Caracterização do soro anti-NcAct201-

Neste trabalho, também foi gerado o soro anti-NcAct201-310 a partir da proteína recombinante NcAct201-310, que corresponde à região compreendida entre os aminoácidos 201 e 310 de actina de N. caninum. A impossibilidade de expressão, em sistema procariótico, de NcAct recombinante completa, levou à expressão de uma região com menor identidade entre NcAct e actina de células Vero. Essa proteína foi expressa durante o mestrado (BARONI, 2012) com o objetivo de gerar um soro específico contra actina de N. caninum, uma vez que o anticorpo monoclonal anti-β-

actina C4, que foi capaz de detectar NcAct, também apresenta uma capacidade universal de reconhecer actina de diversas células, inclusive das células Vero. Essa característica impossibilitaria a localização de NcAct em taquizoítas intracelulares, por exemplo.

Actina é uma proteína abundantemente expressa em células eucarióticas de maneira geral e com função determinante em processos celulares. Organismos apicomplexas possuem actinas mais primitivas e divergentes caracterizadas até então (VAHOKOSKI et al., 2014) e que apresentam propriedades diferentes de actinas dos demais eucariotos, como abundância preponderante da forma monomérica in vivo, filamentos instáveis (DOBROWOLSKI; SIBLEY, 1996; WETZEL et al., 2003), polimerização isodésmica (SKILLMAN et al., 2013), hidrólise de ATP na forma monomérica e polimerização instantânea também em presença de ADP (VAHOKOSKI et al., 2014). Em N. caninum, foi mostrado que actina possui nove isoformas, identificadas por SDS-PAGE 2-D e espectrometria de massas, diferentemente de células Vero, que possuem apenas três (BARONI, 2012). Em T. gondii, diferentes isoformas de actina foram identificadas anteriormente em estudos de avaliação geral do proteoma (XIA et al., 2008), porém, não foram encontrados trabalhos específicos que investigassem mais detalhadamente essas isoformas.

Inicialmente, a tentativa de caracterização do soro anti-NcAct201-310, através de western blot a partir de extratos totais de N. caninum e de células Vero, mostrou uma incapacidade do soro em questão em reconhecer actina dessas células, naquelas condições. Todavia, o soro anti-NcAct201-310 reconheceu proteínas que ficaram na região superior de PAGE nativa, da mesma maneira que o anticorpo anti-β-actina C4. É interessante comparar esse resultado com aquele obtido no ensaio bidimensional de ligação de NcADF e actina de coelho (item 4.1.4.5). Naquela oportunidade, foi possível observar que parte da actina aplicada em PAGE nativa ficou retida na região superior do gel. Apesar das condições utilizadas nos ensaios serem bastante diferentes – aqui, foi utilizado extrato total de N. caninum em PAGE de 10%, e no ensaio bidimensional, uma mistura de actina de coelho e NcADF em PAGE de 8,5% – o comportamento de actina de coelho purificada poderia indicar um comportamento similar de NcAct endógena. Esse paralelo poderia demonstrar uma evidência de que o soro anti-NcAct201-310 é sim capaz de reconhecer NcAct endógena.

Em conjunto, os resultados mostraram que o soro anti-NcAct201-310, apesar de não específico para reconhecimento de proteína apenas de N. caninum, apresentou

uma capacidade maior de reconhecer proteínas, possivelmente NcAct, na forma nativa. Interessantemente, os anticorpos gerados contra uma região de proteína linearizada não foram capazes de reconhecer a proteína completa em sua conformação linear. Uma possível explicação é que o fragmento de NcADF sofreu montagem (folding) parcial no tampão com adjuvante durante a imunização, tornando alguns epítopos acessíveis ao sistema imunológico somente formados em proteína com uma conformação específica. Essa explicação resultaria em impossibilidade de detecção da proteína recombinante desnaturada pelo soro. Todavia, a proteína recombinante apresenta cauda 6 X histidina e a detecção da proteína recombinante pelo soro poderia estar ocorrendo por detecção de epítopos da cauda e não do fragmento em si. Para avaliar a localização do fragmento NcAct201-310 na estrutura terciária de actina, foi utilizada a estrutura terciária elucidada de actina I de P. falciparum (PfAct I; acesso PDB 4CBU), cuja sequência primária é 93% idêntica a NcAct (figura 66). O acesso 4CBU (VAHOKOSKI et al., 2014) foi obtido por cristalização de PfAct I (cadeia A; figura 66, verde e vermelho) ligada a gelsolina (cadeia G; figura 66, cinza). A região correspondente aos aminoácidos 201-310 foi destacada em vermelho tanto na representação como cartoon (figura 66, A), quanto da superfície da proteína (figura 66, B). A região 201-310 compreende tanto aminoácidos expostos ao solvente, quanto aminoácidos internos à estrutura. Uma conformação similar a essa que o fragmento assume na figura 66 pode ser responsável pela formação de epítopos identificados pelos anticorpos presentes no soro anti- NcAct201-310.

O único resultado que mostrou capacidade similar do soro em reconhecer proteínas desnaturadas e nativas foi o dot blot, com diferenças de resultados observados entre as membranas de nitrocelulose e PVDF. Essa diferença pode ser decorrente das diferentes características físicoquimicas das composições das membranas, uma vez que a membrana de PVDF é mais hidrofóbica que a nitrocelulose, podendo ocorrer perda de proteínas daquela membrana durante as lavagens, ocasionando, consequentemente, um sinal mais fraco após a revelação.

Figura 66. Estrutura terciária de actina I de Plasmodium falciparum (PfAct I) com destaque para região compreendendo aminoácidos 201-310. Estrutura terciária de PfAct I, vermelho e verde, ligada a gelsolina de camundongo, cinza (acesso PDB 4CBU). A região compreendida pelos aminoácidos 201-310 está destacada em vermelho. A) Representação da estrutura em cartoon. Os números 1-4 indicam a localização dos subdomínios de actina. B) Representação da superfície da estrutura. As estruturas estão mostradas com giro de 180º entre si em relação ao eixo y.

Não foi possível determinar, através dos resultados apresentados neste trabalho, a especificidade do soro quanto à detecção exclusiva de actina. Entretanto, a imunolocalização promoveu marcação da região periférica dos taquizoítas, de acordo com os resultados encontrados anteriormente com soro anti-β-actina C4. Resultados de imunofluorescência por microscopia confocal utilizando soro anti-β-actina C4 mostraram que actina de taquizoítas de N. caninum localizam-se na região periférica

da célula (BARONI, 2012; apêndice G). A marcação da região nuclear pode indicar uma afinidade do soro anti-NcAct201-310 por actina nuclear, que pode ser importante para a divisão celular (KAPOOR; SHEN, 2014).