de catalase e desnitrificação foram feitos por meio de metodologias padrão (CLESCERI et al., 1999) utilizando-se, respectivamente, a reação das células com água oxigenada 30V (trinta volumes) e reação dos isolados com soluções de naftiamina e ácido sulfanílico após o seu crescimento em meio de cultura peptonado. Nos testes, foram utilizados controles positivo e negativo, de bactérias de referência pertencentes ao laboratório.

De posse dos resultados destes testes os mesmos foram utilizados, juntamente com os testes bioquímicos de caracterização taxonômica, para a construção de um dendrograma indicando a variabilidade bioquímica entre as bactérias. Este teste permite determinar com maior nível de confiabilidade quais bactérias possuem maior semelhança bioquímica o que facilita a escolha das cepas que devem ser usadas para os experimentos de fisiologia. Os dendrogramas foram confeccionados por meio do programa Minitab 15.1.30.0., da Minitab

3.4.4 Caracterização Taxonômica Presuntiva dos Isolados

Para proceder-se à identificação presuntiva dos isolados após a realização destes testes foram utilizadas três fontes como referência: os trabalhos de Castro et al. (2000); Rabus et al. (2006), e Thauer et al. (2007). A escolha destas referências em questão se deu devido ao fato dos mesmos indicarem características diferentes como forma de identificação dos grupos de BRS, o que torna suas chaves úteis, uma vez sendo complementares. Além disso, Rabus et al. (2006) e Thauer et al. (2007) foram trabalhos publicados em livros conceituados em relação à descrição de características tanto morfológicas quanto bioquímicas dos grupos descritos de bactérias, incluindo as redutoras de sulfato, além disso, se tratam de edições muito recentes e de ampla revisão bibliográfica.

3.4.5 Caracterização Molecular dos Isolados

Primeiramente, os isolados foram inoculados em placas de Petri visando à obtenção de colônias visíveis. Após este passo as colônias foram colhidas das placas com a ajuda de alça bacteriológica e solubilizadas em água própria para a realização da extração de DNA (ultra-pura) segundo protocolo de lise térmica citado por Moore et al. (2004).

Em seguida, os produtos obtidos pela extração de DNA foram amplificados por meio de reação de polimerase em cadeia (PCR) que ocorreram na presença dos primers EpsilonF(5`-GAGASTTGATCMTGGCTCAG-3`) e 1541R(5`-AGGAGGTGATCAGCC- 3`) (EMBLEY, 1991), específicos para amplificação do gene DNAr 16S de microrganismos do domínio Bacteria. As condições de amplificação por reação foram: Tampão de reação (1x), MgCl2 (2,0mM), dNTP (0,8mM), primer 1 (500nM), primer 2

(500nM), BSA (0,2mg/L), Taq polimerase (1,25u/mL). As reações foram incubadas em um termociclador Biocycler modelo MJ96+, e o programa de amplificação consistiu das seguintes etapas: 3 minutos a 94ºC (desnaturação inicial); 30 ciclos de 60 segundos a 94ºC (desnaturação), 1 minuto a 55ºC (anelamento dos primers) e 1 minuto a 72ºC (extensão); 7 minutos a 72º C (extensão final). O resultado das amplificações foram analisadas em gel de

agarose 1% em TAE 1x (Tris, Ácido acético glacial, EDTA) corados com SybrSafe DNA

gel stain (Invitrogen) e visualizados em um transiluminador de luz UV. Várias reações de

amplificação foram feitas até uma única banda de aproximadamente 1500 pb ser visualizada.

Obtendo-se resultado positivo na observação do gel de agarose os produtos de PCR foram purificados utilizando-se o DNA Purification Kit da marca MO BIO, segundo protocolo presente no mesmo e, em seguida, procedeu-se à determinação da concentração de DNA presente nos produtos purificados utilizando-se de análise em gel de agarose e comparação com o Low DNA Mass Ladder (Ladder Massa) da Invitrogen, sendo os mesmos posteriormente enviados para procedimento de seqüenciamento utilizando ambos os primers a fim de se obter uma seqüência de aproximadamente 1.400 pb. A empresa

GENOMIC – Engenharia molecular foi a responsável pelo seqüenciamento sendo as

amostras enviadas segundo as suas especificações.

Após recebimento do resultado, os fragmentos de bases obtidos foram comparados aos previamente depositados no GenBank do National Center for Biotechnology

Information (NCBI), sendo assim determinado o seu nível de similaridade com vários

isolados bacterianos descritos na literatura o que possibilitaria a construção de uma árvore filogenética por meio do programa MEGA versão 4 (TAMURA et al., 2007) indicando a posição taxonômica dos mesmos dentre os vários grupos descritos de BRS.