A disponibilidade e facilidade de utilização de técnicas de biologia molecular possibilitaram a aplicação destas metodologias na descoberta e aperfeiçoamento de
marcadores moleculares como os baseados nos fragmentos de restrição enzimática do DNA (Restriction Fragment Length Polymorphisms – RFLP) e os obtidos pela técnica PCR como os Random Amplified Polymorphic DNA (RAPD), Amplified Fragment Length Polymorphisms (AFLPs) e microssatélites ou Simple Sequence Repeats (SSR) na caracterização das espécies.
2.8.1. Restriction Fragment Length Polymorphisms (RFLP)
A técnica RFLP baseia-se na utilização de enzimas de restrição, as quais cortam o DNA em sequências muito precisas, dando origem a fragmentos de DNA cujo tamanho depende da distribuição dos locais de restrição.
Nascimento (1997) refere em relação a esta técnica citando outros autores que tem elevada heritabilidade, natureza codominante e identifica sequências únicas ou com baixo número de cópias. No entanto a análise com este tipo de marcadores é consideravelmente lenta, requer grandes quantidades de DNA (5 - 10 µg por indivíduo em estudo), tem custos elevados, necessita de marcação radioactiva das sondas e é exigente em termos dos protocolos laboratoriais.
O polimorfismo obtido com este tipo de marcador molecular é reduzido o que dificulta a utilização desta técnica na caracterização populacional das espécies.
Em Phytophthora esta técnica de caracterização molecular foi utilizada para confirmar a identificação e sinonímia de espécies, caracterizar isolados de compatibilidade sexual A1 e A2 em P. infestans e caracterizar a população desta mesma espécie com origem geográfica diversificada, como pode ser constatado em Erwin & Ribeiro (1996) que citam mais de 20 referências bibliográficas com utilização desta técnica de caracterização molecular no conjunto das espécies do género
Phytophthora.
A fiabilidade e reprodutibilidade desta técnica determinou que os marcadores RFLP continuem a ser utilizados na caracterização molecular de populações de
P. infestans quando o objectivo é comparar a estrutura populacional ao longo do
tempo, apesar de actualmente serem mais frequentemente utilizados marcadores moleculares baseados na técnica PCR.
2.8.2. Random Amplified Polymorphic DNA (RAPDs)
Os RAPDs obtêm-se através da amplificação por PCR do DNA genómico utilizando um único “primer” com sequência nucleotídica arbitrária e de pequena dimensão (10 nucleótidos). Quando o primer se liga ao DNA molde em dois locais que se situam a uma distância conveniente, obter-se-á um produto de amplificação observável por separação electroforéctica em géis de agarose e coloração com brometo de etídio.
O polimorfismo de DNA amplificado aleatoriamente resulta de alterações na sequência de bases onde o primer se liga ou na existência de delecções ou inserções na região amplificada.
Os RAPD são marcadores moleculares muito utilizados em melhoramento de plantas e na caracterização genética das espécies vegetais (Newton & Graham, 1997), caracterização molecular de fitobactérias (Louws et al., 1999) e caracterização de fungos nomeadamente ferrugens dos cereais (Chen et al., 1995), Fusarium oxysporum f. sp. cubense (Gerlach et al., 2000) Trichoderma spp. (Hermosa et al., 2000),
Armillaria mellea (Ota et al., 2000) e muitas outras espécies.
Os RAPDs são marcadores moleculares fáceis de realizar e muito informativos, apresentam no entanto a desvantagem da sua elevada sensibilidade a condições laboratoriais e origem dos tecidos dos quais se extrai o DNA que afecta o perfil dos RAPD. A falta de reprodutibilidade desta técnica dificulta consequentemente a uniformização de protocolos laboratoriais que permitam a criação de bases de dados para estudos comparativos a uma escala mais alargada.
Algumas das limitações da técnica RAPD podem ser solucionados com a utilização de controlos apropriados tais como utilizar repetições de preparações de DNA, realizar análise “Southern” ou converter fragmentos amplificados por RAPD em marcadores moleculares (Sequence Characterised Amplified Region - SCAR).
Os RAPDs apesar de não terem uma aplicação sistemática em Phytophthora foram utilizados para caracterizar P. quercina recentemente descrita por Jung et al. (1999), evidenciando os isolados padrões RAPD muito semelhantes entre si e muito diferentes dos evidenciados pelas outras espécies de Phytophthora.
Os RAPD são marcadores moleculares muito utilizados na caracterização infra- específica num grande número de organismos. Em Phytophthora foram utilizados para diferenciar os isolados de P. parasitica var. nicotianea com agressividade em plantas
de tabaco dos isolados que não possuem essa característica (Zhang et al., 2001) e por Purwantara et al. (2001) para avaliar a diversidade genotípica na população de
P. clandestina isolada de Trifolium subterraneum L. na Austrália.
Em P. cinnamomi os RAPDs foram apenas utilizados por Chang et al. (1996) para estudar a variabilidade populacional desta espécie em Taiwan onde foram identificados os dois tipos de compatibilidade sexual, A1 e A2.
Os RAPDs foram igualmente aplicados na caracterização da população de
P. infestans existente no Canadá por Mahuku et al. (2000) e no Norte da Irlanda por
Carlisle et al. (2001), aconselhando estes últimos autores a utilização de marcadores genéticos mais estáveis como os AFLP e a continuação da caracterização das populações de P. infestans com base na sonda (RFLP) RG-57 dada a estabilidade e reprodutibilidade associada a estes marcadores.
2.8.3. Amplified Fragment Length Polymorphisms (AFLP)
A técnica AFLP assenta na amplificação selectiva por PCR de fragmentos resultantes da digestão enzimática do DNA genómico.
O DNA total é digerido com duas enzimas de restrição, uma delas com elevada frequência de corte e outra com baixa frequência de corte (Mse 1 e EcoR 1 respectivamente). Aos fragmentos de restrição ligam-se adaptadores (oligonucleótidos de cadeia dupla com 25 pares de bases) especificamente concebidos para se unirem aos extremos dos fragmentos cortados com estas enzimas.
Após a ligação dos adaptadores aos extremos dos fragmentos de restrição a amplificação por PCR é conseguida com a utilização de primers que possuem três regiões características: a extremidade 5’ correspondente ao adaptador; a zona correspondente ao sítio de restrição e o extremo 3’ com nucleotídios selectivos que se estendem para a região desconhecida do fragmento de restrição e determinarão os fragmentos que serão amplificados.
Os perfis AFLP dependem da combinação das endonucleases utilizadas na restrição do DNA genómico e do número de nucleótidos arbitrários na extremidade 3’do primer.
Em geral, a análise de genomas complexos que dão origem a um elevado número de fragmentos de restrição necessitam de primers com elevado número de nucleotídios selectivos na extremidade 3’, enquanto genomas menos complexos como o dos fungos geralmente são suficientes dois nucleotídios selectivos na extremidade 3’ de cada primer.
A visualização dos produtos amplificados é normalmente realizada com marcação do primer correspondente ao extremo cortado pela enzima com menor frequência de corte com radioisótopos (33P) ou alternativamente por coloração com nitrato de prata.
Os resultados obtidos são de tipo binário baseando-se o polimorfismo na presença ou ausência de determinado produto de amplificação.
Os AFLPs possuem elevada heritabilidade, são muito polimórficos e reprodutíveis e pequenas quantidades de DNA são suficientes para a aplicação desta técnica.
Esta técnica de caracterização molecular, exigente do ponto de vista prático foi utilizada no género Phytophthora por Bonants & Weerdt (1997) na identificação de raças de P. fragariae e recentemente por Cooke et al. (2003) na caracterização das populações de P. infestans (1995-1997) da Escócia.
As características associadas aos marcadores AFLP possibilitam a utilização desta técnica no estudo da variabilidade biológica e populacional das espécies assim como no estudo de qualquer domínio da sua biologia tais como virulência, patogenicidade, compatibilidade sexual ou especialização parasitária.
2.8.4. Microssatélites ou Simple Sequence Repeats (SSR)
Os microssatélites são sequências de poucos pares de bases dispostas em série tais como (AT)n, (ATT)n ou (GACA)n distribuídos pelo genoma das espécies eucariótas. As sequências que flanqueiam os microssatélites geralmente são conservadas nos indivíduos da mesma espécie permitindo a construção de primers que amplificarão por PCR as sequências repetidas compreendidas entre as regiões conservadas. Os fragmentos amplificados podem ser separados por electroforese em géis de agarose e visualizados por coloração com brometo de etídio.
Os microssatélites ao contrário dos RAPDs e AFLPs necessitam do conhecimento da sequência de bases da região genómica nos quais se baseiam para o desenho dos primers apropriados.
Na bibliografia apenas encontramos a utilização desta técnica em Phytophthora por Dobrowolski et al. (1998) para a caracterização molecular do DNA mitocondrial (mtDNA) de P. cinnamomi com o objectivo de encontrar marcadores moleculares para o estudo da variabilidade populacional. No entanto, os resultados obtidos com os microssatélites (A)n, não evidenciaram polimorfismo no mtDNA de Phytophthora ao contrário do que aconteceu com o mesmo microssatélite no DNA dos cloroplastos (cpDNA) das plantas.
Modificações desta técnica como os RAMS (Random Amplified Microsatelites) que amplificam o DNA localizado entre a extremidade distal de dois microssatélites próximos (Hantula et al., 1997), foram utilizados na caracterização de isolados de
P. cactorum obtidos em hospedeiros diferentes, tendo estes marcadores moleculares
evidenciado diferenciação genotípica entre os isolados em estudo.
A caracterização da variabilidade genética das populações está dependente da existência de marcadores precisos e abundantes sendo aconselhável a utilização de diferentes marcadores para obter resultados que permitam avaliar essa variabilidade (Fry et al., 1993).
Os marcadores moleculares anteriormente referidos e a utilização, mais recente, da sequenciação de genes ou regiões génicas são frequentemente utilizadas em conjunto no estudo da estrutura genética da população uma vez que alguns marcadores permitem detectar maior variabilidade do que outros.
2.9. Caracterização Molecular de Populações – Epidemiologia e Dispersão