Clonagem e purificação de NcADF recombinante solúvel

A padronização das condições para purificação de NcADF solúvel foi realizada na Universidade de Edimburgo e, para que a expressão fosse possível, o plasmídeo NcADF_pET28 foi transportado da Universidade de São Paulo até Edimburgo ligados em colunas de miniprep, uma vez que que tentativas de transformação química em E. coli JM101 a partir da eluição dos plasmídeos transportados em papel filtro foram realizadas sem sucesso.

Os plasmídeos foram inicialmente transformados em células JM101 e purificados por lise alcalina seguida de precipitação do DNA com isopropanol, evitando o uso de colunas de miniprep que, apesar de eficientes na purificação da amostra,

comprometem a quantidade de DNA recuperada. Os plasmídeos purificados a partir de precipitação com isopropanol foram transformadas em células BL21, resultando em colônias, que foram isoladas em meio LB seletivo.

Antes que NcADF recombinante fosse adequadamente expressa, algumas condições de expressão, extração e purificação foram testadas. Inicialmente, quatro colônias foram testadas para expressão de NcADF utilizando-se as seguintes condições: 5 ml de meio LB, 1 mM IPTG a 37°C por 3 horas. Após a expressão, as células foram lisadas por sonicação usando baixa amplitude (máximo de 5 microns). Quando os extratos foram submetidos a SDS-PAGE, a quantidade de proteína recombinante observada era muito pequena assim como a de proteínas totais. Esse resultado indicou uma necessidade de otimização das condições de lise celular. Para isso, a expressão foi feita novamente utilizando agora apenas um clone; as células foram lisadas com sonicação em alta amplitude (13 microns), seguida de cinco etapas de congelamento e descongelamento em gelo seco. Essa modificação na etapa de lise resultou em uma maior quantidade de proteínas totais, observadas em SDS- PAGE (não mostrado).

Com o objetivo de tentar aumentar ainda mais a quantidade de proteína recombinante solúvel expressa, o protocolo de expressão foi otimizado novamente. Para isso, foram testadas algumas condições como alteração de temperatura e do meio. Apesar dessas condições terem sido otimizadas anteriormente (figura 27), houve uma nova necessidade de avaliar as condições a temperaturas acima dos 18°C anteriormente estabelecidos para expressão solúvel, uma vez que não havia acesso a um agitador com temperaturas controladas abaixo da temperatura ambiente. Desse modo, foi utilizado, para expressão, um meio mais rico que o LB, o meio TB, e temperatura controlada a 27°C ou temperatura ambiente, de aproximadamente 22°C.

Visando aumentar a proporção entre NcADF recombinante solúvel e insolúvel, foi realizado um teste de expressão com adição de etanol ao meio de cultura. Ao meio TB, foram adicionados 0-10% de etanol e a expressão foi conduzida a 27°C por 18 horas em presença de 0,2 mM de IPTG. Nas condições testadas, o etanol não foi capaz de aumentar a quantidade de proteína recombinante solúvel em relação à quantidade de proteína solubilizada em ureia 8 M (figura 28). Além disso, em altas concentrações, o etanol inibiu o crescimento das bactérias (figura 28, poços 4 e 5, 8 e 9).

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Figura 28. Teste de solubilização de fator de despolimerização de actina de Neospora caninum (NcADF) recombinante. SDS-PAGE 12% corado com Coomassie R-250. NcADF recombinante expressa em E. coli BL21 em meio TB a 27°C com 0,2 mM IPTG em presença de 0, 3, 5 ou 10% de etanol; as células foram lisadas por sonicação em tampão de solubilização 1 (apêndice B.4), seguida de sonicação em tampão ureia 8 M. Poço 1: E. coli BL21 não transformada com plasmídeo NcADF_pET28 sonicada em tampão de solubilização 1; poços 2 a 6: E. coli BL21 transformada com NcADF_pET28 submetidas a expressão em presença de 0, 3, 5 e 10% de etanol, respectivamente, e sonicadas em tampão de solubilização 1; poços 6 a 9: Pellets resultantes das amostras dos poços 2 a 5, agora sonicados em ureia. C = amostra controle (BL21 não transformada com NcADF_pET28). Em *, NcADF recombinante. Peso molecular indicado à esquerda em kDa.

A proteína recombinante NcADF foi purificada em coluna contendo resina de Ni+2 após expressão em 500 ml de meio TB, temperatura ambiente, 0,2 mM de IPTG e extração em tampão de solubilização 2 (apêndice B.5), tamponado com Tris 50 mM, e com adição de glicerol e Triton X-100, para aumentar a estabilidade da proteina em solução e extrair maior quantidade de proteína durante a lise, respectivamente. Apesar de haver pouca quantidade de proteína recombinante no gel (figura 29), notou- se, visualmente, logo após a eluição da resina, a precipitação da proteína em solução; as alíquotas tornaram-se turvas. Esse comportamento da proteína recombinante, nessas condições de purificação, indicou a necessidade da busca de novas condições que permitissem uma estabilidade maior da proteína em solução.

Figura 29. Purificação da proteína recombinante fator de despolimerização de actina de Neospora caninum (NcADF). SDS-PAGE 12% corado com Coomassie R-250. Proteína recombinante foi expressa em E. coli BL21 (DE3) em 500 ml de meio TB por 18 horas em presença de 200 nM de IPTG a temperatura ambiente (~22°C). Poço 1: as células BL21 foram lisadas em tampão de solubilização 2, poço 2: flow through; poços 3 a 7: alíquotas foram coletadas após eluição em tampão de eluição. Em *, proteína recombinante NcADF. E.T. = extrato total; F.T. = flow through; P1-P5 = proteína recombinante eluída, alíquotas 1-5 Peso molecular indicado à esquerda em kDa.

As novas condições testadas em seguida levaram em consideração os componentes do tampão de solubilização, o pH desse tampão e a presença de EDTA após a eluição da proteína purificada da coluna de Ni+2_.

Quando NcADF foi expressa nas mesmas condições citadas acima e as células foram lisadas em tampão de solubilização 2, também houve precipitação da proteína recombinante imediatamente após purificação. Foi, então, adicionado às alíquotas recém eluídas 1 mM de EDTA, com objetivo de quelar os íons de níquel desprendidos da resina para a solução contendo a proteína purificada, uma vez que a afinidade desses íons pelas caudas de histidina associadas às proteínas poderia estar levando à formação de agregados. A presença de EDTA retardou a precipitação da proteína, que não ocorreu imediatamente. Todavia, foi observada precipitação após 48 horas de congelamento a -20°C.

Com objetivo de evitar qualquer precipitação da proteína recombinante, o pH do tampão de lise foi modificado para 7,0, uma vez que que o pI teórico de NcADF recombinante foi estimado em 8,7. A proteína NcADF foi expressa nas mesmas condições anteriormente citadas, porém a lise foi realizada em presença de tampão P (apêndice B.6), sendo idêntico ao tampão de solubilização 2, porém com pH mais

ácido (pH de 8,0 para 7,0). A eluição também foi feita em presença de EDTA e DTT, e foi observada uma estabilidade da proteína nessas condições.

Para uso posterior, foi realizada tentativa de diálise da proteína recombinante em tampão-G (apêndice C.1), a ser utilizado nos ensaios bioquímicos para solubilização de NcADF, porém houve precipitação da proteína dentro do tubo de diálise. A diálise foi realizada, portanto, contra tampão de composição próxima a do tampão P, porém com menor concentração de alguns componentes que pudessem, em altas concentrações, gerar interferência nos ensaios posteriores. A figura 30 mostra a proteína NcADF recombinante expressa e purificada, após diálise em tampão de armazenamento.

Figura 30. Expressão e purificação da proteína recombinante fator de despolimerização de actina de Neospora caninum (NcADF) solúvel. Proteína recombinante foi expressa em E. coli BL21 (DE3) em 500 ml de meio TB por 18 horas em presença de 200 nM de IPTG a temperatura ambiente (~22°C). Poço 1: após expressão, as células BL21 foram lisadas em tampão-P; poço 2: flow through; poço 3: a solução eluída foi dializada por pelo menos 18 horas contra tampão de armazenamento. Peso molecular indicado à esquerda em kDa.