A citologia em base líquida pode ser considerada como um esforço para tornar o preparo citológico mais representativo. Este sistema foi desenhado para melhorar tanto a coleta das amostras como a citopreparação, quando comparado com a técnica de citologia esfoliativa convencional. As lâminas são preparadas através de equipamentos próprios, os quais apresentam um dispositivo de filtro, o que reduz o número de artefatos e produz uma fina camada de células (HUTCHINSON et al., 1999; LINDER, 1998).
Este novo método de citologia reduz os principais erros metodológicos relacionado à citologia esfoliativa convencional, tais como (MERLIN, 2002):
• Falta de representatividade celular no esfregaço, causado por uma coleta pobre e/ou inadequada;
• Artefatos ou distorções morfológicas resultantes da má fixação, principalmente quando esta não ocorre imediatamente após a coleta;
• Distribuição não randomizada das células no esfregaço;
• Presença de aglomerados celulares, muitas vezes tornando o esfregaço muito espesso;
• Grande quantidade de células sangüíneas e debris que podem obscurecer o esfregaço;
• Células importantes na avaliação da malignidade que podem não ter sido tranferidas para a lâmina, permanecendo no instrumento de coleta.
Essas falhas representam aproximadamente dois terços dos resultados falso-negativos dos esfregaços cervico-vaginais convencionais, uma vez que a amostra torna-se inadequada para análise.
A citologia em base líquida tem como finalidade obter uma camada de células mais fina e representativa. Isto se deve ao fato das células serem primeiramente suspensas na solução fixadora. Com isso há uma melhora na sensibilidade e a especificidade dos esfregaços (BROADSTOCK, 2001; BAANDRUP et al., 2000; LINDER, 1998).
Porém a citologia em base-líquida não tem se apresentado como substituta do preparado convencional, mas sim, como um aprimoramento do exame de Papanicolaou. Idealmente, este procedimento não deve alterar a essência do
estudo citomorfológico, baseado em critérios há muito conhecidos dos citopatologistas (DIGENE, 2002).
Esta tecnologia foi aprovada, em maio de 1996, para uso em citologia ginecológica pelo FDA (United States Food and Drug Administration), mas ainda pode ser utilizado em citologia não ginecológica, como citologia do trato urinário, trato respiratório e aspiração com agulha fina (LINDER, 1998; CARPENTER e DAVEY, 1999; MICHAEL et al., 2001; NASUTTI et al., 2001).
A técnica básica de coleta das amostras e a interpretação dos esfregaços convencionais por Papanicolaou permaneceram praticamente inalterados nos últimos ciqüenta anos, sendo que erros na interpretação e no diagnóstico são as maiores causas de falso-negativos. Portanto a citologia em base líquida tem como principal objetivo melhorar a qualidade de análise das amostras, o que representa um significantivo avanço em relação à citologia convencional (APGAR, 2001).
Segundo MICHAEL et al. (2001) os preparos de citologia em base líquida para espécimes ginecológicos e não ginecológicos estão ganhando espaço e tornando-se um método de escolha em vários laboratórios, pois a técnica produz uma camada fina de células sem serem prejudicadas pela presença de sangue ou de células inflamatórias.
A citologia em base-líquida, por sua apresentação intencionalmente mais fina e de fundo mais limpo que o preparado convencional, ganhou dois sinônimos bastante populares: “Citologia de monocamada” ou “Citologia de camada fina”. Como em certo números de casos a lâmina não se apresenta em monocamada e, apesar dos esforços, muitas áreas podem não se mostrar em camada fina, esses termos não refletem necessariamente o resultado final do preparado. Por isso, acredita-se que seja mais pertinente as denominações “Citologia em Amostra Líquida” ou “Citologia em Base-Líquida” (DIGENE, 2002).
2.4.1. Citologia em base líquida: técnica
Atualmente estão disponíveis no mercado várias técnicas de citologia em meio líquido, tais como: ThinPrep, TriPath, AutoCyte, Digene, Gel hidroalcoólico, Spin Thin e LiPa (BROADSTOCK, 2001; MICHAEL et al., 2001 e SILVA et al., 2003).
As células são coletadas através de escovas citológicas e em seguida introduzidas em um frasco contendo a solução preservadora evitando com isso a secagem ao ar e um comprometimento na morfologia celular. O meio usado para a fixação e preservação das células tem como base o metanol, que é ideal para preservação de DNA (FIEL-GAN et al., 1999).
Além de se enviar ao laboratório a amostra, é necessário que se informe os dados referentes à história clínica do paciente e as características clínicas da lesão, obtidas pela inspeção e palpação (BAANDRUP et al., 2000).
Nos laboratórios especializados, são depositadas pequenas quantidades da suspensão de células sob os filtros. Através dos poros dos filtros passam os debris, células vermelhas e muco, permanecendo retidas sobre a superfície as células usadas no diagnóstico. Em seguida, esses filtros são tocados sobre uma lâmina de vidro para que ocorra a transferência do material sob uma fina camada de células. Geralmente, há a formação de um círculo, medindo aproximadamente 20 mm de diâmetro (LINDER, 1998 e HUTCHINSON et al., 1999). Além das membranas de filtros, as diferenças na densidade durante o processo de centrifugação podem reduzir o conteúdo indesejado, como eritrócitos, leucócitos, debris e muco (BAANDRUP et al., 2000).
MICHAEL et al. (2001) fizeram algumas considerações sobre dois sistemas de citologia em base líquida, o ThinPrep e o TriPath. Ambas as técnicas são baseadas em amostras de base-líquida, porém diferem em metodologia, custo dos reagentes e no tempo de preparo. Além disso, cada método possui seu próprio equipamento. O sistema TriPrep é mais barato e requer menos treinamento, porém ocupa mais espaço nos laboratórios e exige mais habilidade técnica no manuseio do equipamento. Já o TriPath é mais caro e requer mais treinamento inicial, no entanto ocupa menos espaço, necessita de menos suporte técnico e de mínima habilidade no manuseio.
2.4.2. Vantagens da citologia em base líquida
Vários estudos têm mostrado que a citologia em base líquida aumentou significativamente a detecção de anormalidades cervicais, diminuiu o número de esfregaços insatisfatório, melhorou a qualidade da amostra e reduziu a probabilidade de resultados falso-negativos (LINDER, 1997; MAKSEM, 1999; CARPENTER e DAVEY, 1999; ANTON et al., 2000; PAYNE et al., 2000; WEINTRAUB e MORABIA, 2000; MONSONEGO et al., 2001).
MICHAEL et al. (2001) avaliaram 21 esfregaços não ginecológicos que foram preparados através da citologia em base líquida por dois sistemas diferentes, o ThinPrep e o TriPath. Os resultados obtidos foram os seguintes: • Ambos produziram uma uniforme dispersão celular em camada fina sem
sobreposição celular ou elementos que dificultassem a análise das células; • Em ambos o esfregaço era disperso, com densidade celular no centro menor
que a região periférica do círculo formado durante o processamento da lâmina; • Em ambos o fundo do esfregaço apresentava-se limpo, sem muco ou debris
protéicos;
• Ambos apresentaram poucas hemácias, células inflamatórias e agrupamentos celulares foram vistos;
• As características celulares comumente analisadas na citologia convencional, tais como: razão núcleo/citoplasma, pleomorfismo, hipercromasia, cromatina vesicular e a distribuição ordenada de células versus a perda de orientação, foram todas conservadas nas preparações em base líquida, em ambos os sistemas.
LINDER (1997) afirmou que a habilidade do sistema ThinPrep (citologia em base líquida) para detecar infecções e mudanças de células reativa foi equivalente ou melhor que os esfregaços de citologia convencional.
KOBAYASHI et al. (1998) afirmaram que após introduzirem o uso do método de citologia em base líquida em seus laboratórios, o número de espécimes insatisfatórios reduziu, os quais eram causados principalmente por problemas de sobreposição de hemácias e/ou artefatos gerados pela secagem ao ar, comum na citologia esfoliativa convencional.
Esta diminuição no número de amostras inadequadas ocorre por tirar a responsabilidade dos clínicos em preparar e fixar as lâminas. O preparo no laboratório promove uma distribuição mais uniforme e uma melhor fixação do material, livrando-o de exsudato inflamatório e sangue (HERBERT e JOHNSON, 2001).
Os estudos de citologia em base líquida, cujo material coletado era depositado diretamente nos frascos contendo a solução que preservava as celulares, exibiram taxas mais altas na detecção de anormalidades, com aumento na certeza do diagnóstico, em comparação aos estudos de amostra dividida. Os estudos de amostra dividida consistem na coleta da amostra e confecção imediata da lâmina (método convencional) e o remanescente da amostra coletada, que permanece no instrumento de coleta é, então, depositado no frasco que contem a solução preservadora (citologia em base líquida), o que proporcionou uma redução na identificação de neoplasias malignas (MAKSEM, 1999 e MONSONEGO et al., 2001).
As lâminas preparadas por meio da técnica de citologia em base líquida podem ser lidas mais rapidamente quando comparada às lâminas convencionais (SLATER e SMITH, 2001; PAYNE et al., 2000), porém o seu preparo requer mais trabalho e um maior tempo (SLATER e SMITH, 2001).
Outra vantagem da citologia em base líquida é a possibilidade de confecção de múltiplas lâminas com apenas uma coleta realizada no paciente, devido à quantidade de líquido e células suspensas que permanecem armazenadas no interior do frasco (LINDER, 1998).
O meio líquido em que as células são conservadas também preserva a reatividade de proteínas e ácidos nucléicos, o que permite estudos de citopatologia molecular como hibridizações moleculares in situ, testes imunocitoquímicos, reação em cadeia polimerase (PCR), análise de DNA e Captura Híbrida® (DIGINE, 2002; LINDER, 1998).
A imunocitoquímica utilizada juntamente com a citologia em base líquida (ThinPrep) exibe várias vantagens, segundo DABBS et al. (1997):
• O fundo é limpo, o que permite uma interpretação mais fácil;
• Menor quantidade de anticorpos é necessária, pois a área a ser corada é menor;
• As lâminas coradas pelo método de Papanicolaou podem ser utilizadas, pois nenhuma diferença significativa na imunocoloração foi verificada quando comparando as lâminas coradas inicialmente por Papanicolaou e lâminas não coradas;
• Múltiplos anticorpos podem ser testados em uma única lâmina, através da divisão em quatro partes;
• Lâminas adicionais podem ser preparadas para outros estudos imunocitoquímicos, conforme a necessidade.
Outra abordagem recente e promissora é a análise automatizada, efetuada por métodos computadorizados que, historicamente, era deficiente no método convencinal pela sobreposição de células e número de hemácias, células inflamatórias e muco, o que dificultava a interpretação. Porém, com o método de citologia em base líquida, a análise computadorizada pode ser realizada com maior facilidade (DIGENE, 2002; LINDER, 1997).
O câncer de colo de útero está associado aos seguintes tipos de Papilomavirus Humanos (HPV) 16, 18, 31, 33, 35, 45, 50, 52 e 56. Através da citologia em base-líquida foi possível determinar a tipagem do HPV nas células remanecentes no frasco de coleta, sem a necessidade de o paciente retornar para uma segunda coleta. Isto é realizado através do processo de Caputa Híbrida, onde se detecta o DNA do vírus (HUTCHINSON et al., 1999).
A citologia em base líquida representou um importante avanço no screening da população contra o câncer cervical (WEINTRAUB e MORABIA, 2000). E, a atual estratégia para o diagnóstico em uma população de alto risco, ao câncer de colo uterino, conta com o esfregaço citológico convencional, a citologia em base líquida e possível detecção e triagem do HPV (MAKSEM, 1999).
O uso da técnica de imunocitoquímica, em esfregaços obtidos pela citologia em base líquida, permitiu que se detectasse antígenos para o Vírus do Herpes Simples (HSV), o que foi de grande valor no diagnóstico da infecção bucal causada por esse microrganismo, especialmente nos casos de lesões cujas alterações celulares não eram patognomônicas (KOBAYASHI et al., 1998).
FIEL-GAN et al. (1999) extraíram o DNA de cinco casos sugestivos, citologicamente, de infecção por HSV e concluíram que a combinação da citologia em base líquida juntamente com PCR, permitiu um diagnóstico preciso. Logo, o
uso concomitante da análise morfologica e métodos moleculares possibilitaram um ganho na sensibilidade de diagnóstico e uma diminuição na necessidade do paciente retornar para a realização de outras coletas, quando comparado com métodos tradicionais de cultura deste microrganismo e diagnóstico.
MORRISON et al. (2002) avaliaram 62 biópsias por aspiração com agulha fina (AAF) de áreas onde havia melanoma metastático. As lâminas foram preparadas de maneira convencional e através do sistema de citologia em base líquida. Os autores observaram uma maior celularidade e que a melanina estava presente com maior freqüência nas lâminas preparadas através do sistema de base líquida (82%) e sugeriram algumas explicações para tal fato, dentre elas: uma melhor preservação das células coletadas e a diminuição da matriz de fundo ou outros elementos que dificultavam a interpretação.
HAYAMA e MIGLIARI (2002) afirmaram que a citologia em base líquida proporcionou um preparo de melhor qualidade, sendo indicada como ferramenta auxiliar no diagnóstico das lesões bucais.
2.4.3. Desvantagens da citologia em base líquida
Apesar de todos os benefícios da citologia em base líquida, esta é uma tecnologia cara em termos de equipamentos, custo capital, manutenção, treinamento, tempo de preparação técnica, transporte e disposição de meio líquido (HERBERT e JOHNSON, 2001). Os custos da citologia em base líquida são duas vezes maiores que os custos da citologia convencional, segundo MONTZ et al., 2001 e WEINTRAUB e MORABIA, 2000. No entanto, existem métodos de citologia em base líquida, nos quais o custo não é tão elevado, ficando aproximadamente igual à citologia convencional. Esses sistemas manuais não requerem aparelhos e equipamentos especializados o que diminiu o custo. Dentre esses métodos manuais destaca-se o Agar-alcoólico (MAKSEN e WEIDMANN, 2001).
HUTCHINSON et al. (1999) alertaram que o emprego clínico e o custo- benefício da citologia em base líquida estão em avaliação. Atualmente, há uma carência de evidências quanto à eficácia da citologia em base líquida devido à
falta de pesquisas na área (BROADSTOCK, 2001). Portanto, novos estudos são oportunos e devem ser conduzidos rigorosamente para verificar se a citologia em base líquida terá os mesmos resultados apontados em pesquisas anteriores (KITCHENER, 2002).
Além disso, não há evidência consistente de que a citologia em base líquida detecta mais ou menos alterações, pois recentes estudos demonstraram que não há diferenças estatísticas significativas de diagnósticos entre o ThinPrep (citologia em base líquida) e o esfregaço convencional (HERBERT e JOHNSON, 2001).
OBSWEGESER e BRACK (2001) sugeriram que a razão mais importante para o aumento nas taxas de detecção de lesões ginecológicas através da tecnologia em base líquida é a melhoria das coletas, conseguindo uma amostra mais adequada. Os resultados obtidos, removendo-se o muco e os debris celulares da superfície cervical com um swab antes da coleta, não mostraram diferença estatística em relação à sensibilidade e especificidade entre as duas técnicas, com a vantagem de a citologia convencional ter um custo menor. Portanto o maior valor no avanço da citologia em base líquida esta em forçar o clínico a usar um instrumento de coleta adequado e remover o muco e os debris celulares antes da coleta do material.
MICHAEL et al. (2001) afirmaram que a citologia em base líquida introduziu novas alterações citomorfológicas que necessitam, ainda, serem reconhecidas patologicamente.
A fixação do material é diferente da citologia convencional, criando diferenças entre discariose e células reacionais, além de remover algumas das mudanças arquiteturais usados para distinguir adenocarcinomas nos esfregaços cervicais. Também removem a justaposição de células, que nos esfregaços convencionais permitem distinguir células de diferentes tipos. Portanto a morfologia apresentada na citologia em base líquida é significativamente diferente da citologia convencional, necessitando de novos estudos para evitar as “armadilhas” que possam dificultar o diagnóstico (HERBERT e JOHNSON, 2001).
O método da citologia em base líquida automatizada exclui das lâminas elementos cujo tamanho das partículas penetram nos filtros e tipos de células, não representando todo o material que foi homogeneizado e suspenso. Desse
modo, perdem-se elementos que poderiam contribuir para o diagnóstico final (MAKSEN et al., 2001).
A citologia cervico-vaginal convencional permanece como procedimento padrão nos programas de detecção de câncer cervical na maioria dos países. Através de uma adequada preservação e preparo dos esfregaços, a citologia convencional proporcionou uma redução na prevalência e mortalidade de câncer cervical. Apesar da citologia em base líquida eliminar algumas falhas, como na fixação do material e otimizar a coloração, o seu processamento é muito complexo. E não há um estudo clínico bem controlado, randomizado que compara o sistema base líquida com a citologia convencional. Até esta evidencia estar disponivel, a citologia convencional permanecer como padrão internacional nos programas de screening de câncer cervical (BAANDRUP et al., 2000).
Um dos principais benefícios da citologia em base líquida é a avaliação do material residual através de testes auxiliares, entretanto este benefício pode ser mais aparente que real, isto porque requerem custos adicionais e alguns testes moleculares e imunológicos requerem resfriados ou congelamento do material celular, que impediria a imediata fixação alcoólica utilizada na citologia em base líquida (HERBERT e JOHNSON, 2001).
Certamente a citologia em base líquida, processado pelo ThinPrep, proporciona certas vantagens sobre a técnica convencional, como um fundo limpo, livre de células inflamatórias, permitindo uma análise mais rápida. Entretanto houve um aumento de pobreza na preservação celular, resultando em um manchamento de detalhes nucleares importantes para a interpretação dos espécimes obtidos por aspiração com agulha fina (AAF). Portanto, a utilização somente do ThinPrep reduziria o valor do diagnóstico considerando a interpretação citomorfológica de espécimes coletados por AAF, especialmente aqueles obtidos de lesões de mama e tireóide (NASUTI et al., 2001).
3.1 Objetivo Geral
Esta pesquisa teve como objetivo principal comparar a citologia em base líquida em relação à citologia convencional no diagnóstico de carcinomas bucais.
3.2 Objetivo específico
Procurou-se determinar:
• As vantagens e/ou desvantagens das duas técnicas;
• Facilidades e dificuldades na realização de ambos os testes;
• Qualidade do material coletado e das imagens microscópicas obtidas e
Este estudo faz parte da linha de pesquisa do curso de Mestrado em Odontologia, área de concentração Estomatologia da PUCPR, denominada Epidemiologia, Diagnóstico e Terapêutica. Foi realizado por meio da combinação dos métodos qualitativo e quantitativo, onde se utilizou um ensaio clínico randomizado (FREIRE e PATUSSI, 2001), cuja variável dependente foi o diagnóstico de câncer bucal e as variáveis independentes foram às técnicas citologicas convencionais e em base líquida.
Este trabalho foi submetido à apreciação e aprovação pelo Comite de Ética em Pesquisa do Hospital Erasto Gaertner (Anexo 1)
4.1. População
A população investigada neste estudo constituiu-se de indivíduos adultos, brasileiros, de ambos os sexos e portadores de neoplasia maligna bucal, atendidos no Hospital Erasto Gaertner e na Clínica de Odontologia da PUCPR.
4.2. Amostra
A amostra selecionada foi composta por 19 pacientes portadores de carcinoma bucal, com o diagnóstico confirmado pelo laudo histopatológico, os quais compareceram ao Serviço de Odontologia do Hospital Erasto Gaertner e a Clínica de Odontologia da PUCPR, no período de janeiro à agosto de 2003, e que aceitaram participar da pesquisa assinando o Termo de Consetimento Livre e Esclarecido (Apêndice 1). Porém um dos pacientes era portador de duas lesões em regiões opostas que foram tratadas individualmente, totalizando 20 amostras de neoplasias malignas de natureza epitelial.
Inicialmente os indivíduos foram submetidos a um exame clínico e os dados obtidos foram registrados numa ficha padronizada (Apêndice 2). Após este procedimento, foram realizados os exames citopatológicos. No local referente à lesão neoplásica foram coletadas amostras por meio das técnicas de citologia
esfoliativa convencional e em base líquida. Outra amostra foi obtida, na mesma região anatômica contralateral, por meio da metodologia em base líquida que serviu como amostra controle. Optou-se por realizar o controle dessa maneira, baseado nos trabalhos de OGDEN et al. (1994) e OGDEN et al. (1996a) os quais argumentavam que tanto o tecido alterado como o tecido com aspecto de normalidade foram expostos aos mesmos agentes irritantes.
Portanto, de cada indivíduo avaliado foram obtidas seis lâminas, assim distribuídas:
• 2 lâminas da citologia em base líquida da área afetada pela doença (Grupo 1 - experimental);
•
2 lâminas da citologia em base líquida da área sadia (Grupo 2 - controle); • 2 lâminas da citologia convencional da área afetada pela doença (Grupo 3 -experimental).
4.3. Procedimento de coleta
Os pacientes submetidos à citologia foram sentados e posicionados adequadamente numa cadeira odontológica para que se fizesse o exame clínico e a coleta do material. Quando possível, os indivíduos executavam um enxágüe bucal com água ou a superfície de coleta era limpa com gaze, com o objetivo de remover restos necróticos, alimentares e muco. Este procedimento nem sempre era realizado devido às condições clínicas apresentadas pelos pacientes, como dificuldade de abertura da boca, de movimentação da língua e grande destruição tecidual (lábio superior).
O procedimento para a obtenção das amostras consistiu em três etapas, citologia em base líquida, tanto da área afetada, como da área sadia e citologia convencional. A técnica citológica empregada por primeiro era escolhida de maneira aleatória e permutada, ora citologia em base líquida, ora citologia convencional, conforme JONES et al. (1994). As amostras eram coletadas em regiões diferentes da lesão, porém com características clínicas semelhantes.
4.3.1 – Coleta por meio da citologia em base líquida na área afetada
Para a coleta do material foi utilizado o kit do Sistema DNA-CITOLIQ1, denominado Universal Collection Medium (UCM). Este kit é composto por um