Interação de NcADF com actina

Para investigar se NcADF interage com actina-G de coelho, foi realizado, incialmente o ensaio bidimensional de interação entre as duas proteínas, onde 20 µM de NcADF foram incubados com 5 µM de ATP-actina-G em tampão-Mg-G (apêndice C.7) por 15 minutos. A mistura foi submetida a PAGE nativo onde, em 2 poços foram aplicados 20 µl da reação e em um poço foram aplicados 75 µl da mesma reação. Após a corrida, os poços foram recortados; aquele contendo maior volume de reação foi posicionado sobre um gel desnaturante, ou seja, contendo SDS, e foi realizado um SDS-PAGE. Ao proceder dessa maneira, qualquer interação presente entre actina-G e NcADF seria desfeita e mostrada em SDS-PAGE como duas bandas de massa molecular diferentes, mas com a mesma localização, caso uma linha vertical imaginária seja traçada no gel. Quanto aos outros dois poços, um deles foi corado com Coomassie G-250, enquanto que o outro foi submetido a western blot e marcado com soro anti-NcADF.

No gel bidimensional, foi observada uma coincidência vertical entre as bandas compostas por NcADF (figura 43, A, seta vermelha) e actina-G (figura 43, A, seta azul), indicando interação entre as duas proteínas. Essa interação pode ser observada também no gel nativo antes da corrida desntaturante como uma banda entre NcADF e actina (figura 43, B, gel). A presença de NcADF nessa banda intermediária foi identificada por detecção com soro anti-NcADF (figura 43, B, WB). NcADF não penetrou efetivamente no gel, permanecendo na parte superior do PAGE nativo (figura 43, B e resultados não mostrados) e a quantidade de NcADF que foi detectada mais adiante no gel penetrou, possivelmente, por estar interagindo com actina (figura 43, A e B). A visualização de actina livre, sem interação com NcADF, foi possível na banda presente na maior distância a partir do início da corrida em PAGE nativo (figura 43, B). A presença de actina na banda intermediária foi visualizada no gel bidimensional,

na região verticalmente coincidente com NcADF (figura 43, A). A confirmação da corrida de actina e NcADF foi possível quando, em um novo ensaio nas mesmas condições previamente citadas, essas proteínas foram adicionadas em um poço adjacente ao gel nativo no SDS-PAGE, confirmando o peso molecular das proteínas provenientes do ensaio em PAGE nativo (figura 43, C, em P). Para melhor visualização e compreensão do ensaio de interação bidimensional, uma representação esquemática dos procedimentos e do resultado obtido foi feita na figura 43D.

Figura 43. Avaliação da interação de actina de coelho com fator de despolimerização de actina de Neospora caninum (NcADF). Ensaio bidimensional de interação entre proteínas. NcADF (20 µM) e actina de coelho (5 µM) foram incubadas por 15 minutos e submetidas a PAGE nativa 8%. A) Uma fatia do gel não-desnaturante correspondente a um poço semelhante ao posicionado acima do gel desnaturante, porém com mais que o dobro do volume de reação, foi recortada e posicionada sobre o gel SDS-PAGE 12,5% e submetida à eletroforese. B) Outra fatia foi corada com Coomassie G-250, enquanto que uma terceira fatia teve seu conteúdo transferido à membrana PVDF, que foi revelada com soro anti-NcADF diluído 1:15.000. C) SDS-PAGE nas mesmas condições de B; adicionado padrão com actina de coelho e NcADF recombinante no poço P (padrão). D) Representação esquemática mostrando os procedimentos e o resultado do ensaio bidimensional de interação entre NcADF recombinante e actina de coelho mostrado em A. Setas vermelhas, regiões onde NcADF coincide com actina; setas azuis, regiões onde actina coincide com NcADF.

Para confirmar a interação entre NcADF e actina observada no ensaio bidimensional foram utilizados dois agentes formadores de ligação cruzada: formaldeído e EDC.

O formaldeído é amplamente utilizado para a fixação de estruturas celulares, devido ao pequeno tamanho de sua molécula e capacidade inerente de tornar estáveis interações transientes entre proteínas (SRINIVASA et al., 2015). Aqui, inicialmente, a capacidade desse composto em formar ligações cruzadas entre NcADF e actina de coelho foi avaliada em um ensaio in vitro. Para isso, NcADF recombinante e actina de coelho foram incubadas com presença de 0,4, 2 ou 4% de formaldeído por 10 ou 30 minutos. Como resultado, houve formação de uma banda adicional de ~60 kDa, além daquelas formadas por actina e NcADF. Essa banda corresponde à soma das massas moleculares das duas proteínas em questão. Ela foi observada quando concentrações de 2 e 4% de formaldeído foram utilizadas (figura 44, poços 2, 3, 5 e 6), sendo mais evidente em presença de 4% de formaldeído (figura 44, poços 3 e 6). A banda correspondente à interação entre NcADF e actina ficou mais evidente na incubação de 30 minutos e 4% de formaldeído (figura 44, poço 6), quando comparada à de 10 minutos com 4% de formaldeído (figura 44, poço 3).

Figura 44. Avaliação de interação entre fator de despolimerização de actina de Neospora caninum (NcADF) recombinante e actina de coelho utilizando formaldeído como agente formador de ligação cruzada. SDS-PAGE 12,5%. NcADF recombinante (10 µM) e actina de coelho (10 µM) foram incubadas em tampão de interação com presença de 0,4, 2 ou 4% de formaldeído por 10 ou 30 minutos. Poços 1 e 4: presença de 0,4% de formaldeído. Poços 2 e 5: 2% de formaldeído. Poços 3 e 6: 4% de formaldeído. Poços 1 a 3: incubação por 10 minutos. Poços 4 a 6: incubação por 30 minutos.

A avaliação de interação entre NcADF e actina de coelho foi repetida nas condições anteriores com incubação de 30 minutos e 4% de formaldeído. A formação da banda de interação antre NcADF e actina foi observada novamente com ~60 kDa (figura 45, A, seta). A mesma reação foi submetida a western blot para detecção de actina e NcADF com o anticorpo anti-β-actina C4 e soro anti-NcADF, respectivamente. A banda correspondente a actina, de 42 kDa, foi detectada, porém o anticorpo não detectou actina em 60 kDa (figura 45, B). O soro anti-NcADF detectou NcADF com ~18 kDa e ~60 kDa (figura 45, B). Apesar da falta de evidência de identificação de actina em peso molecular de 60 kDa, a presença de NcADF nessa região do gel indica interação de NcADF com actina. A falta de detecção de actina acima do peso molecular predito pode ter ocorrido devido a baixa sensibilidade do anticorpo para concentrações baixas de actina.

Além do formaldeído, o EDC também foi utilizado com agente formador de ligações cruzadas na reação de actina de coelho com NcADF recombinante. A reação

foi feita nas mesmas condições da reação descrita em presença de formaldeído: 30 minutos de incubação a 22°C. Foram utilizados 5 µM de actina e NcADF e 2 µM de EDC. Como resultado, uma banda de ~60 kDa também foi observada, indicando interação entre NcADF e actina (figura 45, C).

Figura 45. Avaliação de interação entre fator de despolimerização de actina de Neospora caninum (NcADF) recombinante e actina de coelho utilizando agentes formadores de ligação cruzada. SDS-PAGE 12,5%. NcADF recombinante e actina de coelho foram incubadas em presença de agentes formadores de ligação cruzada por 30 minutos. A) Gel corado com Coomassie G-250. NcADF recombinante (10 µM) e actina de coelho (10 µM) foram incubadas em presença ou ausência de 4% de formaldeído por 30 minutos. Poço 1: actina e NcADF em ausência de formaldeído (C); poço 2: actina e NcADF em presença de formaldeído (F). B) Western blot a partir da reação em presença de formaldeído. Um gel contendo reações provenientes da mesma reação de B, foi transferido para membrana de PVDF e revelado com anticorpo anti-β-actina C4 ou anti-NcADF. Poço 1: anti-β-actina C4 (1:2.000); poço 2: anti-NcADF (1:10.000). C) Gel corado com Coomassie G-250. NcADF recombinante (5 µM) e actina de coelho (5 µM) foram incubadas em presença ou ausência de EDC. Após 30 minutos, a reação foi inibida com 9 mM de glicina. Poço 1: actina e NcADF em ausência de EDC (C); poço 2: actina e NcADF em presença de 2 mM de EDC. Nas setas, interação entre actina e NcADF.