Quantificação do Consumo de Sulfato e Produção de Sulfeto pelos Isolados

Como dito anteriormente, para a determinação destes dados foram utilizadas curvas padrões de sulfato e sulfeto que podem ser observadas nas FIGURAS 9-1 e 9-2, respectivamente.

Assim, a FIGURA 4-12 mostra os resultados referentes às leituras de sulfato e sulfeto de cada um dos isolados.

-2 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5 4,0 Sulfato Sulfeto Tempo (Dias) S u lfato ( g /L) R102A A 0 100 200 300 400 S u lf eto (m g/L ) -2 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5 4,0 B Sulfato Sulfeto Tempo (Dias) S u lfato ( g /L) R106A 0 100 200 300 400 500 600 S u lf eto (m g/L ) -2 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5 4,0 Sulfato Sulfeto Tempo (Dias) Sulf ato ( g /L) R112A 0 100 200 300 400 500 C Su lfe to ( m g /L) -2 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5 4,0 D Sulfato Sulfeto Tempo (Dias) Sulf ato ( g /L) R304A 0 100 200 300 400 500 Su lfe to ( m g /L) -2 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5 4,0 Sulfato Sulfeto Tempo (Dias) Sulfato (g/L) R307A 0 100 200 300 E Su lf eto (mg/L) -2 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5 4,0 Sulfato Sulfeto Tempo (Dias) Sulfato (g/L) R313A 0 100 200 300 400 F Su lf eto (mg/L)

FIGURA 4-12: Valores das concentrações de sulfato e sulfeto acumulado dos isolados em crescimento

controlado.

Pela visualização da FIGURA 4-12 observa-se que o consumo de sulfato determinado no isolado R304A (FIGURA 4-12 – D) foi mais acentuado em relação às demais amostras, pois nota-se uma diminuição de 58,2% em relação às leituras inicial e final do mesmo; sendo que o isolado R106A (FIGURA 4-12 – B) também conseguiu um alto consumo de sulfato de 56,31% seguido pelos isolados R102A com 53,05% (FIGURA 4-12 – A), R313A com 50,45% (FIGURA 4-12 – F), R112A com 47,9% (FIGURA 4-12 – C) e, por fim, pelo isolado R307A (FIGURA 4-12 – E) com a menor porcentagem de consumo de 43,65%.

A relação sulfato consumido/sulfeto produzido por cada isolado pode ser conferida na TABELA 4-7, a seguir.

TABELA 4-7: Relação entre o consumo de sulfato e a produção de sulfeto pelos isolados.

Isolado Sulfato Consumido (mMol) Sulfeto Produzido (mMol) Relação

R102A 14,7 11,7 0,79 R106A 18,1 15,8 0,87 R112A 15,4 13,5 0,88 R304A 19,6 14 0,71 R307A 14,7 7,5 0,51 R313A 17,7 9,7 0,55

5 DISCUSSÃO

À semelhança do que já foi relatado por outros pesquisadores (CHEUNG e GU, 2003 e WIERINGA et al., 2000), na presente investigação foram isoladas das amostras de sedimento linhagens bacterianas capazes de reduzir sulfato com diferentes perfis metabólicos, como evidenciado nas FIGURAS 4-5 e 4-6, indicando, possivelmente, diferentes espécies. Esta riqueza de grupos taxonômicos em um mesmo nicho indica a provável interação metabólica destas espécies como relatado por Robertson et al. (2000).

A capacidade de reduzir o sulfato das linhagens isoladas indica que as mesmas possuem potencial de uso na bioremediação de resíduos ricos em sulfato o que justifica a continuação do seu estudo que é de grande valia pela abrangência em questões ambientais tal como indicado por Huisman et al. (2006); Azabou et al. (2005); Cheung e Gu (2003); Tebo e Obraztsova (1998), e Webb et al. (1998). Ainda sobre esta questão, os resultados obtidos no presente trabalho referentes à utilização de diversos compostos como fontes de carbono pelos isolados, a redução de sulfato na presença de tais compostos pelos mesmos, assim como a sua capacidade de crescimento em diferentes pH’s, indicam que os isolados podem ser usados nos mais diferentes tipos de resíduos, uma vez que, suas exigências nutricionais e ambientais são muito variáveis podendo assim eliminar os mais diversos contaminantes conforme evidenciado por Robertson et al. (2000). Além disso, o teste referente à realização de desnitrificação mostrou uma interessante adaptação dos isolados, pois, a desnitrificação é um importante processo realizado por várias bactérias do ambiente sendo que, neste caso, indica outro possível aceptor final de elétrons além do sulfato.

Dentre os resultados dos testes realizados visando à classificação taxonômica dos isolados, destaca-se que a maioria deles produziu gás apenas a partir de glicose ou lactose como única fonte de carbono e nessa condição não ocorreu a redução do sulfato. Isso se deve, provavelmente, a maior complexidade molecular da glicose e lactose em relação aos demais substratos utilizados como fontes de carbono que foram acetato, lactato, etanol, acetona, butirato e propionato facilitando, assim, preferencialmente a via fermentativa em relação às vias usuais para a redução de sulfato. Entretanto, alguns isolados da amostra R1A utilizaram lactose concomitantemente à redução de sulfato significando, assim, a possível utilização de outras vias. Os isolados que apresentaram resultados negativos tanto na redução de sulfato quanto na produção de gás para as diferentes fontes de carbono são, provavelmente, incapazes de usá-las como doadores de elétrons e fonte de carbono. O fato

de nenhum teste ter apresentado a redução de sulfato ligada à produção de gás sugere que nenhum dos isolados é capaz de oxidar completamente o seu substrato à CO2 por meio

desta via. Além dos substratos supracitados, o benzeno também foi testado como única fonte de carbono, porém, nenhum isolado foi capaz de degradá-lo, a saber, pelo não escurecimento do meio, mas isso já poderia ser esperado, considerando que alguns autores demonstraram que a degradação bacteriana do benzeno por uma única espécie é rara, sendo observada apenas pela interação de mais de uma espécie em consórcio conforme mostrado por Robertson et al. (2000).

No presente trabalho, algumas linhagens, a semelhança de outras investigações (WIERINGA et al., 2000), apresentaram atividade de catalase positiva ao se realizar o teste em meio modificado de Postgate C indicando assim possível metabolismo oxidativo, o que pode ser de grande valia em ambientes com nível alto de oxigênio como, por exemplo, as camadas superficiais dos sedimentos. Também, a exemplo de outros trabalhos, a maioria dos isolados foram capazes de realizar desnitrificação (MOURA et al., 1997), mostrando assim a possibilidade de utilizar o nitrato, além do sulfato como aceptor final de elétrons, na respiração anaeróbia. A presença deste tipo de metabolismo indica que estas bactérias são capazes de mudar seu metabolismo, provavelmente, seguindo mudanças ambientais, ou seja, o nitrato pode ser usado como aceptor de elétrons em ambientes onde o sulfato é escasso. Dessa forma os referidos grupos taxonômicos mostram maior poder de adaptação em diferentes nichos ecológicos e chance de participação em muitos ciclos naturais além do ciclo do enxofre (CHEUNG E GU, 2003; LLOYD et al., 2001 e TEBO E OBRAZTSOVA, 1998). A presença da enzima catalase apenas nos isolados da amostra R1A mostra que, assim como a capacidade de esporulação comum das bactérias Gram positivas, este grupo possui outras adaptações ambientais interessantes.

Para confirmação da morfologia e tamanho celular das linhagens isoladas a fim de determinar de maneira mais segura a sua classificação taxonômica procedeu-se a observação destas características em Microscopia Eletrônica de Varredura que oferece maior poder de resolução e, portanto maior detalhamento de estruturas. A referida técnica serviu também para comparar as dimensões celulares dos isolados com maior precisão do que o previamente observado em microscopia ótica, informação esta importante na confirmação da diversidade taxonômica dos isolados (GOLDSTEIN et al., 2003).

Quanto à identificação presuntiva dos isolados, as diversidades metabólicas e morfológicas identificadas nos testes realizados indicaram que os isolados podem pertencer a diferentes linhagens de bactérias. Sendo que os grupos taxonômicos presumidos foram

quatro gêneros, a saber, Desulfotomaculum, Desulfosporosinus, Desulfobulbus e Desulfacinum. Dentre estes, Desulfotomaculum e Desulfosporosinus são alguns dos gêneros mais citados na literatura, o que ocorre possivelmente pela sua ampla distribuição explicada por maior estabilidade no ambiente devido a sua capacidade de esporulação (STACKEBRANDT et al., 1997), além disso, é proposto para estes gêneros uma nova divisão segundo técnicas moleculares (ROBERTSON et al., 2000 e STACKEBRANDT et

al., 1997). A elucidação da taxonomia desses grupos, bem como maior conhecimento de

seus processos metabólicos são fundamentais para o seu adequado manejo e aplicações futuras, conforme preconizado por Cheung e Gu (2003).

Em relação à cinética dos isolados, pôde-se inferir o tempo de geração (Tg) de todos e o isolado R102A apresentou um Tg menor em relação aos demais de 3,08 dias, tendo chegado à valores próximos aos relatados por Silva (1999) de 2,47 dias. Os demais isolados, no entanto tiveram tempos maiores em torno de 8 dias, sendo bem próximos aos relatados por Galushko et al. (1999) de 7 dias, indicando assim que o isolado R102A possui um crescimento mais acelerado o que também é evidenciado pelo seu decaimento mais rápido quando observada a sua curva de crescimento (FIGURA 4-11 A).

Considerando as curvas de consumo de sulfato e produção de sulfeto, deve-se salientar o fato de que, em todos os isolados incubados, a última leitura apresentou um pico para as duas leituras (FIGURA 4-12). Este fato ocorreu porque, como as leituras das amostras se apresentaram sem grandes modificações após um curto período de tempo, ou seja, tanto o consumo de sulfato quanto a produção de sulfeto não apresentavam modificações, tendendo assim a uma estabilidade, optou-se por adicionar mais lactato ao meio para determinar se a fonte de energia das bactérias havia se esgotado. Isto foi feito após a oitava leitura em todos os enriquecimentos e, como após este procedimento as leituras voltaram a apresentar resultados positivos para o consumo de sulfato e produção de sulfeto, pode-se afirmar que as análises não apresentavam variação de sulfato e sulfeto devido ao fato das bactérias não possuírem uma fonte de carbono e doadores de elétrons para suas biossínteses bloqueando assim o seu metabolismo.

Assim, levando-se em consideração que a quantidade de lactato de sódio presente no meio no início do experimento era de 8g/L e que a de sulfato era em média de 3,27g/L, a média da concentração de sulfato presente no meio quando as bactérias pararam a sua biossíntese indica quanto do mesmo foi utilizado em função do lactato de sódio disponível. Como a concentração de sulfato média dos meios neste período estacionário foi de 2,60g/L, pode-se inferir que em cada litro de meio de cultivo as bactérias utilizaram 8g de

lactato de sódio para reduzir 0,67g de sulfato a sulfeto, ou seja, 70mM de lactato foi utilizado na redução de 7mM de sulfato. O único resultado que foi discrepante ocorreu no isolado R106A onde a cultura atingiu estabilidade quando a concentração de sulfato no meio chegou em média à 1,86g/L, mas como a concentração de lactato de sódio no meio era a mesma, pode-se inferir que este isolado utiliza, para cada litro de meio, a mesma quantidade de lactato que os outros para consumir uma maior quantia de sulfato, ou seja, para cada 8g de lactato de sódio utilizados há um consumo de 1,41g de sulfato, o que em mols seria 70mM de lactato utilizado para cada 15mM de sulfato consumido. Assim, o isolado R106A se mostrou com melhor relação entre o substrato consumido e o sulfato utilizado.

Tais dados não são correspondentes ao indicado na TABELA 2-1, derivada do trabalho de Liamleam e Annachhatre (2007), que relata a utilização de 2M de lactato para o consumo de 1M de sulfato pelas BRS, o que pode indicar que os isolados possivelmente consomem o lactato seguindo outro tipo de reação estequiométrica. Ainda em relação aos dados da TABELA 2-1, pode-se notar que o formiato apresenta o menor rendimento de redução de sulfato em função da quantidade de substrato consumido, tendo o butirato, em contrapartida, demonstrado a melhor relação, assim, mesmo que o lactato tenha sido escolhido para o teste, por ser de fácil obtenção, deve-se observar que não apenas este fator, mas também o preço e rendimento do substrato devem ser levados em conta para a realização do experimento.

Em se tratando da relação consumo de sulfato/produção de sulfeto pelos isolados pôde-se observar que nenhum deles demonstrou a relação citada por Postgate (1979) que relata o consumo de 1M de sulfato para cada 1M de sulfeto produzido. No entanto os isolados R106A e R112A se aproximaram muito desta relação (TABELA 4-7), sendo que os isolados R102A e R304A também obtiveram valores relativamente próximos. Os resultados mais discrepantes em relação à literatura citada foram encontrados nos isolados R307A e R313A, que apresentaram o consumo de praticamente 2M de sulfato para cada 1M de sulfeto produzido. Tal fato pode ter ocorrido pelos seguintes motivos:

• O sulfeto produzido pode ter se desprendido de forma mais ativa para o headspace dos frascos, fazendo assim com que a análise do sulfeto dissolvido não demonstrasse a totalidade do sulfeto presente no sistema já que análises da atmosfera dos frascos não foram realizadas;

• Os isolados podem ter usado o sulfeto para biossínteses ou mesmo armazená-lo em forma de outros óxidos de enxofre que, por sua vez, não seriam detectados pelas técnicas empregadas para o sulfeto e sulfato.

No entanto, levando em consideração a produção de sulfeto como uma característica importante para que as BRS participem de processos de imobilização de metais, os isolados R106A e R112A seriam os mais indicados por apresentarem uma produção de sulfeto mais eficiente em relação ao sulfato consumido.

Os testes de identificação molecular dos isolados revelaram considerável proximidade dos mesmos com vários grupos de bactérias tanto cultiváveis quanto não- cultiváveis (QUADRO 4-10), porém, os mesmos não corresponderam aos grupos usualmente identificados como redutores de sulfato, uma vez que nota-se uma grande proximidade com alguns grupos de bactérias da família Enterobacteriaceae, como

Enterobacter e Pantoea.

Embora não haja muitos estudos em relação à redução de sulfato por membros da família Enterobacteriaceae, sabe-se que representantes desta família já foram identificados como capazes de realizar o metabolismo de redução de sulfato (QIU et al., 2008 e SAHRANI et al., 2008), e como o grupo das BRS é polifilético, fazendo parte do mesmo representantes de diferentes famílias do domínio Bacteria; além de algumas do domínio

Archaea (FIGURA 2-1) é possível que representantes ainda não catalogados de grupos

distintos também possuam a capacidade metabólica de reduzir o sulfato à sulfeto.

É valido acrescentar que, devido ao metabolismo de grande parte dos representantes da família Enterobacteriaceae ser anaeróbio facultativo, os enriquecimentos utilizados no trabalho não seriam capazes excluí-los, contanto que fossem capazes de realizar o metabolismo de redução de sulfato. Além disso, representantes do gênero Enterobacter, já foram relatados como capazes de utilizar o lactato como fonte de carbono, ou mesmo o citrato (GRIMONT e GRIMONT, 2006), que estavam entre os testes de caracterização bioquímica realizados. Outra questão importante é a taxonomia deste gênero que é considerada como altamente heterogênea ao se considerar outros representantes da família Enterobacteriaceae (GRIMONT e GRIMONT, 2006) sendo inclusive as espécies do gênero Pantoea, outro identificado como de grande proximidade com os isolados e que possui várias espécies endofíticas, até pouco tempo identificadas como pertencentes ao gênero Enterobacter (JANDA, 2006).

Já em relação aos isolados R106A e R112A, que mesmo sendo identificados como bactérias Gram positivas, foram também classificados como similares às espécies da família Enterobacteriaceae pela análise molecular, deve-se observar que no mesmo experimento também foram observadas semelhanças entre eles e isolados não cultiváveis registrados em outros trabalhos com amostras ambientais (QUADRO 4-10), assim há a possibilidade destes isolados pertencerem a grupos ainda não descritos de BRS, ou mesmo serem representantes cultiváveis destes grupos já identificados, devendo ser realizados estudos mais aprofundados para esclarecer tais dúvidas.

É importante observar que, mesmo os isolados não sendo identificados como pertencentes a grupos já descritos de BRS, diferentemente do indicado pelos testes bioquímicos, os mesmos apresentaram visível capacidade de redução de sulfato, evidenciada principalmente nos testes de cinética, sendo capazes de consumir sulfato e precipitar metais na forma de sulfetos; características que, somadas a sua diversidade metabólica e capacidade de precipitar metais em diferentes pHs, os capacitam como de possível uso em processos ambientais de biorremediação e imobilização de metais.

6 CONCLUSÕES

O trabalho executado conduziu às seguintes conclusões:

1. O isolamento de culturas puras de bactérias com capacidade de reduzir sulfato produzindo sulfeto foi bem sucedida, demonstrando que a metodologia utilizada foi apropriada para as amostras de sedimento coletadas;

2. As metodologias realizadas visando à comprovação da presença de metabolismo de redução de nitrato, assim como a presença de catalase, se mostraram muito eficientes, e comprovaram que os isolados são capazes de se adaptar a certas condições adversas do ambiente, sendo capazes de utilizar outros compostos como aceptores de elétrons e resistir a certos níveis de oxigenação do meio;

3. Os testes metabólicos e morfológicos realizados mostraram considerável diversidade de entre os isolados possibilitando indicar possíveis gêneros de alguns isolados baseado nas características de grupos conhecidos de bactérias com capacidade de redução de sulfato, tais como Desulfotomaculum, Desulfosporosinus, Desulfobulbus e Desulfacinum;

4. A variedade de substratos utilizáveis como também de vias metabólicas possíveis pelas linhagens isoladas demonstram uma grande gama de possíveis ambientes onde estas bactérias podem viver e os tipos de compostos que podem utilizar, podendo ser úteis em processos de biorremediação;

5. O procedimento para escolha dos isolados bacterianos, os quais seriam utilizados nos testes de cinética, proporcionou uma visão das capacidades de redução de sulfato e crescimento em diferentes condições de pH do ambiente;

6. O experimento visando determinar o tempo de geração dos isolados, possibilitou inferir a velocidade de crescimento dos mesmos;

7. Os experimentos para determinação da produção de sulfeto e concomitante consumo de sulfato se mostraram eficientes para os isolados pesquisados, já que se pode acompanhar as variações de concentração destes dois compostos durante todo o tempo de incubação;

8. Os isolados R106A e R112A apresentaram melhor relação entre as taxas de consumo de sulfato e produção de sulfeto o que pode torná-los de grande valia para processos de biorremediação e imobilização de metais;

9. Mesmo não apresentando correspondência dos isolados aos grupos usualmente identificados como redutores de sulfato, as técnicas moleculares utilizadas foram capazes de indicar a proximidade taxonômica dos mesmos com outros grupos já descritos.

7 PERSPECTIVAS

Considerando a potencial aplicabilidade dos grupos isolados no presente trabalho considera-se relevante o seu prosseguimento quanto à melhor elucidação da sua taxonomia pela utilização de técnicas de biologia molecular para futura criação de uma biblioteca gênica para melhor estudar os processos envolvidos no metabolismo da redução do sulfato. Além disso, tendo sido elucidados alguns aspectos de sua fisiologia, utilizá-los em testes de biorremediação e imobilização de metais em condições práticas como biorreatores ou barragens de contenção podem ser de grande valia para questões ambientais.

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