Citral

O Citral (3,7-dimetil-2,6-octadienal) é uma mistura de dois monoterpenos aldeídos acíclicos isômeros geométricos - geranial (trans-citral ou citral A) e neral (cis-citral ou citral B) (Figura 7) (SADDIQ, KHAYYAT, 2010).

Figura 7 _{– Estrutura química do cis- e trans-citral}

Geranial (trans-citral) Neral (cis-citral) Fonte: MANGPRAYOOL, SAJEERA, NUANNOI, 2013.

Como um monoterpeno acíclico natural, o citral pode ser encontrado nos óleos de diversas plantas aromáticas, empregadas na medicina popular como as espécies de Cymbopogon citratus (KUMAR et al., 2013), Melissa officinalis, (MENEZES et al., 2015), Lippia Alba (STASHENKO et al., 2014), Zingiber officinale (FASS et a., 2014).

Têm sido relatados inúmeros efeitos farmacológicos, em especial importantes atividades antimicrobianas, contra Escherichia coli (SOMOLINOS et al., 2009; BELDA-GALBIS et al., 2013, SHI et al., 2016), Listeria innocua (BELDA-GALBIS et al., 2013), Staphylococcus aureus, Penicillium italicum e Rhizopus stolonifer (SADDIQ, KHAYYAT, 2010), Colletotrichum musae, Colletotrichum gloeosporioides e

Fusarium subglutinans (GARCIA et al., 2008), Penicillium digitatum (FAN et al.,

2014), Trichophyton mentagrophytes (PARK et al., 2009), Aspergillus flavus,

Aspergillus fumigatus, (LUO et al., 2004; MESA-ARANGO et al., 2009) Geotrichum citri-aurantii (ZHOU et al., 2014) e Candida spp. (FERREIRA et al., 2009; LEITE et

al., 2014; LIMA et al., 2012; SOUSA et al., 2016), atividade anti-Trypanosoma cruzi (CARDOSO, SOARES, 2010, ARMAS et al., 2016) e anti-Leishmania (MACHADO et al., 2012).

O citral é geralmente reconhecido como aditivo alimentar seguro, e foi aprovado para uso em alimentos pelo Food and Drug Administration (FDA). Além disso, o citral foi registrado por Comissão Europeia para o uso como aromatizante em alimentos porque o seu uso não apresenta risco para a saúde do consumidor

(BURT, 2004). E pode tornar-se um ingrediente antimicrobiano adequado para uso mais amplo na indústria de alimentos (SOMOLINOS et al., 2009).

Além dessas importantes atividades biológicas, estudos relatam a baixa toxicidade deste monoterpeno. Em um estudo de 24 h sobre a toxicidade aguda oral em dose única, a DL50 do óleo essencial de Cymbopogon citratus, cujo constituinte majoritário é o citral, foi cerca de 3500 mg/kg. No estudo de 21 dias de toxicidade oral de dose repetida, não foram observadas alterações significativas no peso corporal, pesos de órgãos, histologia (cérebro, coração, rins, fígado, pulmões, estômago, baço e bexiga urinária), urina ou bioquímica clínica em ratos. Da mesma forma, os dados do ensaio cometa em células de sangue periférico não mostrou qualquer efeito genotóxico (COSTA et al., 2011).

Estudos realizados por Ganev (2010) investigaram os possíveis efeitos tóxicos cumulativos do citral devido a utilização aguda, por 14 dias. Para tanto, avaliou parâmetros macroscópicos de toxicidade, como evolução do peso corporal, mortalidade, e normalidade dos órgãos (coração, pulmões, fígado, rins e fígado). Em todos os parâmetros toxicológicos analisados, o citral não demonstrou alterações quando comparado ao grupo controle.

Lima (2011) observou que o citral apresentou baixa toxicidade frente ao experimento de toxicidade aguda. Não demonstrou efeito oxidante nem antioxidante, quando testados com as hemácias humanas. Mas apresentou citoxicidade frente às células de mamíferos MDCKs (Madin-Darby canine kidney).

Portanto, o citral, considerado molécula de valor comercial, configurada ao papel de ingrediente em perfumes, produtos de higiene, cosméticos e em alimentos como flavorizantes (MARQUES et al., 2013; XIA et al., 2013); somada a sua baixa toxicidade e ao perfil ativo do qual vem sendo relatado, permite vislumbrar o seu grande potencial ao desenvolvimento de um novo medicamento com possível propriedade antifúngica e que possa ser utilizado na terapêutica de infecções fúngicas.

Apesar de muitos relatos sobre as propriedades antimicrobianas do citral, existem poucas investigações sobre a sua atividade sobre fungos dematiáceos, o modo de ação antifúngica deste monoterpeno e estudos de associação dele com antifúngicos, o que o torna um interessante alvo de estudo.

Considerando a importância das infecções fúngicas, especialmente as causadas por fungos dematiáceos, e as dificuldades no seu tratamento, bem como o

aumento da resistência aos antifúngicos, torna-se necessário o estudo de novos fármacos naturais e/ou sintéticos com propriedades antifúngicas. Neste contexto, o presente estudo se mostra de grande relevância, uma vez que pretende investigar novas alternativas terapêuticas para o tratamento de doenças fúngicas, com amplo espectro de ação, pouco tempo de uso e mínimos efeitos adversos.

4 MATERIAL E MÉTODOS

4.1 Local de Trabalho

As atividades laboratoriais propostas neste estudo foram realizadas no Laboratório de Micologia, Departamento de Ciências Farmacêuticas, Centro de Ciências da Saúde, Universidade Federal da Paraíba.

4.2 Espécies Fúngicas

Para realização dos ensaios de atividade antifúngica foram selecionadas três cepas de Cladophialophora carrionii (URM 2871, 0212, CQ02), três cepas de

Cladosporium oxysporum (URM 5234, URM 6056, URM 5412), quatro cepas de Cladosporium sphaerospermum (URM 5962, URM 5455, URM 5350, URM 6120) e

uma cepa de Cladosporium cladosporioides (INCQS 40188), sendo as cepas C.

carrionii URM 2871, C. oxysporum URM 5234, URM 6056, URM 5412 e C. sphaerospermum URM 5962, URM 5455, URM 5350, URM 6120 pertencentes à

coleção de culturas da Micoteca do Departamento de Micologia (URM), Centro de Ciências Biológicas, Universidade Federal de Pernambuco, as cepas C. carrionii 0212 e CQ02 pertencentes à coleção de culturas do Laboratório de Micologia, Departamento de Ciências Farmacêuticas, Centro de Ciências da Saúde, Universidade Federal da Paraíba. E a cepa C. cladosporioides INCQS 40188 pertencente à Coleção de Microrganismos de Referência em Vigilância Sanitária (CMRVS), Instituto Nacional de Controle de Qualidade em Saúde (INCQS), Fundação Oswaldo Cruz (FIOCRUZ).

Todas as cepas foram mantidas em Ágar Sabouraud Dextrose _{– ASD} inclinado (DIFCO Laboratories Ltda, USA) a temperatura ambiente (28 ºC) e sob refrigeração (4 ºC).

4.3 Fitoconstituíntes

Os fitoconstituíntes (citral, (-) citronelal, (+) citronelal, β-cariofileno, geraniol, linalool, β-cimeno e α-pineno) utilizados nesta pesquisa foram adquiridos da Sigma-

Aldrich® Ltda (São Paulo, SP, Brasil). Os fitoconstituintes foram testados na concentração inicial de 1024 μg/mL e solubilizados em 2 % de Tween 80 (INLAB®_{) e} dimetilsulfóxido (DMSO) (MERCK®) numa proporção de até 0,5% do volume final.

4.4 Antifúngicos sintéticos

Para o controle de avaliação da atividade antifúngica dos produtos naturais testados, foram utilizados como padrão os seguintes antifúngicos sintéticos: anfotericina B, itraconazol e voriconazol, obtidos da Sigma-Aldrich® (São Paulo-SP). As soluções foram preparadas no momento da execução dos testes, para alcance das concentrações desejadas. Os antifúngicos foram testados na concentração inicial de 1024 μg/mL e solubilizados em dimetilsulfóxido (DMSO) (MERCK®_{) numa proporção de até 0,5% do volume final.}

4.5 Meios de Cultura

Para manutenção das cepas selecionadas e realização dos ensaios de atividades biológicas foram usados o meio sólido Ágar Sabouraud Dextrose - ASD (DIFCO Laboratories Ltda, USA), o Caldo Sabouraud Dextrose – CSD (DIFCO Laboratories Ltda, USA), e o caldo RPMI-1640-L-glutamina, sem bicarbonato de sódio, adquirido da Sigma-Aldrich, São Paulo, SP, Brasil.

Os meios foram solubilizados em água destilada e esterilizados em autoclave, a 121 o_{C, 1 atm por 15 minutos, conforme orientações do fabricante.}

4.6 Inóculo

Para preparação do inóculo, as cepas fúngicas selecionadas foram mantidas no meio de cultura, por 10-14 dias, a temperatura de 28 ºC para atingirem um crescimento satisfatório. As recentes colônias fúngicas foram devidamente cobertas com 5 mL de solução salina estéril (NaCl 0,85 % p/v), e as suspensões feitas por suaves agitações e raspagens com auxílio de uma alça de platina em ―L‖. A mistura resultante de conídios e fragmentos de hifas foi retirada e transferida para tubos de

ensaio esterilizados (FERNÁNDEZ-TORRES et al., 2002; SANTOS, HAMDAN, 2005).

Em seguida, essas suspensões foram agitadas por 2 minutos com auxílio do aparelho Vortex (FANEM). Após agitação, cada suspensão teve sua turbidez comparada e ajustada àquela apresentada pela suspensão de sulfato de bário do tubo 0,5 da escala McFarland, a qual corresponde a um inóculo de aproximadamente 106 _{unidades formadoras de colônias/mL (UFC/mL). Por fim, foi} realizado contagem celular em câmara de Neubauer e as suspensões ajustadas no espectrofotômetro (Leitz-Fhotometer 340-800), para conter aproximadamente 1x106 UFC/mL. (CLEELAND, SQUIRES, 1991; HADACEK, GREGER, 2000; ODDS, 1989; SAHIN et al., 2004).

4.7 Triagem microbiológica

Para avaliação da atividade antifúngica, realizou-se uma triagem dos fitoconstituintes citral, (-)-citronelal, (+)-_{citronelal, β-caryophyllene, geraniol, linalool,} β-cymeno, α-pineno pela técnica de microdiluição em caldo, conforme metodologia descrita no item 4.9.1. O monoterpeno citral foi selecionado para dar continuidade aos estudos por apresentar melhor atividade antifúngica sobre as 11 cepas testadas.

4.8 Ensaios in silico

4.8.1 PASS online

Previsão do espectro de atividade para substâncias (PASS) online é um software projetado para avaliar o potencial biológico geral de uma molécula orgânica sobre o organismo humano. Ele fornece previsões simultâneas de muitos tipos de atividades biológicas com base na estrutura dos compostos orgânicos. O espectro de atividade biológica de um composto químico é o conjunto de diferentes tipos de atividade biológica, que refletem os resultados de interação do composto com várias entidades biológicas. Pass online dá várias facetas da ação biológica de um composto, obtendo os índices Pa (probabilidade " de ser ativo") e Pi (probabilidade "de ser inativo") estimando a categorização de um composto potencial em ser

pertencente à subclasse de compostos ativos ou inativos, respectivamente (SRINIVAS et al., 2014).