Identificação das Espécies de Phytophthora por Métodos Moleculares

(rDNA) é constituído por sequências de DNA muito conservadas nas sub-unidades do gene e zonas de maior variabilidade situadas entre as diferentes subunidades.

O estudo das regiões ITS do rDNA em Phytophthora tem evidenciado que a acumulação de mutações nesta região se aproxima do nível de especiação, razão que determinou a sua utilização nos estudos de sistemática e evolução assim como em diagnóstico e identificação.

O método de identificação baseia-se na amplificação por PCR da região ITS. A região amplificada (ITS1, 5.8S e ITS2) é digerida com 2 – 3 enzimas de restrição. Os perfis de digestão enzimática (característicos da espécie) permitem por comparação com a base de dados identificar, ao nível da espécie, os isolados de Phytophthora.

A identificação dos isolados pode ainda ser realizada pela sequenciação dos nucleótidos da região amplificada e comparação com as sequências desta região do genoma depositadas na base de dados EMBL ou NCBI pelo algoritmo FASTA (Pearson & Lipman, 1988).

3.6.1. Identificação por PCR-RFLP da Região ITS – rDNA

3.6.1.1. Amplificação da Região ITS1, 5.8S e ITS2 do rDNA por PCR 3.6.1.1.1. Primers

O DNA da região que codifica para os ribossomas foi amplificado pelos primers universais ITS6 e ITS4. O primer ITS6 é semelhante ao ITS5 de White et al. (1990). As alterações na sequência dos nucleótidos propostas por Cooke & Duncan (1997) resultaram de estudos da sequência 18S rDNA em P. megasperma (Forter et al., 1990) permitindo uma maior especificidade e eficácia na ampliação de Phytophthora pela reacção PCR.

O ITS4 de White et al. (1990) é um primer universal em eucariotas localizado na extremidade 5’ do gene 28S rDNA, localizando-se o primer ITS6 (Cooke & Duncan, 1997) na extremidade 3’ do 18S rDNA como o indicado na Figura 9.

ITS6 – 5’ GAA GGT GAA GTC GTA ACA AGG 3’ ITS4 - 5’ TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC 3’

Figura 9 – Representação esquemática da organização das unidades repetitivas do genoma que codificam para o RNA dos ribossomas e localização dos primers ITS6 (Cooke & Duncan, 1997) e ITS4 (White et al., 1990) utilizados na amplificação do fragmento de DNA – ITS1, 5.8S e ITS2 em

Phytophthora.

PCR _ITS4

ITS6

5.8S _28S

3.6.1.1.2. Condições Químicas e Físicas da Reacção PCR

As reacções de PCR foram realizadas num volume final de 25 µL. As condições químicas foram empiricamente ajustadas tendo-se obtidos resultados consistentes nas seguintes condições: 100 µM de cada dNTPs, 20 pmoles de cada primer, 1,5 mM de MgCl2, buffer da enzima na concentração final 1×, uma unidade de Taq DNA polimerase (Promega), BSA (Bovine Serum Albumin) na concentração de 0,1 mg mL-1, 1 µL de DNA e água ultra pura esterilizada até perfazer o volume final da reacção.

As reacções de PCR foram realizadas num termociclador UNO II (Biometra). A reacção inicia-se com um ciclo inicial de desnaturação a 95 ºC durante 3 minutos seguido-se 35 ciclos de amplificação com os seguintes parâmetros: 55 ºC durante 30 segundos, 72 ºC durante 60 segundos e 94 ºC durante 30 segundos. A reacção terminou com um período final de extensão a 72 ºC durante 10 minutos.

3.6.1.1.3. Digestão Enzimática da Região Genómica – ITS1, 5.8S e ITS2

Utilizaram-se as enzimas de restrição Msp I, Alu I e Taq I (Promega) para o estudo do polimorfismo da região ITS1, 5.8S e ITS2. A reacção ocorreu a 37 ºC durante toda a noite, tendo-se utilizado 10 µL de produto PCR e seguindo as condições de reacção indicadas pela casa comercial.

A enzima Taq I origina fragmentos de pequena dimensão e por isso difíceis de visualizar de forma adequada nos géis de agarose, razão pela qual não se realizou em todos os isolados Phytophthora.

3.6.1.1.4. Electroforese de Fragmentos de DNA

A separação dos fragmentos do DNA em função do seu tamanho realizou-se mediante electroforese em géis de agarose. A concentração de agarose varia com o tamanho do fragmento a separar tendo-se utilizado concentrações de agarose de 1,5 % para os fragmentos obtidos na reacção PCR e NuSieve® (BMA) a 2,5 % para a resolução dos perfis das enzimas Msp I e Alu I e 3,5 % para a enzima Taq I que origina

muitos fragmentos inferiores a 100 pb. A migração realizou-se a corrente constante (50 - 70 V).

Os tampões utilizados foram o TAE (Tris - Acetato 40 mM; EDTA 1 mM) ou TBE (Tris – Borato, 90 mM; EDTA 2 mM pH 8.0).

Para visualização dos fragmentos de DNA através de iluminação UV adicionou- se aos geis Br Et (0,5 µg mL-1).

Utilizaram-se câmaras de electoforese Bio-Rad ligadas a fontes “Bio-Rad Power- Pac 200” (Bio-Rad).

O DNA foi visualizado em luz UV, fotografado e guardado em suporte informático pelo sistema Eagle Eye® II (Stratagene).

A dimensão dos fragmentos foi estimada em pares de bases por comparação com o marcador de tamanhos de 100 bp Ladder (Promega) no programa Diversity Database (Bio-Rad) e comparados com os valores da base de dados disponibilizados pelo CABI Biosciense e de acesso livre na web em www.phytID.org- para identificação das espécies em estudo.

3.6.2. Identificação das Espécies de Phytophthora por Comparação da Sequência dos Nucleótidos da Região ITS1, 5.8S e ITS2

3.6.2.1. Purificação e Sequenciação dos Fragmentos do DNA Correspondentes à Região ITS1, 5.8S e ITS2

O DNA amplificado por PCR com os primers universais ITS6, ITS4 foi purificado para se proceder à sequenciação dos nucleótidos. Este processo de purificação envolve a remoção do gel e a separação do fragmento de DNA da matriz da agarose. Depois de removido do gel de agarose os fragmentos de DNA foram purificados utilizando o kit Wizard ® – PCR Preps DNA Purification System (Promega) seguindo as instruções do fabricante.

Para a sequenciação dos fragmentos de DNA da região ITS1, 5.8S e ITS2 utilizaram-se 50 – 150 ng de DNA molde e 5 pmoles de cada um dos primers iniciadores ITS6 e ITS4 num total de 8 µL de reacção.

A sequenciação foi realizada na Universidade de Salamanca num sequenciador automático de DNA.

As sequências de nucleótidos foram analisadas com o programa de bioinformática “BioEdit” disponível no servidor European Bioinformatics Institute (EBI) com acesso livre na Web (www.ebi.ac.uk). No mesmo servidor analisaram-se as sequências com a utilização do programa ClustalW para avaliar a similaridade entre as diferentes sequências e o programa FASTA (Pearson & Lipman, 1988) para a pesquisa da homologia com outras sequências de nucleótidos da base de dados da EMBL ou bases de dados de proteínas como a da Swiss-Prot.

3.7. Caracterização Molecular dos Isolados de Phytophthora por