PCR para a análise dos polimorfismos nos genes candidatos a modificadores

A análise dos polimorfismos nos genes modificadores foi realizada tendo como base a técnica da PCR. Os procedimentos utilizados em cada reação, incluindo o volume dos reagentes e os programas de amplificação estão descritos na tabela 6 e os “primers” utilizados para cada polimorfismo incluído na pesquisa na tabela 7.

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O polimorfismo no gene ACE é denotado como D/I, e deve-se realizar duas reações de PCR para a identificação do genótipo, devido à amplificação preferencial do alelo D (“deleção”), sendo que na primeira reação temos a amplificação de 319 e 597 pb quando ocorre heterozigoze. O alelo de 319 pb tem amplificação preferencial e corresponde ao alelo com a deleção.

Para evitar erros espúrios nas análises, pacientes que tiveram o genótipo como D/D na primeira reação de PCR, tiveram uma segunda reação realizada. Na segunda reação de PCR, ocorre a amplificação de 335 pb, caso o paciente seja na verdade um heterozigoto mascarado pela amplificação preferencial do alelo D.

Para evitar que erros ocorressem na segunda reação se utilizou de amostras sabidamente com o genótipo I/D e I/I como controles positivos (Figura 14 e 15). A amplificação preferencial do alelo D pode ser evidenciada na figura 14 através da intensidade de coloração das bandas do DNA no gel de agarose 1,5 %.

Para os genes GSTM1 e GSTT1, foi realizada uma reação de PCR multiplex juntamente ao gene CYP1A1, que serve como controle interno de amplificação.

Por se tratar de um polimorfismo de deleção de fragmento a ausência do amplificado corresponde à deleção do gene, porém essa deleção só pode ser observada quando em homozigoze. Dessa forma, indivíduos que apresentam banda de amplificado no gel podem ser homozigotos ou heterozigotos para a não deleção. A resposta clínica é independente do número de alelos expressos.

Os fragmentos que devem ser observados quando não ocorre à deleção são: 215, 312 e 480 pb, correspondentes aos genes GSTM1, CYP1A1 e GSTT1, respectivamente (Figura

16). Para a realização correta da técnica foi utilizada temperatura de anelamento do menor

conjunto de “primers” dentre os polimorfismo, já que cada conjunto de “primers” apresenta temperatura ótima de amplificação diferente.

E, finalmente, para os polimorfismos de repetição de bases em tandem (microssatélites) no gene NOS-1, a reação de PCR realizada com os primers marcados com fluorescência FAM foi misturada a uma solução de corrida contendo marcador de peso molecular marcado com fluorescência distinta (ET-550 GE Healthcare®) e a mistura submetida à eletroforese de capilar no equipamento MegaBace 1000® , onde os tamanhos dos fragmentos foram estimados de acordo com a comparação com o marcador (Figura

17, 18 e 19).

Também, com o intuito de verificar a autenticidade/confiabilidade dos dados obtidos, uma amostra homizogota para todos os polimorfismos foi sequenciada. O dado obtido foi utilizado para estipular os valores reais nos números de repetição dos fragmentos através de comparação realizada pelo “software fragment profiler” distribuído gratuitamente com o sequenciador MegaBAce 1000® (GE Healthcare Life Sciences).

Para os demais polimorfismos nos genes GSTP1 (Figura 20) e GCLC (Figura 21), realizou-se a digestão com enzima de restrição, posteriormente descrita.

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Tabela 6. Reação de PCR e programa de amplificação gênica utilizado para a amplificação de cada gene modificador

incluído na pesquisa.

Gene ACE GCLC GST NOS-1

Polimorfismos D/I1 D/I1, 2 129

3,4 CT 3504 AG M1 5 T15 P1 6 313AG GT (1 e 2)** 10 AAT**7, 8, 9, 10 Reagentes DNA (ng) 100 100 100 50 100 100 Tampão de PCR*(µL) 2,5 2,5 5 5 2 1 MgCl2 (mM) 1,3 1,3 1,5 1,5 1,5 1,5 dNTP (M cada base) 200 200 200 200 200 200 “Primers” (M cada) 1 1 1,6 3 2 1

Taq polimerase (U) 0,35 0,35 1 2 1 1,5

Volume final (µL) 25 25 50 50 25 10 Programas Desnaturação inicial 94ºC/7´ 94ºC/7´ 94ºC/5´ 94ºC/5´ 94ºC/5´ 94ºC/6´ Desnaturação 94ºC/30´´ 94ºC/30´´ 94ºC/30´´ 94ºC/2´ 94ºC/30´´ 94ºC/1´ Anelamento 56ºC/45´´ 67ºC/45´´ 56ºC/45´´ 59ºC/1´ 55ºC/30´´ 59ºC/1´ Extensão 72ºC/2´ 72ºC/2´ 72ºC/2´ 72ºC/1´ 72ºC/30´´ 72ºC/1´ Extensão final 72ºC/7´ 72ºC/7´ 72ºC/7´ 72ºC/10´ 72ºC/5´ 72ºC/5´ Nº Ciclos 35 35 35 35 30 35

Legenda: *Tampão para PCR: 10mmol/L de Tris/HCl, pH 8,3; 50 mmol/L de KCl. ** polimorfismos AAT, TG (1 e 2) analisados através de genotipagem no sequenciador

MegaBace. 1. Lindpaintner et al., 1995; 2. Arkwright et al., 2003; 3. Liu et al., 2007; 4. Koide et al., 2003; 5. Abdel-Rahman et al., 1996; 6. Harries et al, 1997; 7. Grasemann et

al., 2002; 8. Grasemann et al., 1999; 9. Grasemann et al., 2000; 10. Texereau et al., 2004. DNA - ácido desoxirribonucléico, ng – nanogramas, µL – microlitros, MgCl2 –

Tabela 7. Sequências de DNA iniciadoras utilizadas nas reações de amplificação gênica e fragmentos

resultantes da PCR para cada polimorfismo analisado.

Gene Polimorfismo “Primer” Sequência (5´  3`) Amplificado

(pb)

ACE1 D/I Direto GCCCTGCAGGTGTCTGCAGCATGT 319 e 597

Reverso GGATGGCTCTCCCCGCCTTGTCTC ACE*1,2 D/I Direto TGGGACCACAGCGCCCGCCACTAC 335 Reverso TCGCCAGCCCTCCCATGCCCATAA GCLC 129 C T3, 4 Direto TCGTCCCAAGTCTCACAGTC 613 Reverso CGCCCTCCCCGCTGCTCCTC

350 A G4 Direto AAGTCCCAGGAAGAATCACA 874

Reverso CGCTCTCCAGGAACCCATCT GSTM15 Deleção Direto GAACTCCCTGAAAAGCTAAAGC 215 Reverso GTTGGGCTCAAATATACGGTGG GSTT15 Deleção Direto TTCCTTACTGGTCCTCACATCTC 480 Reverso TCACCGGATCATGGCCAGCA

CYP1A15 Controle Direto GAACTGCCACTTCAGCTGTCT 312 Reverso CAGCTGCATTTGGAAGTGCTC

GSTP16 313 A  G

Direto ACC CCA GGG CTC TAT GGG AA

176 Reverso TGAGGGCACAAGAAGCCCCT NOS-17, 8, 9, 10 AAT Direto CTGGGGGCAATGGTGTGT 413** Reverso FAM – GAGTAAAATTAAGGGTCAGC

GT (região 1) Direto TGCAGGAACTAGGCACAAGC 176** Reverso FAM - GATCGACACACTTGTGCAGG

GT (região 2)

Direto CCTGCGTGGCTACTACATTC

220** Reverso FAM – TGGGTGTGGGGAGGGAGAC

Legenda: * “Primers” específicos para região contendo a deleção, tendo como finalidade distinguir indivíduos com o

genótipo D/I do D/D. **Amplificado mais freqüente. 1. Lindpaintner et al., 1995; 2. Arkwright et al., 2003; 3. Liu et al., 2007; 4. Koide et al., 2003; 5. Abdel-Rahman et al., 1996; 6. Harries et al, 1997; 7. Grasemann et al., 2002; 8. Grasemann et al., 1999; 9. Grasemann et al., 2000; 10. Texereau et al., 2004. pb – pares de base.

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Figura 14. Gel de agarose a 1,5% para a identificação do polimorfismo D/I do gene ACE, sendo o alelo D caracterizado

pela deleção de 278pb. 1 e 2 - genótipo D/D (apenas 319 pb); 3 e 4 - genótipo D/I (597 e 319 pb); 5 e 6 - genótipo I/I (apenas 597 pb). Observar a menor intensidade das bandas do alelo I nas amostras denotadas como 3 e 4, onde ocorre a amplificação preferencial desse alelo em comparação ao alelo D. Na última coluna temos o marcador de peso molecular com 100pb.

Figura 15. Gel de agarose a 1,5% para a possível identificação do alelo I quando ocorre a presença do genótipo D/D na

primeira análise. 1 - controle homozigoto I/I; 2 - controle heterozigoto (D/I); 3 - paciente portador de genótipo D/D na primeira análise; 4 - controle negativo de amplificação . O alelo I na segunda reação de PCR é identificado pela presença de um fragmento com 335 pb de extensão. Na última coluna temos o marcador de peso molecular com 100pb.

Figura 16. Gel de agarose 1,5% para a identificação do polimorfismo de deleção de fragmento nos genes GSTM1 e

GSTT1 através da técnica de PCR múltiplex. O fragmento de 215 pb representa o gene GSTM1, 312 pb representa o gene CYP1A1 (controle interno de amplificação) e 480 pb representa o gene GSTT1. 1 - alelos nulos em homozigoze para GSTM1 e T1; 2, 3 e 4 - GSTM1 e T1 com pelo menos um alelo codificante; 5 e 6 - apenas GSTT1 com alelo codificante; 7

- apenas GSTM1 com alelo codificante. Na última coluna temos o marcador de peso molecular com 100pb.

Figura 17. Espectro padrão para o polimorfismo de repetição em tandem GT-1 no gene NOS-1. Em A, temos

eletroesferograma representando um pico com 190 pb, correspondente ao fragmento com 24 repetições GT em homozigoze. Em B, eletroesferograma representando picos de 170 e 174 pb, correspondentes aos fragmentos de 14 e 16 repetições GT, respectivamente.

A

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Figura 18. Espectro padrão para o polimorfismo de repetição em tandem GT-2 no gene NOS-1. Em A, temos

eletroesferograma representando dois picos com 210 e 218 pb, correspondente ao fragmentos com 25 e 29 repetições GT em homozigoze. Em B, eletroesferograma representando fragmentos de 200 e 210 pb, correspondentes a 20 e 25 repetições GT, respectivamente.

Figura 19. Espectro padrão para o polimorfismo de repetição em tandem AAT no gene NOS-1. Em A, temos

eletroesferograma representando dois picos com 399 e 408 pb, correspondente ao fragmento com 10 e 13 repetições AAT respectivamente. Em B, eletroesferograma representando fragmento de 399 pb, correspondentes ao fragmentos com 10 repetições AAT.

A

B A

3.7.2. Digestão Enzimática

Para os polimorfismos do tipo SNPs (GCLC 129C>T, GCLC 350A>G e GSTP1 313A>G) foi realizada a digestão enzimática do amplificado com enzima de restrição. Para cada polimorfismo foi utilizado um protocolo diferente de acordo com o fabricante (New

Englands BioLabs® Inc). Os procedimentos utilizados, as enzimas selecionadas e os diferentes fragmentos obtidos a partir da digestão enzimática estão listados na tabela 8.

A digestão foi realizada em banho úmido digital com intuito de ter maior controle da temperatura da digestão.

Os fragmentos obtidos na digestão foram aplicados em gel de poliacrilamida 12% e visualizados pela coloração com brometo de etídeo. O gel de acrilamida foi utilizado por permitir acuracidade maior nas análises, e pelo tamanho reduzido dos fragmentos após a digestão enzimática.

As figuras 20 e 21 mostram os fragmentos obtidos após as digestões para os diferentes polimorfismos do tipo SNP analisados na pesquisa.

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Tabela 8. Descrição da digestão enzimática dos fragmentos contendo os polimorfismos do

tipo SNP incluídos na pesquisa.

Gene Polimorfismo Genótipo

Enzima de restrição Unidades utilizadas Temperatura ótima para a digestão (ºC) Fragmentos (pb) GCLC 129 C  T4 C/C Tsp45I 5 65 500 e 113 C/T 500, 332, 198 e 113 T/T 332, 198 e 113 350 A G3, 4 A/A NlaIII 5 37 722, 104 e 48 A/G 722, 513, 209, 104 e 48 G/G 513, 209, 104 e 48 GSTP1 313 A  G6 A/A Alw261 5 55 176 A/G 176, 91 e 85 G/G 91 e 85

Figura 20. A. Gel de agarose a 1,5% para a identificação do fragmento de 176 pb do gene GSTP1 contendo o

polimorfismo 313A/G. Na última coluna temos o marcador de peso molecular com 100pb. B. Gel de acrilamida a 12% contendo o resultado da digestão da PCR do gene GSTP1 com a enzima Alw261. 1, 2 e 3 - fragmento de 176 pb, genótipo A/A; 4, 5 e 6 - fragmentos de 176, 91 e 85 pb, genótipo A/G; 7, 8 e 9 - fragmentos de 91 e 85pb, genótipo G/G. Na última coluna temos o marcador de peso molecular com 100pb.

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Figura 21. A. Gel de agarose a 1,5% para a identificação do fragmento de 613 pb do gene GCLC contendo o polimorfismo -129C/T. Na última coluna temos o marcador de peso molecular com 100pb. B. Gel de agarose a 1,5% para a identificação do fragmento de 874 pb do gene GCLC contendo o polimorfismo -350A/G. Na última coluna temos o marcador de peso molecular com 100pb. C. Gel de acrilamida a 12% contendo o resultado da digestão da PCR do gene

GCLC (polimorfismo -129C/T) com a enzima Tsp45I. 1 e 2 - fragmentos de 500 e 113 pb (sítio invariante), genótipo C/C;

3 e 4 - fragmentos de 500, 332, 198 e 113 pb, genótipo C/T; 5 e 6 - fragmentos de 332, 198 e 11 3 pb, genótipo T/T. Na primeira coluna temos o marcador de peso molecular com 100pb. D. Gel de acrilamida a 12% contendo o resultado da digestão da PCR do gene GCLC (polimorfismo -350A/G) com a enzima NlaIII. 1 e 2 - fragmentos de 722, 104 e 48 pb (sítios invariantes), genótipo A/A; 3 e 4 - fragmentos de 722, 513, 209, 104 e 48 pb, genótipo A/G; 5 e 6 - fragmentos de 513, 209, 104 e 48 pb, genótipo G/G. Na primira coluna temos o marcador de peso molecular com 100pb.