1. Introdução
3.1 Matéria Prima: bagaço de cana-de-açúcar
3.1.3 Caraterização química da biomassa
A análise da composição da biomassa foi feita, em triplicata, segundo os métodos normalizados do Laboratório Nacional de Energia Renováveis dos EUA (NREL): teor de umidade, extrativos, cinzas, proteína total, carboidratos estruturais e lignina.
3.1.3.1 Determinação de sólidos totais e umidade
O teor de sólidos totais e umidade foram determinados usando-se o método normalizado TP-510-42621 (Sluiter et al., 2008), este método foi desenvolvido para amostras de biomassa sólidas e semissólidas, através da determinação da quantidade de substâncias voláteis eliminadas por dessecação. Para a sua realização pesa-se 15 - 30 g da amostra, que é colocada em cadinhos e levados a estufa com temperatura de 105 °C ± 5 °C por 24 horas realiza-se nova pesagem para obter um peso constante.
3.1.3.2 Determinação de cinzas
O teor de cinzas foi determinado segundo o método TP-510-42622 (Sluiter et al., 2008). Esse método é usado para determinar a quantidade de material inorgânico medido como parte da composição total da biomassa, expresso em porcentagem de matéria seca. Nessa metodologia os cadinhos contendo as amostras (aproximadamente 0,3 g por análise) foram secos em estufa por aproximadamente 12 horas a 105 °C. Após uma hora em dessecador para seu resfriamento foram pesados para determinação da porcentagem de sólidos totais. Posteriormente, os cadinhos foram submetidos à incineração na mufla por cerca de 5 horas a 575 °C, sendo novamente pesados, para obtenção da porcentagem de sólidos voláteis.
3.1.3.3 Determinação de extrativos
Os extrativos são compostos por material na amostra de biomassa que é solúvel em água ou etanol durante uma extração. Os extrativos foram determinados usando-se o método TP-510-42619 (Sluiter et al., 2005). Aproximadamente 10 gramas de amostra são necessários para esta determinação e o produto final desta análise será utilizado posteriormente para análises de proteína bruta e nitrogénio, celulose, hemicelulose e amido (Figura 3.1 e Figura 3.2).
190 mL H2O
(4 a 5 ciclos do sifão por hora) 7 horas Líquido Resíduo Secagem em estufa 2h a 105 ºC Pesagem Estufa 12h a 105 ºC Cálculo da porcentagem de extrato em água Hidrólise ácida em 2 etapas
30g resíduo + 3mL ácido sulfúrico 72% 1h a 30 ºC
Resíduo etapa anterior 1h a 121 ºC
Lignina insolúvel 50 mL resíduo
Estufa a 105 ºC Até peso constante
Mufla 24 a 30 h a 575 ºC
Lignina solúvel 50mL resíduo
Espectrofotômetro
Figura 3.1 Extrativos em biomassa com água e determinação de lignina Soxhlet Determinação de Lignina
190 mL álcool etílico (6 a 10 ciclos do sifão por hora)
12h Líquido Resíduo Secagem em estufa 2h a 105 ºC Pesagem Rotaevaporador ~40 min a 55 ºC Pesagem do resíduo solido Hidrólise ácida em 2 etapas
30g resíduo + 3mL ácido sulfúrico 72% 1h a 30 ºC
Resíduo etapa anterior 1h a 121 ºC
Lignina insolúvel 50mL resíduo
Estufa a 105ºC Até peso constante
Mufla 24 a 30 h a 575 ºC Lignina solúvel 50 mL resíduo Espectrofotômetro 198 λ Determinação de ligninas
A extração em água é feita utilizando 190 mL de água destilada em um frasco tarado, posicionado no equipamento de soxhlet juntamente com 10 gramas de amostra. As mantas de aquecimento são ligadas e o refluxo é mantido por 6 horas. A amostra é posteriormente seca em estufa por 2 horas a 105 ºC. Para a extração de etanol o mesmo foi feito. No entanto, neste caso se utilizou 190 mL de álcool etílico no frasco.
Em seguida realiza-se a hidrólise ácida da amostra. Ambas as amostras de extração de água e etanol são pesadas, 30 gramas cada, e adiciona-se 3 mL de ácido sulfúrico 72% por 60 minutos a 30 ºC e posteriormente eleva-se a temperatura por 60 minutos a 121ºC.
As amostras foram filtradas a vácuo separando a parte líquida da sólida. Para a lignina solúvel usou-se uma parcela do líquido hidrolisado e levou-se para o
espectrofotômetro com comprimento de onda de 198 λ. Para a lignina insolúvel usou-se a
parte sólida da filtração para um cadinho que foi levado à mufla a 575 ºC por 4 horas até a obtenção do peso constante.
3.1.3.4 Determinação do conteúdo de proteínas na biomassa
A determinação de proteínas foi feita para o bagaço de cana-de-açúcar pelo método Nitrogênio-Kjeldahl, sendo que o teor de proteínas foi calculado de acordo com a seguinte equação 14:
𝑃𝑃𝑟𝑟𝑃𝑃𝑃𝑃𝑃𝑃í𝑛𝑛𝑛𝑛𝑛𝑛 𝑛𝑛𝑃𝑃 𝑃𝑃𝑥𝑥𝑃𝑃𝑟𝑟𝑛𝑛𝑃𝑃𝑃𝑃 (%) = �𝑉𝑉
𝐻𝐻𝐶𝐶𝐻𝐻𝑥𝑥𝐶𝐶𝐻𝐻𝐶𝐶𝐻𝐻𝑥𝑥𝐹𝐹𝐹𝐹𝐻𝐻𝐶𝐶𝐻𝐻𝑥𝑥0,014𝑚𝑚
𝑎𝑎𝑎𝑎𝑎𝑎𝑎𝑎𝑎𝑎𝑎𝑎𝑎𝑎
� 𝑥𝑥100𝑥𝑥𝐹𝐹𝐹𝐹
𝑝𝑝𝑎𝑎𝑎𝑎𝑎𝑎𝑝𝑝𝑝𝑝𝑛𝑛𝑎𝑎𝑎𝑎 (14)Onde: VHCl é o volume de solução de ácido clorídrico gasto na titulação; CHCl é a
concentração da solução utilizada na titulação; FcHCl é o fator de correção da concentração
da solução de HCl utilizada na titulação; mmostra é a massa de extrato ou de matéria-prima
utilizada na análise e Fc proteínas, é o fator de correção para conversão do teor de nitrogênio total presente na amostra para proteínas, que neste caso corresponde a 6,25.
3.1.3.5 Determinação de lignina e carboidratos estruturais
As quantidades de carboidratos estruturais e lignina foram determinadas utilizando o método TP-510-42618 (Sluiter et al., 2008). O método inicia-se com a esterilização de cadinhos em mufla a 550 ºC por 30 minutos. Em seguida 0,3 g de amostras foram pesadas em triplicata. Em seguida os cadinhos foram colocados em banho-maria a 30 ºC
por 60 minutos. Também foi feito um padrão contendo 0,01 de arabinose, 0,0015 de galactose, 0,2 glicose, 0,02 xilose, 0,001 manose, 0,005 de frutose, todos adicionados em 10 mL de água destilada e 0,35 mL de ácidos sulfúrico. Adicionaram-se em todas as amostras 84 mL de água usando uma bureta. As amostras foram autoclavadas a 121 ºC por 1 hora, conforme a Figura 3.3 a seguir.
Resíduo (obtido da extração com H2O)
Secar em estufa: 2h a 105ºC
Hidrólise ácida
Pesar 0,3 g + 3 mL de ácido sulfúrico 72%
Banho maria: 1h a 30ºC
Adicionar 84 mL de água destilada
Misturar as amostras até eliminar a separação de fase entre ácido e água Padrão de açúcar
arabinose, galactose, glicose, xilose, manose, frutose, rafinose e
celobiose
Pesar com precisão de 0,1 mg
Adicionar 10 mL de água destilada
Adicionar 0,35 mL de ácido sulfúrico
Misturar e fechar bem o tubo de pressão
Levar para autoclave: 1h a 121ºC
Filtrar a vácuo as soluções hidrolisadas
Sólido Analisar lignina
insolúvel Líquido
Analisar lignina solúvel
Medir absorbância no espectrofotômetro 198 λ
Figura 3.3 Esquema de determinação dos carboidratos estruturais e lignina na biomassa