COMPARAÇÃO ENTRE A CITOLOGIA EM BASE-LÍQUIDA E A
CITOLOGIA CONVENCIONAL NO DIAGNÓSTICO DE
CARCINOMAS BUCAIS
CURITIBA
2003
COMPARAÇÃO ENTRE A CITOLOGIA EM BASE-LÍQUIDA E A
CITOLOGIA CONVENCIONAL NO DIAGNÓSTICO
DE CARCINOMAS BUCAIS
Dissertação apresentada ao Programa
de Pós-graduação em Odontologia da
Pontifícia Universidade Católica do
Paraná, como parte dos requisitos para
a obtenção do grau de Mestre em
Odontologia, Área de Concentração em
Estomatologia.
Orientador: Prof. Dr. Antônio Adilson
Soares de Lima
CURITIBA
2003
Campagnoli ; orientador, Antônio Adilson Soares de Lima. -- 2003. xiii, 83 f. : il. ; 30 cm
Dissertação (mestrado) – Pontifícia Universidade Católica do Paraná, Curitiba, 2003
Inclui bibliografias
1. Odontologia - Diagnóstico. 2. Câncer bucal. 3. Citologia esfoliativa.
4. Esfregaço vaginal. I. Lima, Antônio Adilson Soares de. II. Pontifícia Universidade Católica do Paraná. Programa de Pós-Graduação em Odontologia. III. Título.
CDD-20.ed. 617.6075 616.99431
EDUARDO BAUML CAMPAGNOLI
COMPARAÇÃO ENTRE A CITOLOGIA EM BASE-LÍQUIDA E A
CITOLOGIA CONVENCIONAL NO DIAGNÓSTICO DE CARCINOMAS
BUCAIS
Dissertação aprovada como requisito parcial para a obtenção do
Grau de Mestre ao Programa de Pós-Graduação em Odontologia, Área de
Concentração em Estomatologia da Pontifícia Universidade Católica do
Paraná, pela seguinte banca examinadora.
___________________________________
Prof. Dr. Antônio Adilson Soares de Lima
(Centro de Ciências Biológicas e da Saúde da PUCPR)
___________________________________
Profª Drª Maria Ângela Naval Machado
(Centro de Ciências Biológicas e da Saúde da PUCPR)
___________________________________
Profª Drª Liliane Janete Grando
(Centro de Ciências biológicas e da Saúde da UFSC)
anos em suas tarefas, mas um dia
terminam aquilo que estavam fazendo.
Então param e ficam limitados por suas
próprias paredes. A vida perde sentido
quando a construção acaba. Os que
plantam sofrem com as tempestades, as
estações e raramente descansam. Mas,
ao contrário de um edifício, o jardim
jamais pára de crescer. E, ao mesmo
tempo que exige a atenção do jardineiro,
também permite que, para ele, a vida
seja uma grande aventura”.
valores morais que foram fundamentais para que eu atingisse mais este
objetivo.
À minha família,
pelo apoio e incentivo dedicados à mim.
À Deus,
Motivo maior da nossa existência.
DEDICO.
Inicialmente agradeço a toda minha família e a minha namorada,
Karina Regalio, pelo apoio, compreensão, incentivo e carinho a mim
transmitido em todos os momentos.
Agradeço a Pontifícia Universidade Católica do Paraná (PUCPR), por
ter me proporcionado um crescimento técnico-científico e cultural, tanto
durante o Curso de Gradução, como agora, no Curso de Pós-Graduação.
Também agradeço ao Diretor do Curso de Odontologia, Prof. Monir Tacla,
ao Diretor do Programa de Pós-Graduação em Odontologia, Prof. Dr.
Sérgio Vieira e ao Coordenador do Curso de Mestrado em Odontologia,
concentração Estomatologia, Prof. Dr. Fernando Henrique Whestphalen.
Um agradecimento especial para todos os professores do Programa
de Mestrado em Odontologia, que além de serem mestres, mostraram-se
amigos. Muito obrigado a Profª. Maria Ângela Naval Machado, Profª Ana
Maria Trindade Grégio, Profª. Luciana Reis de Azevedo, Profª. Marina de
Oliveira Ribas, Profª. Beatriz Helena Sottile França, Prof. Antonio Adilson
Soares de Lima, Prof. Edvaldo Antônio Ribeiro Rosa, Prof. Paulo Henrique
Couto Souza, Prof. Dr. Wilson Denis Benato Martins e Prof. Rodrigo Nunes
Rached, por ter-me ensinado o valor do aprender, a necessidade de se
buscar, a importância das mudanças, a necessidade de recomeçar, a força
da perseverança, a tolerância e a humildade.
Agradeço ao Prof. Dr. Antônio Adilson Soares de Lima, pela
orientação recebida, fundamental para a elaboração e conclusão deste
trabalho. Sendo um exemplo de profissional, traduzidos por uma postura
ensinamentos a mim transmitido sobre bioestatística, que através de sua
paciência e dedicação pude apreender “um pouco” do tão complexo mundo
da estatística.
Meu muito obrigado ao Hospital Erasto Gaertner, principalmente ao
Dr. Laurindo Moacir Sassi e ao Dr. Ricardo L. Simette, por ter me
proporcionado a realização do trabalho nesta instituição, além disso, pelos
ensinamentos aprendidos, os quais foram de grande valia para o meu
crescimento profissional.
Aos colegas de mestrado, agradeço, pela amizade cultivada e pelos
momentos descontraídos ocorridos no decorrer do curso. Aos amigos Ana
Paula Ribeiro Braosi e Rodrigo Sandrin, verdadeiros amigos, muito
obrigado por tudo! Ao amigo Tiago Linhares de Camargo, pelo incentivo e
pela confiança depositada em mim, no início da minha carreira de docente.
Agradeço aos funcionários do Laboratório de Patologia Experimental
da PUCPR, Ana Paula e Fabiane, bem como à Elisabeth Cordeiro, por
ajudar-me no desenvolvimento desse trabalho. Agradeço também aos
funcionários Neide Reis Borges, Paula Nalepa e Flávia Roberta Reis, pela
atenção, amizade e pelos momentos de alegria compartilhados.
Enfim, agradeço a todos que de algum modo contribuíram para que
este sonho se torne realidade.
LISTA DE SIGLAS ... vii
LISTA DE FIGURAS ... viii
LISTA DE TABELAS ... x LISTA DE GRÁFICOS ... xi RESUMO ... Xii ABSTRACT ... Xiii 1 INTRODUÇÃO ... 1 2 REVISÃO DA LITERATURA ... 3 2.1 Câncer de boca ... 2.2 Citopatologia ... 2.3 Citologia esfoliativa convencional ... 2.4 Citologia em base líquida ... 3 7 9 20 3 OBJETIVO ... 29 4 METODOLOGIA ... 30 4.1 População ... 4.2 Amostra ... 4.3 Procedimento de coleta ... 4.4 Procedimento de preparo das lâminas ... 4.5 Método de análise ... 4.6 Análise estatística ... 30 30 31 33 37 39 5 RESULTADOS ... 40 6 DISCUSSÃO ... 57 7 CONCLUSÕES ... 67 REFERÊNCIAS ... 68 APÊNDICES ... 75 ANEXO ... 83 vi
% - Valores percentuais χ2 - Qui-quadrado µL - Microlitro µm - Micrômetro °C - Graus Celsius
AAF - Aspiração por agulha fina DNA - Ácido desoxirribonucléico EBV - Vírus Epstein-Barr
FDA - Food and Drug Administration GL - Grau de liberdade
HIV - Vírus da Imunodeficiência Humana HPV - Papilomavírus Humano
HSV - Vírus do Herpes Simples INCA - Instituto Nacional de Câncer
n - Amostra
p - Nível de significância
PCR - Reação em cadeia polimerase
PUCPR - Pontifícia Universidade Católica do Paraná RNA - Ácido ribonucléico
s - Desvio padrão
UCM - Universal Collection Medium x - Média aritmética
FIGURA 1 - Kit Universal Collection Medium do Sistema
DNA-Citoliq® (DIGENE) ... 32
FIGURA 2 - Coleta do material com escova citológica ... 32
FIGURA 3 - PrepGene do Sistema DNA-Citoliq® (DIGENE) ... 35
FIGURA 4 - DuoGene do Sistema DNA-Citoliq® (DIGENE) ... 35
FIGURA 5 - Homogeneização das amostras no vortex ... 36
FIGURA 6 - Dispensamento da alíquota sobre a membrana de policarbonato ... 36
FIGURA 7 - Citologia em base líquida apresentando-se com poucas células epiteliais íntegras e grande quantidade de material lisado (Papanicolaou, 100x). 43 FIGURA 8 - Predomínio de células superficiais ceratinizadas, presentes em lâminas preparadas pela citologia em base líquida (Papanicolaou, 100x) ... 43
FIGURA 9 - Citologia esfoliativa convencional exibindo grande concentração de células inflamatórias (Papanicolaou, 40x) ... 44
FIGURA 10 - Citologia esfoliativa convencional mostrando hemácias em grande quantidade (Papanicolaou, 40x) ... 44
FIGURA 11 - Citologia em base líquida exibindo uma fina camada de células intermediárias (seta menor) e superficiais (seta maior) (Papanicolaou, 200x) ... 47
FIGURA 12 - Citologia em base líquida exibindo células dispersas (Papanicolaou, 200x) ... 48
FIGURA 13 - Citologia esfoliativa convencional apresentando agrupamento celular (Papanicolaou, 100x) ... 48
FIGURA 14 - Citologia esfoliativa convencional exibindo células com pleomorfismo nuclear em meio às células inflamatórias (Papanicolaou, 400x) ... 53
FIGURA 16 - Células neoplásicas apresentando aumento de tamanho nuclear, identificadas nas lâminas da citologia em base líquida (Papanicolaou, 400x) ... 54
FIGURA 17 - Células malignas exibindo nucléolo aumentado em tamanho, observadas nas lâminas obtidas por citologia em base líquida (Papanicolaou, 400x) ... 54
FIGURA 18 - Célula maligna em divisão mitótica atípica (seta maior) e aumento de volume celular (seta menor), observadas em lâmina confeccionada por meio de citologia em base líquida (Papanicolaou, 400x) ... 55
FIGURA 19 - Células epiteliais enroladas (charuto) observadas na citologia em base líquida (Papanicolaou, 100x) .. 56
TABELA 1 Localização das neoplasias malignas analisadas -Curitiba 2003 ... 40
TABELA 2 - Comparação entre os achados histológicos e clínicos e os achados citológicos - Curitiba 2003 ... 41
TABELA 3 - Comparação das técnicas citológicas empregadas segundo as classes de Papanicolaou - Curitiba 2003... 42
TABELA 4 - Média de células superficiais anucleadas (CSA), nucleadas (CSN), intermediárias (CI), basais (CB) e atípicas (CA) presentes nos campos citológicos -Curitiba 2003 ... 45
TABELA 5 - Dipersão celular observada nos campos citológicos segundo os grupos estudados - Curitiba 2003 ... 48
TABELA 6 - Alterações celulares observadas nos campos citológicos dos diferentes grupos - Curitiba 2003 ... 50
TABELA 7 - Valores estatísticos referentes às alterações celulares observadas nos campos citológicos dos diferentes grupos - Curitiba 2003 ... 50
TABELA 8 - Percepção do desconforto entre os dispositivos de coleta da citologia em base líquida e da citologia convencional - Curitiba 2003 ... 56
GRÁFICO 1 Média do total de células nos diferentes grupos -Curitiba 2003 ... 46
GRÁFICO 2 - Média de células superficiais anucleadas, nucleadas, intermediárias, basais e atípicas presentes nos campos citológicos dos diferentes grupos - Curitiba 2003 ... 46
GRÁFICO 3 - Freqüência das alterações celulares observadas nos diferentes grupos avaliados - Curitiba 2003... 51
GRÁFICO 4 - Freqüência das alterações nucleares observadas nos diferentes grupos avaliados - Curitiba 2003... 52
e a citologia convencional no diagnóstico de carcinomas bucais. Orientador:
Prof. Dr. Antônio Adilson Soares de Lima. Curitiba: PUCPR 2003, Dissertação (Mestrado em Odontologia) Curso de Odontologia – PUCPR.
A citologia em base líquida é um aperfeiçoamento da citologia esfoliativa convencional, porém o uso desta tecnologia dentro da odontologia ainda é pequeno. Este trabalho teve por objetivo avaliar a citologia em base líquida em relação à citologia convencional, no diagnóstico do câncer bucal. Cento e duas lâminas obtidas de dezenove indivíduos portadores de carcinomas bucais foram examinadas. As amostras foram divididas em três grupos, sendo: grupo 1 -amostras de citologia em base líquida obtidas na área da lesão; grupo 2 (controle) - amostras de citologia em base líquida provenientes de tecido sadio (região anatômica contralateral) e grupo 3 - amostras de citologia esfoliativa convencional obtidas na região da lesão. Os resultados demonstraram uma diferença estatística significativa (p≤0,05) entre os grupos em relação às alterações celulares sugestivas de malignidade. As lâminas preparadas por meio da citologia em base líquida evidenciaram melhor as células epiteliais, diminuindo a quantidade de artefatos e mostrando uma matriz de fundo mais limpa. As células epiteliais encontraram-se melhor distribuídas (pouco agrupadas) e a amostra foi mais representativa. Houve uma redução de 54,6% no número de amostras insatisfatórias e um ganho de sensibilidade de 53,0% ao se utilizar esta nova metodologia. Por meio dessa nova metodologia obteve-se amostras mais homogêneas e lâminas de melhor qualidade, o que proporcionou uma redução no número de amostras insatisfatórias e um aumento de sensibilidade do exame. Logo se concluiu que a citologia em base líquida pode ser indicada como um recurso auxiliar no diagnóstico de lesões bucais, principalmente de neoplasias malignas de origem epitelial.
Palavras-chave: citologia, diagnóstico bucal, esfregaço, neoplasias bucais,
Papanicolaou, técnicas citológicas.
CAMPAGNOLI, Eduardo Bauml. Comparison between liquid-based citology
and conventional exfoliative cytology in diagnosis of oral carcinomas.
Orientador: Prof. Dr. Antônio Adilson Soares de Lima. Curitiba: PUCPR 2003, Dissertação (Mestrado em Odontologia) Curso de Odontologia – PUCPR.
Liquid-based cytology is an improvement of the conventional
exfoliative cytology, which was developed by Papanicolaou. The aim of this
research was to compare the liquid-based cytology with conventional
exfoliative cytology in oral cancer diagnosis. The whole sample consisted of
a hundred and two glass slides obtained from nineteen patients with oral
carcinoma. The samples were divided into three groups: group 1 – samples
of liquid-based cytology gotten from the lesion area, group 2 – control
samples of liquid-based cytology from healthy area and group 3 – samples
of conventional exfoliative cytology from the lesion area. The results showed
that there was a difference statistically significant (p≤0,05) between groups
in relation to cells alterations malignant suggestive. The glass slides
prepared through liquid-based cytology showed better the epithelial cells,
decreasing the amount of artifacts, when compared with conventional
cytology. The epithelial cells were best distributed (less grouped) and the
samples were more representative. Besides, there was a reduction of 54,6%
in the number of unsatisfactory glass slide and a higher rate of detection
(more sensitivity). Through this new methodology, is possible to get more
homogenous samples and more qualified glass slides. Thus, it could be
concluded that liquid-based cytology can be indicated as an auxiliary source
in the oral lesions diagnosis, mainly of oral epithelial malignant neoplasias.
Key words: exfoliative cytology, oral diagnosis, smears, oral neoplasias,
Papanicolaou, cytology technic.
No Brasil, o câncer é considerado pelo Instituto Nacional de Câncer (INCA) como um problema de saúde pública de dimensão nacional. Somente para o ano de 2003 estima-se cerca de 400.000 novos casos desta doença, destacando-se o câncer de boca, com cerca de 10.635 novos casos (BRASIL, 2003a). A prevalência do câncer de boca está aumentando mundialmente e os indivíduos estão manifestando as lesões mais precocemente (OGDEN e MACLUSKEY, 2000).
Apesar de todo o avanço científico e tecnológico da Medicina nas últimas décadas, o câncer de cabeça e pescoço permanece como uma doença desfigurante e associada a uma alta taxa de mortalidade (FORASTIERE et al., 2001). Portanto, a prevenção e o diagnóstico precoce do câncer de boca podem aumentar as chances de cura, garantindo uma melhor qualidade de vida para os pacientes (SASSI et al., 2002).
O cirurgião-dentista tem um importante papel na orientação aos pacientes sobre hábitos saudáveis (prevenção primária), na detecção de lesões e condições cancerizáveis (prevenção secundária) e no diagnóstico precoce do câncer de boca (OGDEN e MACLUSKEY, 2000).
O diagnóstico desta condição, tradicionalmente, é realizado através da interpretação histopatológica (MACLUSKEY e OGDEN, 2000). Entretanto, como o carcinoma epidermóide, o tipo mais comum de câncer de boca, é de origem epitelial, a citologia esfoliativa é um excelente recurso de diagnóstico, pois se fundamenta no estudo das células que se descamam do epitélio bucal (SUGERMAN e SAVAGE, 1996). No entanto, o uso da citologia esfoliativa na boca foi mais freqüente no período de 1955 a 1975. Desde então, houve um declínio de sua aplicação clínica devido à natureza subjetiva de sua interpretação e porque poucas células anormais eram identificadas nos esfregaços (ROMANINI, 1999). Recentemente, esta técnica vem despertando interesse em função da possibilidade de ser complementada com outras técnicas laboratoriais como a biologia molecular, a citomorfologia e a imunocitoquímica (MACLUSKEY e OGDEN, 2000).
Outro avanço na área de citopatologia foi o desenvolvimento da citologia em base líquida, a qual apresenta uma série de vantagens em relação à citologia convencional, destacando-se uma melhor evidenciação das células epiteliais,
lâminas com menor quantidade de células inflamatórias, hemácias, debris celulares e artefatos indesejáveis, uma menor sobreposição celular e uma amostra mais representativa para a leitura (DIGENE, 2002).
A citologia em base líquida consiste na imediata colocação das amostras dos escovados em frascos contendo líquidos fixadores, sendo as lâminas citológicas processadas no próprio laboratório de análise. Portanto, este tipo de citologia é um aprimoramento do teste de Papanicolaou para o estudo microscópico e identificação de lesões (DIGENE, 2002).
Essa técnica citológica chegou ao Brasil no ano de 2000 (SILVA et al., 2003) e há poucos estudos realizados na área da Estomatologia, visando o diagnóstico de lesões bucais. Há evidências na literatura que esta técnica de citologia proporciona uma redução no número de amostras insatisfatórias, as lâminas são de melhor qualidade e que há um aumento na sensibilidade do teste (HAYAMA e MIGLIARI, 2002; SILVA et al., 2003). Sendo assim, há a necessidade de realizar novas pesquisas utilizando esta nova tecnologia dentro da área estomatológica, para verificar a sua real contribuição no diagnóstico de lesões bucais.
2.1. Câncer de boca
As neoplasias, tanto benignas como malignas, são massas anormais de tecido sem função, que persistem mesmo depois de cessados os estímulos que as originaram. O termo “câncer” é uma denominação genérica usada apenas para as neoplasias malignas (COLETTA et al., 2002; BRASIL, 2003b). Este tipo de neoplasia promove um crescimento rápido e desordenado das células, sendo estas menos especializadas em suas funções e possuindo a capacidade de se desprender do tumor, invadindo os tecidos vizinhos, vasos sangüíneos e/ou linfáticos, o que gera metástases (BRASIL, 2003c).
A maioria das neoplasias malignas está relacionada direta ou indiretamente com fatores extrínsecos ou ambientais, tais como: agentes físicos, químicos e biológicos. Estes agentes modificam o ácido desoxirribonucléico (DNA), ocasionando mutações, rupturas cromossômicas, recombinações genéticas e outras alterações (COTRAN et al., 1996; ELIAS et al., 2002). O acúmulo de alterações genéticas, particularmente nos genes que regulam o crescimento, diferenciação e morte celular, a estabilidade e reparo do DNA, a imunidade celular e humoral, podem resultar em um câncer (SCULLY, 1993).
Atualmente, as neoplasias malignas representam a segunda causa de morte no Brasil (12,7%), perdendo somente para as doenças do sistema circulatório (BRASIL, 2003d). Durante o ano de 2003 estima-se que sejam diagnosticados 402.190 novos casos de câncer, sendo que 10.635 serão de câncer de boca (BRASIL, 2003a).
As neoplasias malignas bucais representam cerca de 5% do total de câncer no mundo e, no Brasil, representam o sexto tipo mais comum de câncer em indivíduos do sexo masculino e o oitavo em pessoas do sexo feminino (BRASIL, 2003a). Embora em 1993, a sua prevalência tenha sido de 9,2% de todos os tumores malignos, de acordo com os dados levantados pelo Registro Hospitalar de Câncer do Instituto Nacional de Câncer, sendo colocado em terceiro lugar como o câncer mais freqüente nos homens e quarto lugar nas mulheres (INSTITUTO NACIONAL DO CÂNCER, 2001).
O carcinoma epidermóide é o tumor maligno mais freqüente na região da cabeça e pescoço, representando cerca de 90% de todos os casos (OGDEN e
MACLUSKEY, 2000; SANDERSON e IRONSIDE, 2002; EPSTEIN et al., 2002). Outros tipos de carcinomas também podem ser encontrados nos tecidos bucais, dentre eles o carcinoma verrucoso, o carcinoma basocelular, o adenocarcinoma e o carcinoma indiferenciado (PINDBORG et al., 1997; HUNTER, 1968).
Os principais fatores de risco para o desenvolvimento de câncer de boca são: tabagismo, etilismos, radiação solar, dieta inadequada, exposição a agentes químicos, vírus oncogênicos, imunossupressão e doenças auto-imunes (NEVILLE et al., 1998; FORASTIERE et al., 2001; SASSI et al., 2002; ELIAS et al., 2002; SANDERSON e IRONSIDE, 2002; COLLETA et al., 2002 e MORAES CHAVES e CHERUBINI, 2003).
A população com maior susceptibilidade a esta condição, são indivíduos com mais de 40 anos, sendo que a prevalência está em uma razão de 3:1 para os homens em relação às mulheres, porém esta proporção vem diminuindo no decorrer dos anos (SANDERSON e IRONSIDE, 2002).
PARAJARA (1999) afirmou que a língua é o local mais acometido pelo câncer de boca, seguido pelo lábio inferior, assoalho de boca, áreas retromolares, gengiva e mucosa jugal.
O aspecto clínico do câncer de boca em estágio inicial, geralmente, apresenta uma solução de continuidade no epitélio, cujo leito pode ser necrótico, granulomatoso (áreas vermelhas intercaladas com áreas branco-leitosas) ou sangrante e sem sintomatologia. As bordas são evertidas e não se observa halo eritematoso ao redor da lesão. A infiltração das células neoplásicas nos tecidos adjacentes podem ser traduzida clinicamente por um endurecimento no tecido ao redor e na base da lesão (BIAZOLLA, 1999). Os sintomas mais típicos do câncer de boca só aparecem em estágios avançados, destacando-se a dor, o sangramento, a salivação excessiva e a dificuldade na mastigação, fala e/ou deglutição. Também pode haver emagrecimento acentuado e presença de linfoadenopatia cervical (PARAJARA, 1999).
Embora o câncer de boca, normalmente, promova uma lesão superficial que permita uma excelente oportunidade de detecção precoce, isto não ocorre devido à natureza assintomática das lesões iniciais, à carência de auto-exame bucal, erro no diagnóstico clínico e medo por parte do paciente (OGDEN et al., 1996b).
No Brasil, 60% dos tumores detectados e diagnosticados se encontram em estágios avançados (SASSI et al., 2002), o que significa um tratamento mais agressivo, uma maior morbidade e uma maior taxa de mortalidade (KAUGARS et al., 1998). A sobrevida dos pacientes tratados de câncer de boca no Hospital Erasto Gaertner (Curitiba-PR), no período de 1990 a 1992, mostrou uma sobrevida em cinco anos, independente do estadiamento clínico, de 50,1%. Essas taxas variaram de 29,0% para pacientes com estadiamento IV à 74,4% para pacientes com estadiamento I (INSTITUTO NACIONAL DO CÂNCER, 2001).
Logo, a prevenção e detecção precoce aumentam as chaces de cura, reduzindo os custos e diminuindo a morbidade (SASSI et al., 2002). Baseado neste fato, COSTA e MIGLIORATI (2001) avaliaram o tempo decorrido desde o momento que uma lesão maligna bucal foi detectada até o momento em que o paciente iniciou a terapia anti-neoplásica. Em média os pacientes aguardaram 19,3 dias para receberem o diagnóstico de câncer e após esse período mais 65,7 dias para o início da terapia, ou seja, o tempo médio decorrido entre a primeira visita e o início do tratamento foi de 84 dias. Frente a esses resultados, os autores recomendaram uma reavaliação do serviço público na área de diagnóstico, bem como na área do tratamento dessa doença.
O diagnóstico do câncer bucal está baseado (NEVILLE et al., 1998 e EPSTEIN et al., 2002), principalmente:
• No exame clínico completo, que inclui inspeção visual extra e intrabucal, palpação da lesão e estruturas anexas, bem como dos linfonodos cervicais; • No exame histopatológico, que avalia por meio da microscopia de luz as
alterações teciduais existentes, sendo este exame considerado o “padrão de ouro”.
GREENBERG (2002) concluiu, com base em sua experiência clínica, que cirurgiões-dentistas e médicos estão negligenciando lesões de câncer bucal primárias porque não dispõem de ferramentas de diagnóstico sofisticadas, mas sim porque não examinam a mucosa bucal cuidadosamente.
A inspeção da boca, associada a exames citológicos, poderia cooperar na detecção precoce de malignidade, especialmente em pacientes de risco, como os fumantes e os etilistas crônicos (BIRMAN e SUGAYA, 1999).
A citologia esfoliativa corresponde ao estudo de células descamadas da mucosa, principalmente suprabasais, por meio de microscopia de luz, onde se analisam as mudanças morfológicas e morfométricas das células (MACLUSKEY e OGDEN, 2000).
Porém, o uso dos esfregaços citológicos em lesões bucais não é muito freqüente entre os cirurgiões-dentistas. As principais razões apontadas pelos profissionais da área odontológica, que levam a não utilização desta técnica foram (KAUGARS et al., 1998):
• Carência de material no consultório; • Não familiaridade com a técnica;
• Desejo de enviar os pacientes portadores de lesões bucais para especialistas; • Receio do tratamento.
A aplicação de várias técnicas laboratoriais avançadas, como a identificação de marcadores tumorais (genes C-myc, bcl, p53, ras, entre outros), análise de DNA e RNA, a detecção da presença de antígenos (integrinas e caderinas) na superfície das células, a expressão de citoceratina (K8, K18 e K19, que estão relacionadas a malignidade) e a imunocitoquímica têm permitido a identificação e o estudo de mudanças no comportamento celular (EPSTEIN e SCULLY, 1997; MACLUSKEY e OGDEN, 2000; EPSTEIN et al., 2002 e COLETTA et al., 2002). O estudo das características celulares, através das técnicas acima citadas, poderia contribuir não somente para o diagnóstico, mas também para indicar a terapia mais apropriada (MACLUSKEY e OGDEN, 2000).
2.2. Citopatologia
A Citopatologia abrange estudos voltados à análise de um pequeno conjunto de células. Já o citodiagnóstico baseia-se na possibilidade de analisar as características das células que se descamaram das superfícies epiteliais, devido ao processo constante de renovação celular, e sugerir um diagnóstico condizente com as alterações encontradas (BIRMAN e SUGAYA, 1999).
Por muitos anos a citopatologia foi pouco valorizada pelos patologistas, porém hoje a citologia não significa apenas o exame de esfregaços, com as anormalidades sendo relutantemente confirmadas pelo patologista. A especialidade teve grandes avanços, tanto na área ginecológica e, ainda mais importante, no diagnóstico das lesões não ginecológicas (McKEE, 1997).
A citologia teve um forte impulso após Papanicolaou e Trautt publicarem, em 1943, uma monografia sobre diagnóstico de câncer uterino através de esfregaços vaginais. Estes estabeleceram a técnica de citologia como um prodecimento eficaz, o que gerou estímulos para novas investigações citológicas (SILVERMAN et al., 1958).
Depois da publicação do trabalho de Papanicolaou e Trautt, o desenvolvimento da citologia bucal começou lentamente, mas foi e é ainda hoje sujeita a muitas controvérsias (BÁNÓCZY, 1976).
KAUGARS et al. (1998) citaram historicamente que, Beale em 1860, já desenhava células malignas obtidas de esfregaços citológicos de câncer da bucofaringe, porém o uso da citologia no controle do câncer tornou-se evidente com o desenvolvimento da Coloração de Papanicolaou. O primeiro artigo publicado que relatou o uso da citologia esfoliativa em câncer de cabeça e pescoço foi no ano de 1949. Em 1967, o editorial da American Dental Association, recomendava que “a citologia esfoliativa poderia ser uma parte do exame bucal, quando o dentista detectava lesões suspeitas” e em 1968 a mesma revista afirmava “a exatidão do diagnóstico adjunto pode ter significante valia para a detecção precoce do câncer de boca”.
Os esfregaços citológicos possibilitaram a redução drástica da morbidade e mortalidade do câncer de colo uterino. Isto porque a citologia era um teste
preventivo, o qual auxiliava o clínico a detectar alterações cancerizáveis, bem como lesões malignas em estágios iniciais (KAUGARS et al., 1998).
KAUGARS et al. (1998) correlacionaram as similaridades que existem entre o câncer de colo uterino e câncer da boca ou bucofaringe:
• Ambos os locais são demilitados por epitélio pavimentoso estratificado;
• As mudanças epiteliais pré-malignas, geralmente, ocasionam hiperceratose que se manifesta clinicamente como leucoplasia;
• Geram displasias que aparecem com grande freqüência em lesões eritematosas;
• O tumor maligno mais comum é o carcinoma epidermóide.
Entretanto, a citologia esfoliativa bucal não teve o mesmo sucesso na redução da morbidade e mortalidade do câncer de boca quando comparada com câncer cervico-vaginal (KAUGARS et al., 1998; KAHN, 2001).
A citologia esfoliativa atingiu posição de destaque no meio odontológico por volta das décadas de 60 e 70, perdendo prestígio nos anos seguintes devido à sua supervalorização. Porém a técnica apresentava limitações e o seu papel era apenas indicativo e não definitivo na maior parte dos casos. Atualmente, reassume seu valor por meio da sedimentação das reais possibilidades dentro da área estomatológica, bem como frente ao desenvolvimento de técnicas quantitativas, imunocitoquímica e de biologia molecular (BIRMAN e SUGAYA, 1999).
2.3. Citologia esfoliativa convencional
GREGORI e DEBONI (1996) definiram citologia esfoliativa como a coleta e o exame de um esfregaço de células obtidas por raspagem na superfície de uma lesão, possibilitando analisar as características das células epiteliais de forma a classificar a lesão.
As células esfoliadas são coradas de acordo com o método de Papanicolaou, entretando outras técnicas de coloração podem ser utilizadas (BÁNÓCZY, 1976).
SILVERMAN, et al. (1958) e KAUGARS, et al. (1998) afirmaram que o estudo individual das células auxiliaria no diagnóstico de lesões intrabucais e indicaram a citologia esfoliativa como um método de grande praticidade. Além disso, os estudos citológicos fecharam uma lacuna que existia entre a impressão clínica e o tratamento definitivo, onde a intenção não era escolher entre biópsia ou citologia, mas a citologia em preferência ao nada.
HUNTER (1968) estudando 3.600 esfregaços bucais observou que 94% dos esfregaços exibiam características benignas, 4,5% eram suspeitos de malignidade e 1,5% possuíam células altamente sugestivas ou positivas para malignidade, com uma taxa de falso negativo de 5,5%. Através deste estudo, detectaram-se 34 casos de carcinoma epidermóide que foram posteriormente confirmados por biópsia. Somente três lesões possuíam aspecto clínico condizente com malignidade, portanto nos casos em que câncer bucal não foi diagnosticado clinicamente a citologia promoveu sua detecção precoce.
RAMAESH et al. (1998) compararam os esfregaços citológicos, de 91 pacientes com leucoplasia e 56 pacientes portadores de carcinoma epidermóide com os achados histopatológicos e concluíram que a citologia esfoliativa é um valioso método de diagnóstico para lesões bucais cancerizáveis e malignas. Isto se deve ao fato de que nos casos de leucoplasia houve uma especificidade de 100% e sensibilidade de 77%, enquanto que para os esfregaços de carcinoma epidermóide a especificidade foi de 100% e a sensibilidade de 94%.
A citologia esfoliativa pode proporcionar um diagnóstico precoce de malignidade em situações nas quais clinicamente não são sugestivas de câncer, permitindo assim o controle desses casos que teriam permanecido insuspeitos
por um longo período (BIRMAN e SUGAYA, 1999). Logo, a citopatologia poderia ser utilizada em campanhas de prevenção de câncer bucal como instrumento de triagem (ROMANINI, 1999).
2.3.1. Indicações da citologia esfoliativa
A citologia esfoliativa bucal pode ser usada com vários objetivos, entretando três principais campos são considerados importantes: no diagnóstico de doenças vesículo-bolhosas da mucosa bucal, no diagnóstico de alterações periodontais e no diagnóstico de tumores e lesões cancerizáveis. Entretanto, o principal valor científico e prático da citologia está no diagnóstico das neoplasias malignas (BÁNÓCZY, 1976).
As principais indicações para o uso da citologia esfoliativa na Odontologia, segundo SUGERMAN e SAVAGE (1996), JONES et al. (1995), KAUGARS et al. (1998), BIRMAN e SUGAYA (1999), são:
• Revisão periódica em pacientes de alto risco; • Revisão periódica de lesões bucais cancerizáveis;
• Interpretação de áreas anormais sem indicação clara de biópsia, onde apenas o exame clínico não seria suficiente para diagnóstico, mas que não sugere câncer;
• Para acompanhar a evolução de uma lesão extensa na mucosa, quando não é possível fazer suficiente número de biópsias incisionais;
• Determinar local mais adequado para biópsia, quando a lesão for extensa; • Programas de prevenção do câncer de boca;
• Controle de pacientes submetidos a tratamento cirúrgico, radioterápico e/ou quimioterápico, decorrente de lesões malignas;
• Quando a biópsia está contra-indicada devido a problemas médicos;
• Em pacientes com fobias e que se recusem a serem submetidos a uma biópsia;
• Lesões brancas, que são removidas deixando uma superfície sangrante, como por exemplo, a candidose;
• Lesões vermelhas ou eritematosas;
• Doenças de etiologia viral: gengivoestomatite herpética primária, herpes recorrente e herpes zoster;
• Doenças dermatológicas (penfigóide, pênfigo, líquen plano); • Alterações produzidas pelo consumo de fumo.
Pacientes considerados de alto risco, como fumantes e etilistas, e especialmente aqueles que já tiveram câncer ou uma lesão cancerizável, podem beneficiar-se da citologia esfoliativa. Por ser um método menos invasivo, permite que o exame seja repetido várias vezes, determinando a presença de eventual recorrência ou de novos carcinomas, confirmados posteriormente por biópsia (CZERNINSKI e MARKITZIU, 2002).
A citopatologia, através das alterações representativas do efeito citopático do Vírus Epstein-Barr (EBV), pode auxiliar no diagnóstico da leucoplasia pilosa. Alterações específicas na cromatina, inclusões intranucleares acidofílicas e presença de halo perinuclear são algumas das características identificadas em células contaminadas pelo EBV. Portanto, este método deve ser amplamente divulgado como método de escolha no diagnóstico dessa condição, deixando os métodos moleculares de identificação do EBV para os casos duvidosos (MIGLIORATI et al., 1993; BERTAZZOLI et al., 1997 e MILAGRES et al., 2003).
A citologia, por ser um procedimento de baixo custo e isento de seqüelas, pode ser utilizada em Saúde Pública com a finalidade de rastreamento de doenças endêmicas e epidêmicas que tenham manifestações bucais (GREGORI e DEBONI, 1996).
As opiniões sobre citologia esfoliativa bucal diferem de acordo com a qualificação de quem usa, o país de origem, o método empregado e a expectativa em relação à citologia. Os profissionais concordam em um ponto: “a citologia não é decisiva por ela própria, ela deve ser considerada somente como um instrumento de diagnóstico ao lado da histologia”. A possibilidade de combinação clinica, histológica e métodos citológicos nos casos de carcinoma bucal avançado, carcinoma inicial e lesões cancerizáveis devem ser consideradas (BÁNÓCZY, 1976).
Um resultado positivo pode indicar displasia, carcinoma in situ ou carcinoma infiltrativo; entretanto, isto não deve representar um diagnóstico, mas sim ser um sinal de alerta para a realização de uma biópsia no local (KAHN, 2001).
2.3.2. Limitações e contra-indicações da citologia esfoliativa
Algumas limitações da citologia esfoliativa convencional foram destacadas por KAHN (2001):
• São observadas somente células epiteliais individuais, sendo que as características patognomônicas de determinadas doenças podem não estar presentes;
• Somente células epiteliais superficiais são obtidas e as mudanças celulares patológicas podem não se estender para a superfície;
• As células não podem ser estudadas em relação ao tecido, como ocorre na análise histopatológica;
• Podem ocorrer resultados falso-positivos ou falso-negativos devido, principalmente, a erros na coleta e a distorções celulares e/ou nucleares.
O profissional que realiza a coleta da amostra deve saber escolher não somente a lesão, mas também a melhor localização, portanto deve ser levado em consideração (CZERNINSKI e MARKITZIU, 2002):
• Lesões leucoplásicas espessas podem produzir resultados falso-negativos, por causa da maior quantidade de células ceratinizadas junto com células normais dos tecidos adjacentes;
• Lesões extensas podem apresentar diferentes estágios no processo de malignidade, sendo necessária à coleta em vários pontos;
• O local a ser coletado não deve ser aquele com aparência aréas necrótica e superinfectada, mas sim em áreas adjacentes;
A citologia esfoliativa está contra-indicada nas seguintes situações (BIRMAN e SUGAYA, 1999 e KAHN, 2001):
• Câncer, que justificariam a indicação de uma biópsia;
• Lesões submucosas ou exofíticas de superfície lisa, pois geralmente têm origem mesenquimal;
• Lesões pigmentadas não ulceradas; • Lesões em fase de crosta e ressecadas; • Áreas hemorrágicas.
As lesões brancas, que não podem ser removidas, histologicamente mostram um epitélio pavimentoso normal, ladeado por uma espessa camada de ceratina, que pode conter células atípicas que sugiram pré-malignidade ou malignidade nas camadas mais profundas. Entretanto, como a camada de ceratina impede a esfoliação das células das camadas mais profundas, muitas vezes se torna impossível acessá-las através da citologia esfoliativa. Portanto, nesses casos, uma biópsia é o método mais adequado para o diagnóstico (JONES et al., 1995). No entanto a citologia esfoliativa apresenta uma alta eficácia na detecção de malignidade, principalmente nas leucoplasias erosivas ou ulceradas (BÁNÓCZY, 1976).
No caso de lesões pigmentadas, que aparecem como máculas ou pápulas bem definidas, a citologia esfoliativa deve ser evitada. Uma vez que a deposição excessiva de melanina ou melanócitos na camada basal do epitélio ou no tecido conjuntivo fibroso é difícil de ser observada através do exame citológico. A deposição de amálgama ou material estranho no tecido conjuntivo também pode causar lesões escurecidas que não são detectadas através da análise citológica. Ainda, as lesões pigmentadas podem ocorrer devido a processos vasculares não específicos, como por exemplo: varicoses, hemangiomas, teleangectasia (JONES et al., 1995).
A interpretação citopatológica de lesões localizadas no vemelhão dos lábios e na gengiva inserida pode ser mais difícil, pois esses locais apresentam-se mais ceratinizados e menos células são esfoliadas quando comparadas com outras áreas da mucosa bucal (BÁNÓCZY, 1976).
Segundo CZERNINSKI e MARKITZIU (2002), somente especialistas treinados, que saibam discriminar uma lesão suspeita de uma massa benigna local ou de uma desordem sistêmica é que poderiam utilizar esta técnica, de
maneira efetiva. No entanto, nenhum método substitui o exame clínico detalhado da mucosa bucal, o qual raramente é realizado pelos clínicos gerais.
2.3.3. Vantagens da técnica de citologia esfoliativa
A citologia esfoliativa é um método indolor, inócuo, barato, não cruento, seguro e de simples execução, sendo adequado para dar suporte a uma interpretação clínica que busca diferenciar as lesões intrabucais (BIRMAN e SUGAYA, 1999 e OGDEN et al., 1996a).
Esta técnica não necessita de anestesia local e/ou tópica e de sutura. O sangramento, quando presente, é mínimo (SCIUBBA, 2003; SCIUBBA, 1999).
A precisão da citologia tem sido documentada por numerosos estudos que comparam os resultados citológicos com os histopatológicos. Num levantamento de 14 estudos, realizados por 12 investigadores de diferentes centros, houve exatidão de quase 90% na identificação de atipias ou malignidades, embora a biópsia seja o exame utilizado para fechar o diagnóstico. A taxa de falso-positivo entre os estudos relacionados foi de 0,9%, chegando no máximo de 2,6% (KAUGARS et al., 1998).
O uso da citologia esfoliativa torna-se importante quando se consideram os pacientes imunologicamente comprometidos (por exemplo pacientes infectados pelo HIV), por ser um método não invasivo e não traumático. A biópsia, realizada nesses pacientes, aumentaria o risco de infecção e sangramento excessivo, principalmente nos casos de severa imunossupressão e trombocitopenia imune idiopática ou trombocitopenia resultante de medicações sistêmicas. Além disso, a citologia não expõe o profissional ao sangue contaminado com o vírus (MIGLIORATI et al., 1993; BERTAZZOLI et al., 1997).
A aplicação de técnicas quantitativas, junto com o avanço na imunocitoquímica, tem contribuído para o aperfeiçoamento da citologia, estimulando a reavaliação do seu valor no diagnóstico, principalmente do câncer bucal. Uma variedade de técnicas pode ser aplicada na rotina da citopatologia. A identificação de ceratinas, como a K8 e K19 e o perfil do material genético (DNA)
alertam para o potencial de malignidade da lesão (OGDEN et al., 1993; OGDEN et al., 1994; OGDEN et al., 1996a; OGDEN, 1997; OGDEN et al., 1997).
O uso dos marcadores biológicos, juntamento com a citologia esfoliativa, oportuniza o desenvolvimento de novas abordagens clínicas e exames laboratoriais (EPSTEIN e SCULLY, 1997).
O mais importante marcador de tumor, o gene supressor p53, pode ser identificado na citologia esfoliativa, porém este é expresso somente em 50% dos cânceres de cabeça e pescoço. Logo, a combinação de dois ou mais marcadores biológicos poderia ser necessário, para um diagnóstico com maior precisão (OGDEN, 1997; OGDEN et al., 1997).
Outro avanço na área de citologia esfoliativa é o uso de programas de computadores especializados (OralCDx) que auxiliam durante a análise dos esfregaços. O computador ajudaria na pesquisa e identificação de células anormais, que são posteriormente interpretadas por um patologista. Portanto, não é o computador, mas sim o patologista que dá o diagnóstico final (SCIUBBA, 1999; SCIUBBA, 2003; CHRISTIAN, 2002).
A citologia esfoliativa também contribui para uma melhor compreensão das aberrações genéticas nos tumores malignos. Desse modo, pode-se predizer não somente o comportamento biológico do tumor, mas a possível resposta aos tratamentos tradicionais e às novas terapias (OGDEN, 1997; OGDEN et al., 1997; OGDEN et al., 1996a; OGDEN et al., 1993; OGDEN et al., 1994).
2.3.4. Citologia esfoliativa convencional: Técnica
Durante a coleta das amostras devem ser levados em consideração a quantidade de ceratina no tecido, a quantidade de saliva, a visibilidade, a pessoa que coleta a amostra e o instrumento de coleta da amostra, pois esse fatores influenciam no resultado final (OGDEN et al., 1992).
Na citologia faz-se uma raspagem com espátula ou escova sobre a superfície da lesão e o material obtido é espalhado sobre uma lâmina de vidro. Este material é fixado imediatamente em álcool a 95° ou em uma solução álcool/éter 1:1 (GREGORI e DEBONI, 1996).
As técnicas de coloração mais empregadas são a do Papanicolau ou a do Ácido Periódico de Schiff (PAS), que permitem verificar a presença de células epiteliais malignas, doenças virais ou fúngicas (KAHN, 2001).
Em relação aos instrumentos utilizados na coleta das células, OGDEN et al. (1992) afirmaram que a espátula de madeira é um instrumento satisfatório para obtenção de esfregaço de áreas normais e/ou alteradas, sendo o instrumento mais empregado. Contudo, a espátula de madeira, bem como a espátula de metal, promovem falhas nos esfregaços, tais como: distorções nucleares, citoplasmáticas e agrupamentos celulares. Esses agrupamentos mascaram as células alteradas, além de dificultarem a ação dos corantes, o que torna a amostra inadequada para a avaliação citomorfológica. Outra desvantagem da espátula de madeira é a sua porosidade, que absorve saliva e células, dificultando a transferência do material coletado para a lâmina. Porém, tanto a espátula de metal como a de madeira, coletam mais células do que o swab de algodão.
A demora na fixação produz deteriorização celular devido à secagem ao ar, comprometendo a qualidade do esfregaço, por isso é importante a fixação imediata do material coletado. Entretanto, a secagem ao ar após a correta fixação do material, não altera significativamente os detalhes celulares (SILVERMAN et al., 1958).
Os debris de tecidos e alimentos presentes na superfície da lesão, a degeneração e a excessiva ceratinização, também comprometem a qualidade dos esfregaços. Segundo HUNTER (1968) 7% de todos os esfregaços insatisfatórios são ocasionados pelos fatores acima citados. Portanto, o autor recomendou a limpeza da área antes da coleta do material.
As células epiteliais da mucosa bucal também podem ser colhidas com o uso de escovas citológicas, as quais possuem cerdas de naylon (Cytobrush Plus). Estas escovas são giradas em contato com a mucosa bucal. Após a coleta as células são transferidas para uma lâmina de vidro e fixadas (SUGERMAN e SAVAGE, 1996).
O Cytobrush foi significativamente mais eficiente em termos de visualização do campo de célula e dispersão celular do que a espátula de madeira. Os esfregaços obtidos com o auxílio da escova foram de melhor qualidade e tiveram uma distribuição mais uniforme de células epiteliais. Além
disso, o Cytobrush permitiu a remoção de amostras em locais menos acessíveis. Devido aos resultados favoráveis obtidos, o Cytobrush foi considerado um instrumento eficaz para uso na citologia esfoliativa da mucosa bucal, porporcionando uma significativa redução nos resultados negativos e falso-positivos (JONES et al., 1994; OGDEN et al., 1992; SCIUBBA, 1999).
2.3.5. Características celulares e classes citopatológicas
A técnica de coloração por Papanicolaou permite diferenciar as células epiteliais de acordo com o grau de ceratinização apresentado pelas mesmas. Isto ocorre devido à afinidade dos corantes (verde claro-EA36, hematoxilina e Orange G) com os constituintes citoplasmáticos, por exemplo, a ceratina. Durante a maturação das células epiteliais ocorre um aumento na quantidade de ceratina, o que torna o citoplasma mais denso. Dessa maneira, os corantes “grandes” (EA-36) acabam penetrando apenas nos citoplasmas menos densos, presentes nas células imaturas. Enquanto que os corantes “pequenos” (Orange G e hematoxilina) são capazes de penetrar no citoplasma denso das células ceratinizadas (WILLIAMS et al., 1999).
SILVERMAN et al. (1958) e SUGERMAN e SAVAGE (1996) descreveram as principais características das células epiteliais da mucosa bucal normal, coradas através do método de Papanicolaou. As células basais apresentaram-se esféricas ou ovóides, com citoplasma corado de verde ou azul esverdeado, enquanto que o núcleo era arredondado, centralizado e basófilo (azul). Durante o processo de maturação celular o citoplasma tornava-se progressivamente transparente e o núcleo se contraía, tornando-se pequeno e picnótico. Já o citoplasma cornificado era acidófilo (corando-se em vermelho, amarelo, laranja ou marrom). As células pertencentes à camada córnea, geralmente eram anucleadas. Enquanto que as células epiteliais intermediárias eram ligeiramente alongadas ou quadriláteras, podendo exibir algum grau de contração nuclear. Células que apresentaram grande quantidade de grânulos de queratohialina dispersos no citoplasma pertenciam à camada granulosa.
McKEE (1997) descreveu as principais alterações celulares como degenerativas, inflamatórias, reparadoras e neoplásicas. Nas alterações celulares degenerativas ocorre um aumento no tamanho da célula, o limite nuclear fica nitidamente enrugado e o núcleo torna-se picnótico. Também pode haver a presença de cariorrexe (desintegração do núcleo) e cariólise (dissolução do núcleo). Já nas alterações inflamatórias há um aumento do núcleo (hipertrofia nuclear), marginalização da cromatina, bi ou multi-nucleação, presença de halo perinuclear e vacuolização do citoplasma (vacúolos isolados ou vacuolização em colméia). Quando as células apresentam núcleo hipertrófico, multinucleação com nucléolos proeminentes e células em folhetos o tecido encontra-se em processo de reparo. As células neoplásicas exibem uma hipertrofia nuclear, uma irregularidade e hipercromasia; além da presença de grumos de cromatina.
BIRMAN e SUGAYA (1999) citaram as alterações celulares mais importantes observadas nas citologias esfoliativas, dentre elas: anisocitose, vacuolização, propriedade alterada dos corantes, inclusões citoplasmáticas e polimorfismo. Dentre as alterações nucleares destacaram: hipercromatismo, hipo ou policromia, irregularidades da membrana, multinucleação, figuras mitóticas aberrantes e alterações degenerativas. Células esfoliadas de lesões ocasionadas por irritação crônica mostram um predomínio de células ceratinizadas, em contra partida, em áreas de ulceração profunda há um maior número de células imaturas.
As células de lesões malignas intrabucais apresentam as seguintes características: aumento nuclear, variação no tamanho e forma do núcleo, aumento na razão núcleo/citoplasma, nucléolos múltiplos e predominantes, hipercromatismo, anormalidade na cromatina e distribuição e discrepância na maturação das células (SILVERMAN et al., 1958).
Outras características dos esfregaços de lesões cancerizáveis e carcinomas da mucosa bucal apontadas por SUGERMAN e SAVAGE (1996) e REMMERBACH et al. (2001), são:
• Aumento da ceratinização (vermelho, laranja ou marron); • Aumento da área nuclear;
• Alteração da relação núcleo:citoplasma; • Hipercromatismo nuclear;
• Pleomorfismo nuclear; • Agrupamento da cromatina;
• Irregular distribuição da cromatina.
OGDEN et al. (1996) demonstraram que a citologia esfoliativa é escassa em amostras de células da camada basal, quando o epitélio bucal está intacto. Isto indica que a técnica de citologia não remove células das camadas mais profundas do epitélio, como as células de lâmina basal. Porém a carência de células basais em esfregaços não necessariamente reflete pobreza da técnica.
Outros achados que são sugestivos de malignidade encontrados nos aglomerados celulares foram destacados por CARVALHO (1995) e ROMANINI (1999):
• Aglomerados celulares com pleomorfismo e anisocariose, onde se pode observar acentuada variação de forma e volume nuclear;
• Arranjo irregular das células, devido à perda de polaridade as células em agregados podem estar empilhadas ou arranjadas irregularmente;
• Aspecto de células com inclusões e células aos pares, isto pode ser explicado pelo fato de haver perda de inibição pelo contato ou que, em função de mitose anômalas, a separação incompleta seria a causa da inclusão. Células pares são duas células aderidas entre si, em alguma porção da membrana celular, sendo originadas pela separação incompleta durante a mitose.
Baseado no trabalho clássico de Papanicolau, o material colhido por raspagem de uma lesão pode ser classificado em (ROMANINI, 1999; SILVA, 1997; ROCHA, 2000):
• Classe 0: material inadequado ou insuficiente para análise; • Classe I: esfregaço com células normais;
• Classe II: esfregaço normal com alterações inflamatórias;
• Classe III: esfregaço sugestivo, mas não conclusivo de malignidade; • Classe IV: presença de células fortemente sugestivas de malignidade; • Classe V: citologia conclusiva de malignidade.
2.4. Citologia em base líquida
A citologia em base líquida pode ser considerada como um esforço para tornar o preparo citológico mais representativo. Este sistema foi desenhado para melhorar tanto a coleta das amostras como a citopreparação, quando comparado com a técnica de citologia esfoliativa convencional. As lâminas são preparadas através de equipamentos próprios, os quais apresentam um dispositivo de filtro, o que reduz o número de artefatos e produz uma fina camada de células (HUTCHINSON et al., 1999; LINDER, 1998).
Este novo método de citologia reduz os principais erros metodológicos relacionado à citologia esfoliativa convencional, tais como (MERLIN, 2002):
• Falta de representatividade celular no esfregaço, causado por uma coleta pobre e/ou inadequada;
• Artefatos ou distorções morfológicas resultantes da má fixação, principalmente quando esta não ocorre imediatamente após a coleta;
• Distribuição não randomizada das células no esfregaço;
• Presença de aglomerados celulares, muitas vezes tornando o esfregaço muito espesso;
• Grande quantidade de células sangüíneas e debris que podem obscurecer o esfregaço;
• Células importantes na avaliação da malignidade que podem não ter sido tranferidas para a lâmina, permanecendo no instrumento de coleta.
Essas falhas representam aproximadamente dois terços dos resultados falso-negativos dos esfregaços cervico-vaginais convencionais, uma vez que a amostra torna-se inadequada para análise.
A citologia em base líquida tem como finalidade obter uma camada de células mais fina e representativa. Isto se deve ao fato das células serem primeiramente suspensas na solução fixadora. Com isso há uma melhora na sensibilidade e a especificidade dos esfregaços (BROADSTOCK, 2001; BAANDRUP et al., 2000; LINDER, 1998).
Porém a citologia em base-líquida não tem se apresentado como substituta do preparado convencional, mas sim, como um aprimoramento do exame de Papanicolaou. Idealmente, este procedimento não deve alterar a essência do
estudo citomorfológico, baseado em critérios há muito conhecidos dos citopatologistas (DIGENE, 2002).
Esta tecnologia foi aprovada, em maio de 1996, para uso em citologia ginecológica pelo FDA (United States Food and Drug Administration), mas ainda pode ser utilizado em citologia não ginecológica, como citologia do trato urinário, trato respiratório e aspiração com agulha fina (LINDER, 1998; CARPENTER e DAVEY, 1999; MICHAEL et al., 2001; NASUTTI et al., 2001).
A técnica básica de coleta das amostras e a interpretação dos esfregaços convencionais por Papanicolaou permaneceram praticamente inalterados nos últimos ciqüenta anos, sendo que erros na interpretação e no diagnóstico são as maiores causas de falso-negativos. Portanto a citologia em base líquida tem como principal objetivo melhorar a qualidade de análise das amostras, o que representa um significantivo avanço em relação à citologia convencional (APGAR, 2001).
Segundo MICHAEL et al. (2001) os preparos de citologia em base líquida para espécimes ginecológicos e não ginecológicos estão ganhando espaço e tornando-se um método de escolha em vários laboratórios, pois a técnica produz uma camada fina de células sem serem prejudicadas pela presença de sangue ou de células inflamatórias.
A citologia em base-líquida, por sua apresentação intencionalmente mais fina e de fundo mais limpo que o preparado convencional, ganhou dois sinônimos bastante populares: “Citologia de monocamada” ou “Citologia de camada fina”. Como em certo números de casos a lâmina não se apresenta em monocamada e, apesar dos esforços, muitas áreas podem não se mostrar em camada fina, esses termos não refletem necessariamente o resultado final do preparado. Por isso, acredita-se que seja mais pertinente as denominações “Citologia em Amostra Líquida” ou “Citologia em Base-Líquida” (DIGENE, 2002).
2.4.1. Citologia em base líquida: técnica
Atualmente estão disponíveis no mercado várias técnicas de citologia em meio líquido, tais como: ThinPrep, TriPath, AutoCyte, Digene, Gel hidroalcoólico, Spin Thin e LiPa (BROADSTOCK, 2001; MICHAEL et al., 2001 e SILVA et al., 2003).
As células são coletadas através de escovas citológicas e em seguida introduzidas em um frasco contendo a solução preservadora evitando com isso a secagem ao ar e um comprometimento na morfologia celular. O meio usado para a fixação e preservação das células tem como base o metanol, que é ideal para preservação de DNA (FIEL-GAN et al., 1999).
Além de se enviar ao laboratório a amostra, é necessário que se informe os dados referentes à história clínica do paciente e as características clínicas da lesão, obtidas pela inspeção e palpação (BAANDRUP et al., 2000).
Nos laboratórios especializados, são depositadas pequenas quantidades da suspensão de células sob os filtros. Através dos poros dos filtros passam os debris, células vermelhas e muco, permanecendo retidas sobre a superfície as células usadas no diagnóstico. Em seguida, esses filtros são tocados sobre uma lâmina de vidro para que ocorra a transferência do material sob uma fina camada de células. Geralmente, há a formação de um círculo, medindo aproximadamente 20 mm de diâmetro (LINDER, 1998 e HUTCHINSON et al., 1999). Além das membranas de filtros, as diferenças na densidade durante o processo de centrifugação podem reduzir o conteúdo indesejado, como eritrócitos, leucócitos, debris e muco (BAANDRUP et al., 2000).
MICHAEL et al. (2001) fizeram algumas considerações sobre dois sistemas de citologia em base líquida, o ThinPrep e o TriPath. Ambas as técnicas são baseadas em amostras de base-líquida, porém diferem em metodologia, custo dos reagentes e no tempo de preparo. Além disso, cada método possui seu próprio equipamento. O sistema TriPrep é mais barato e requer menos treinamento, porém ocupa mais espaço nos laboratórios e exige mais habilidade técnica no manuseio do equipamento. Já o TriPath é mais caro e requer mais treinamento inicial, no entanto ocupa menos espaço, necessita de menos suporte técnico e de mínima habilidade no manuseio.
2.4.2. Vantagens da citologia em base líquida
Vários estudos têm mostrado que a citologia em base líquida aumentou significativamente a detecção de anormalidades cervicais, diminuiu o número de esfregaços insatisfatório, melhorou a qualidade da amostra e reduziu a probabilidade de resultados falso-negativos (LINDER, 1997; MAKSEM, 1999; CARPENTER e DAVEY, 1999; ANTON et al., 2000; PAYNE et al., 2000; WEINTRAUB e MORABIA, 2000; MONSONEGO et al., 2001).
MICHAEL et al. (2001) avaliaram 21 esfregaços não ginecológicos que foram preparados através da citologia em base líquida por dois sistemas diferentes, o ThinPrep e o TriPath. Os resultados obtidos foram os seguintes: • Ambos produziram uma uniforme dispersão celular em camada fina sem
sobreposição celular ou elementos que dificultassem a análise das células; • Em ambos o esfregaço era disperso, com densidade celular no centro menor
que a região periférica do círculo formado durante o processamento da lâmina; • Em ambos o fundo do esfregaço apresentava-se limpo, sem muco ou debris
protéicos;
• Ambos apresentaram poucas hemácias, células inflamatórias e agrupamentos celulares foram vistos;
• As características celulares comumente analisadas na citologia convencional, tais como: razão núcleo/citoplasma, pleomorfismo, hipercromasia, cromatina vesicular e a distribuição ordenada de células versus a perda de orientação, foram todas conservadas nas preparações em base líquida, em ambos os sistemas.
LINDER (1997) afirmou que a habilidade do sistema ThinPrep (citologia em base líquida) para detecar infecções e mudanças de células reativa foi equivalente ou melhor que os esfregaços de citologia convencional.
KOBAYASHI et al. (1998) afirmaram que após introduzirem o uso do método de citologia em base líquida em seus laboratórios, o número de espécimes insatisfatórios reduziu, os quais eram causados principalmente por problemas de sobreposição de hemácias e/ou artefatos gerados pela secagem ao ar, comum na citologia esfoliativa convencional.
Esta diminuição no número de amostras inadequadas ocorre por tirar a responsabilidade dos clínicos em preparar e fixar as lâminas. O preparo no laboratório promove uma distribuição mais uniforme e uma melhor fixação do material, livrando-o de exsudato inflamatório e sangue (HERBERT e JOHNSON, 2001).
Os estudos de citologia em base líquida, cujo material coletado era depositado diretamente nos frascos contendo a solução que preservava as celulares, exibiram taxas mais altas na detecção de anormalidades, com aumento na certeza do diagnóstico, em comparação aos estudos de amostra dividida. Os estudos de amostra dividida consistem na coleta da amostra e confecção imediata da lâmina (método convencional) e o remanescente da amostra coletada, que permanece no instrumento de coleta é, então, depositado no frasco que contem a solução preservadora (citologia em base líquida), o que proporcionou uma redução na identificação de neoplasias malignas (MAKSEM, 1999 e MONSONEGO et al., 2001).
As lâminas preparadas por meio da técnica de citologia em base líquida podem ser lidas mais rapidamente quando comparada às lâminas convencionais (SLATER e SMITH, 2001; PAYNE et al., 2000), porém o seu preparo requer mais trabalho e um maior tempo (SLATER e SMITH, 2001).
Outra vantagem da citologia em base líquida é a possibilidade de confecção de múltiplas lâminas com apenas uma coleta realizada no paciente, devido à quantidade de líquido e células suspensas que permanecem armazenadas no interior do frasco (LINDER, 1998).
O meio líquido em que as células são conservadas também preserva a reatividade de proteínas e ácidos nucléicos, o que permite estudos de citopatologia molecular como hibridizações moleculares in situ, testes imunocitoquímicos, reação em cadeia polimerase (PCR), análise de DNA e Captura Híbrida® (DIGINE, 2002; LINDER, 1998).
A imunocitoquímica utilizada juntamente com a citologia em base líquida (ThinPrep) exibe várias vantagens, segundo DABBS et al. (1997):
• O fundo é limpo, o que permite uma interpretação mais fácil;
• Menor quantidade de anticorpos é necessária, pois a área a ser corada é menor;
• As lâminas coradas pelo método de Papanicolaou podem ser utilizadas, pois nenhuma diferença significativa na imunocoloração foi verificada quando comparando as lâminas coradas inicialmente por Papanicolaou e lâminas não coradas;
• Múltiplos anticorpos podem ser testados em uma única lâmina, através da divisão em quatro partes;
• Lâminas adicionais podem ser preparadas para outros estudos imunocitoquímicos, conforme a necessidade.
Outra abordagem recente e promissora é a análise automatizada, efetuada por métodos computadorizados que, historicamente, era deficiente no método convencinal pela sobreposição de células e número de hemácias, células inflamatórias e muco, o que dificultava a interpretação. Porém, com o método de citologia em base líquida, a análise computadorizada pode ser realizada com maior facilidade (DIGENE, 2002; LINDER, 1997).
O câncer de colo de útero está associado aos seguintes tipos de Papilomavirus Humanos (HPV) 16, 18, 31, 33, 35, 45, 50, 52 e 56. Através da citologia em base-líquida foi possível determinar a tipagem do HPV nas células remanecentes no frasco de coleta, sem a necessidade de o paciente retornar para uma segunda coleta. Isto é realizado através do processo de Caputa Híbrida, onde se detecta o DNA do vírus (HUTCHINSON et al., 1999).
A citologia em base líquida representou um importante avanço no screening da população contra o câncer cervical (WEINTRAUB e MORABIA, 2000). E, a atual estratégia para o diagnóstico em uma população de alto risco, ao câncer de colo uterino, conta com o esfregaço citológico convencional, a citologia em base líquida e possível detecção e triagem do HPV (MAKSEM, 1999).
O uso da técnica de imunocitoquímica, em esfregaços obtidos pela citologia em base líquida, permitiu que se detectasse antígenos para o Vírus do Herpes Simples (HSV), o que foi de grande valor no diagnóstico da infecção bucal causada por esse microrganismo, especialmente nos casos de lesões cujas alterações celulares não eram patognomônicas (KOBAYASHI et al., 1998).
FIEL-GAN et al. (1999) extraíram o DNA de cinco casos sugestivos, citologicamente, de infecção por HSV e concluíram que a combinação da citologia em base líquida juntamente com PCR, permitiu um diagnóstico preciso. Logo, o
uso concomitante da análise morfologica e métodos moleculares possibilitaram um ganho na sensibilidade de diagnóstico e uma diminuição na necessidade do paciente retornar para a realização de outras coletas, quando comparado com métodos tradicionais de cultura deste microrganismo e diagnóstico.
MORRISON et al. (2002) avaliaram 62 biópsias por aspiração com agulha fina (AAF) de áreas onde havia melanoma metastático. As lâminas foram preparadas de maneira convencional e através do sistema de citologia em base líquida. Os autores observaram uma maior celularidade e que a melanina estava presente com maior freqüência nas lâminas preparadas através do sistema de base líquida (82%) e sugeriram algumas explicações para tal fato, dentre elas: uma melhor preservação das células coletadas e a diminuição da matriz de fundo ou outros elementos que dificultavam a interpretação.
HAYAMA e MIGLIARI (2002) afirmaram que a citologia em base líquida proporcionou um preparo de melhor qualidade, sendo indicada como ferramenta auxiliar no diagnóstico das lesões bucais.
2.4.3. Desvantagens da citologia em base líquida
Apesar de todos os benefícios da citologia em base líquida, esta é uma tecnologia cara em termos de equipamentos, custo capital, manutenção, treinamento, tempo de preparação técnica, transporte e disposição de meio líquido (HERBERT e JOHNSON, 2001). Os custos da citologia em base líquida são duas vezes maiores que os custos da citologia convencional, segundo MONTZ et al., 2001 e WEINTRAUB e MORABIA, 2000. No entanto, existem métodos de citologia em base líquida, nos quais o custo não é tão elevado, ficando aproximadamente igual à citologia convencional. Esses sistemas manuais não requerem aparelhos e equipamentos especializados o que diminiu o custo. Dentre esses métodos manuais destaca-se o Agar-alcoólico (MAKSEN e WEIDMANN, 2001).
HUTCHINSON et al. (1999) alertaram que o emprego clínico e o custo-benefício da citologia em base líquida estão em avaliação. Atualmente, há uma carência de evidências quanto à eficácia da citologia em base líquida devido à
falta de pesquisas na área (BROADSTOCK, 2001). Portanto, novos estudos são oportunos e devem ser conduzidos rigorosamente para verificar se a citologia em base líquida terá os mesmos resultados apontados em pesquisas anteriores (KITCHENER, 2002).
Além disso, não há evidência consistente de que a citologia em base líquida detecta mais ou menos alterações, pois recentes estudos demonstraram que não há diferenças estatísticas significativas de diagnósticos entre o ThinPrep (citologia em base líquida) e o esfregaço convencional (HERBERT e JOHNSON, 2001).
OBSWEGESER e BRACK (2001) sugeriram que a razão mais importante para o aumento nas taxas de detecção de lesões ginecológicas através da tecnologia em base líquida é a melhoria das coletas, conseguindo uma amostra mais adequada. Os resultados obtidos, removendo-se o muco e os debris celulares da superfície cervical com um swab antes da coleta, não mostraram diferença estatística em relação à sensibilidade e especificidade entre as duas técnicas, com a vantagem de a citologia convencional ter um custo menor. Portanto o maior valor no avanço da citologia em base líquida esta em forçar o clínico a usar um instrumento de coleta adequado e remover o muco e os debris celulares antes da coleta do material.
MICHAEL et al. (2001) afirmaram que a citologia em base líquida introduziu novas alterações citomorfológicas que necessitam, ainda, serem reconhecidas patologicamente.
A fixação do material é diferente da citologia convencional, criando diferenças entre discariose e células reacionais, além de remover algumas das mudanças arquiteturais usados para distinguir adenocarcinomas nos esfregaços cervicais. Também removem a justaposição de células, que nos esfregaços convencionais permitem distinguir células de diferentes tipos. Portanto a morfologia apresentada na citologia em base líquida é significativamente diferente da citologia convencional, necessitando de novos estudos para evitar as “armadilhas” que possam dificultar o diagnóstico (HERBERT e JOHNSON, 2001).
O método da citologia em base líquida automatizada exclui das lâminas elementos cujo tamanho das partículas penetram nos filtros e tipos de células, não representando todo o material que foi homogeneizado e suspenso. Desse
