Caracterização dos polimorfismos +46A>G e +79C>G no gene ADRB2R

Os receptores β2 (β2-AR) são largamente distribuídos no trato respiratório, particularmente no músculo liso das vias respiratórias (Thakkinstian et al., 2005).

Os β2-AR são membros de uma família de sete receptores transmembrana, com domínios extensos, sendo 3 extracelulares e 3 intracelulares, uma cauda amino terminal extracelular e uma intracelular carboxiterminal, acoplado à proteína G, codificados pelo gene localizado na região 5q31.32 (Muthumala et al., 2008; NCBI, 2011). Os β2-AR são compostos por 413 resíduos de aminoácidos, de aproximadamente 46.500 Da (Figura 12) (Rasmussen et al., 2007).

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Figura 12. Estrutura cristalográfica do receptor β2-adrenérgico. A bicamada de fosfolipídios representada como esferas azuis

(grupos fosfato cabeça) e linhas amarelas (cadeias laterais de lipídios). Cherezov V, Rosenbaum DM, Hanson MA, Rasmussen SG, Thian FS, Kobilka TS, et al. High-resolution crystal structure of an engineered human β2-adrenergic G protein-coupled receptor. Science 2007; 318 (5854): 1258–65. Rosenbaum DM, Cherezov V, Hanson MA, Rasmussen SG, Thian FS, Kobilka TS,

et al. GPCR engineering yields high-resolution structural insights into β2-adrenergic receptor function. Science 2007; 318 (5854):

1266–73.

Depois da ativação da proteína, ocorre relaxamento do músculo liso pulmonar, que pode ser causado por agonistas β2-AR (Nishikawa et al., 1996).

O β2-AR presente na superfície celular das vias aeríferas superiores, mecanismo via proteína G acoplada à membrana, quando exposto aos β-agonistas, ativa a AMPc, que cataliza a ativação da proteína quinase A (PKA), que é responsável pela regulação da fosforilação das proteínas envolvidas no controle do tônus muscular. O AMPc também resulta na inibição da

Meio extracelular

liberação do Ca2+, redução na entrada de Ca2+ pela membrana e sequestro intracelular de Ca2+, levando ao relaxamento da musculatura lisa pulmonar (Johnson e Coleman, 1995).

De acordo com Cruz (2005), os β-agonistas desempenham muitas ações que podem afetar as funções das vias aeríferas, sendo: relaxamento da musculatura lisa, inibição da liberação de mediadores das células inflamatórias, inibição da neurotransmissão colinérgica, redução da permeabilidade vascular e aumento do “clareance” mucociliar (efeito, provavelmente, resultante do aumento da frequência dos batimentos ciliares, bem como, do aumento da produção do citosol).

Nove substituições de base foram identificadas na região codificadora do gene

ADRB2R, sendo 5 neutras. Os dois polimorfismos mais frequentes são: ArgGly16 (46 AG) e

GlnGlu27 (79CG), que estão próximas ao sítio ligante do receptor, enquanto que os polimorfismos ThrIle (491CT) e ValMet34 (100GA) são raros (Fenech e Hall, 2002).

O polimorfismo GlnGlu27(79CG) confere resistência a desensibilização e regulação. O alelo Glu 27 é protetor contra a asma, reduzindo o risco desta em 27% (Thakkinstian et al., 2005). Enquanto a desensibilização é um mecanismo de proteção não muito conhecido, a Glu27 induz alteração na regulação do receptor, que parece ocorrer devido à susceptibilidade aumentada do receptor a degradação da proteína. Haplótipos que incluem Gln27 têm, em geral, resposta pobre aos agonistas B2AR e níveis baixos de expressão. Presumivelmente, a boa resposta a agonistas exógenos reflete boa resposta à agonistas endógenos e, um efeito protetor contra asma, e possivelmente a outras doenças broncoconstritoras (Drysdale

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Gly16 predominam sobre os da Glu27. Esses receptores se submetem a regulação maior promovida por agonistas, que o alelo normal do B2AR (Thakkinstian et al., 2005).

Mais que 80% dos pacientes com FC recebem broncodiladores no regime do tratamento, o que estimula a broncodilatação e o “clearance” do muco, contudo nem todos os pacientes apresentam boa resposta ao tratamento. Adicionalmente, a proteína B2AR, influência nos índices nutricionais e a avaliação clínica indiretamente, associando-se as manifestações pulmonares.

Somente um estudo na literatura associa a FC com os polimorfismos anteriormente descritos. Nesse estudo, a variação percentual do VEF1 não diferiu significativamente entre os grupos genotípicos na posição 46 para a análise univariada (p: 0,21) ou após o ajuste para o valor predito do VEF1 (p: 0,17). Após os ajustes para o valor predito no VEF1 e o status para a colonização pela P. aeruginosa, houve diferença nos valores de mudança no FEF25-75% entre os diferentes grupos genotípicos analisados (4,9%, 18,0%, e 22,4% para os genótipos AA, AG e GG, respectivamente; p: 0,0488). Depois do ajuste para o percentual de VEF1 basal previsto, o códon 27 diferiu significativamente em relação à porcentagem na mudança do VEF1 (4,1%, 8,1% e 9,3% para os genótipos CC, CG e GG, respectivamente, p: 0,0445) (Hart et al., 2005). Ajustando-se para comparações múltiplas com valor de P <0,05; a variação percentual média do VEF1 para o grupo CC foi significativamente menor quando comparado ao grupo GG. Assim, foi observado que diferenças no grau da responsividade medicamentosa das vias aeríferas ao broncodilatador podem estar associadas ao genótipo do gene ADRB2R em um coorte de indivíduos com FC. E ficou claro que mais estudos são necessários para determinar a relevância clínica em longo prazo dos polimorfismos no gene ADRB2R em pacientes com FC (Hart et al., 2005).

2. Objetivo

2.1. Objetivo geral

Genotipagem de polimorfismos nos genes candidatos a modificadores em pacientes com a FC com finalidade de verificar associação, dos polimorfismos e das mutações no gene CFTR, com diferentes marcadores clínicos de gravidade da doença.

2.2. Objetivos específicos

Determinar a frequência dos polimorfismos nos genes ACE, ADRB2R, GCLC, GST e NOS-1 em pacientes com FC;

Determinar a frequência das mutações no gene CFTR realizadas como triagem de rotina dos pacientes e sequenciamento dos éxons do gene CFTR;

Verificar se existe associação entre os achados moleculares (para os polimorfismos e gene CFTR) com marcadores de gravidade clínica e laboratorial [Escore de Shwachman (ES), escore de Bhalla (EB), escore de Kanga (EK), Índice de Massa Corpórea – IMC (ajustado de acordo com a curva de crescimento), idade, idade ao diagnóstico, primeiros sintomas (pulmonar e digestivo)];

Verificar se existe associação entre os achados moleculares (para os polimorfismos e gene CFTR) e marcadores da condição pulmonar [microrganismos isolados (P.

aeruginosa mucóide e não mucóide, S. aureus, B. cepacia e Achromobacter xylosoxidans), tempo até o primeiro isolamento da P. aeruginosa e dados de

espirometria – CVF(%) (capacidade vital forçada), VEF1(%), VEF1/CVF% (razão

entre volume expiratório forçado no primeiro segundo e capacidade vital forçada) e FEF25-75% (fluxo expiratório forçado entre 25 a 75% da CVF)];

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Verificar a resposta broncodilatadora na prova de função pulmonar dos pacientes em associação aos polimorfismos no gene ADBR2R;

Verificar novas possibilidades terapêuticas e de manejo ambulatorial de acordo com as possíveis associações encontradas dos polimorfismos e com o gene CFTR com as variáveis clínicas utilizadas como marcadores de gravidade.

3. Casuística e Métodos

Os pacientes incluídos na pesquisa assinaram o termo de consentimento livre e esclarecido, ou, quando menor de idade, tiveram o termo assinado pelos responsáveis

(Anexo 1).

O projeto teve aprovação do comitê de ética em pesquisa da FCM/UNICAMP, segundo o protocolo de deliberação N° 528/2008 (Anexo 2).

3.1. Caracterização da amostra- Casuística

Foram incluídos na pesquisa 215 pacientes com FC que estão em acompanhamento no Ambulatório de Pediatria do Hospital de Clínicas (HC) da UNICAMP, que é responsável pelo atendimento de pacientes de Campinas e região, sendo Ambulatório referência para o tratamento da FC. O critério de inclusão foi o resultado alterado em pelo menos dois testes de cloro no suor, ou seja, com valores de cloro iguais ou superiores a 60 mEq/L no exame e/ou a identificação de duas mutações no gene CFTR (sendo as mutações mais estudas - delF508, G542X, G551D, R553X, R1162X e N1303K).

Dos pacientes inicialmente incluídos, 181 tiveram a genotipagem realizada e a estatística descritiva determinada. O levantamento dos dados clínicos e laboratoriais, a análise dos polimorfismos gênicos e estatística comparativa foram realizados em 180 pacientes, que foram distribuídos de acordo com o genótipo para as mutações no gene

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Figura 13. Representação esquemática da seleção de pacientes incluídos na pesquisa. Em (azul) pacientes selecionados

inicialmente e após a análise parcial de prontuários e rotina ambulatorial. Em (vermelho) pacientes excluídos da pesquisa

(em número absoluto) e motivo da exclusão. Em (verde) pacientes incluídos para a análise estatística do projeto. Em

(roxo) perda amostral total. Observar que o valor é inferior a 25%, valor este denotado como perda amostral máxima para a realização de pesquisa que envolva cálculo estatístico amostral.

Na análise de gravidade clínica relacionada aos genes modificadores não se faz necessário a presença de grupo de indivíduos controles saudáveis, já que, a comparação clínica se baseia na relação entre os diferentes genótipos para os polimorfismos analisados.

215 pacientes

com FC

3 sem DNA

4 ausência de

acompanhamento

ambulatorial

5 diagnóstico

a ser

confirmado

22 sem dados

clínicos

181 pacientes

genotipados

1 pacientes

recém nascido

180 pacientes

selecionados

para as análises

estatísticas

15,81 % de

perda amostral

3.2. Local do estudo e tipo de estudo

O trabalho foi realizado na FCM/UNICAMP no período compreendido entre 2010 e 2011. A genotipagem dos polimorfismos e a triagem de mutações no gene CFTR foram realizadas no Laboratório de Genética Médica sob supervisão da Drª Carmen Silvia Bertuzzo e Drª Luciana Cardoso Bonadia.

Os dados clínicos foram obtidos no Ambulatório de FC por entrevista com pacientes e responsáveis e pela análise dos prontuários dos pacientes do HC sob supervisão do Drº Antônio Fernando Ribeiro e do Dr° José Dirceu Ribeiro.

Os dados de espirometria foram coletados no laboratório de Fisiologia Pulmonar do Centro de Investigação em Pediatria/CIPED com auxílio do Dr° José Dirceu Ribeiro e da Dra Maria Ângela G. O. Ribeiro.

O resultado da cultura de rotina diagnóstica (CRD) foi obtido no Laboratório de Patologia Clínica sob supervisão do Dro Carlos Emilio Levy.

Foi realizado um estudo do tipo transversal.